Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây máu chó trái dày knema pachycarpa và cây máu chó đá knema saxatilis

Luận án tiến sĩ hóa học phân tích nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây máu chó trái dày knema pachycarpa và cây, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm,

• Tác giả: Trần Hữu Giáp
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Văn Hùng
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của cây máu chó Knema pachycarpa và Knema saxatilis
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về chi Máu Chó (Knema)
• 1.2. Đặc điểm thực vật của chi Máu chó (Knema)
• 1.3. Một số loài máu chó đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền các nƣớc Đông Nam Á
• 1.4. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema
• 1.4.1. Nghiên cứu trong nƣớc
• 1.4.2. Nghiên cứu trên thế giới
• 1.5. Các hợp chất resorcinol
• 1.6. Các hợp chất anacardic acid
• 1.7. Các hợp chất cardanol
• 1.8. Các hợp chất acetophenone
• 1.9. Các hợp chất khác
• 1.10. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Knema
• 1.10.1. Hoạt tính chống ung thƣ
• 1.10.2. Hoạt tính liên quan đến hệ thần kinh
• 1.10.3. Độc tính trên ký sinh trùng
• 1.10.4. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
• 1.10.5. Hoạt tính chống oxy hóa
• 1.10.6. Hoạt tính kháng lao
• 1.10.7. Hoạt tính chống sốt rét
• 1.10.8. Hoạt tính liên quan đến giảm glucose máu
• 1.10.9. Hoạt tính chống viêm
• 1.11. Tác dụng ức enzyme acetylcholinesterase (AChE)
• 1.11.1. Sơ lƣợc về chứng rối loạn nhận thức
• 1.11.2. Mối liên hệ giữa chứng sa sút trí tuệ và enzyme acetylcholinesterase
• 1.11.3. Các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế AChE
• 1.12. Giới thiệu về loài máu chó trái dày và máu chó đá
• 1.12.1. Đặc điểm thực vật loài máu chó trái dày
• 1.12.2. Đặc điểm thực vật loài máu chó đá
• 2. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. MẪU THỰC VẬT
• 2.1.1. Cây máu chó trái dày
• 2.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
• 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
• 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
• 2.3. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC
• 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
• 2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR)
• 2.3.3. Phổ khối lƣợng (MS)
• 2.3.4. Phổ cộng hƣởng từ nhân (NMR)
• 2.3.5. Sắc ký khí khối phổ (GC/MS)
• 2.4. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 2.4.1. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
• 2.4.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase
• 3. CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM
• 3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI MÁU CHÓ TRÁI DÀY
• 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả
• 3.1.2. Phân lập các hợp chất từ thân cành
• 3.1.3. Phân lập các hợp chất từ lá
• 3.2. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI MÁU CHÓ ĐÁ
• 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ thân cành cây
• 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây
• 3.3. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC
• 4. CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân tích GC/MS cặn chiết n-hexan quả cây máu chó trái dày
• 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ cây máu chó trái dày
• 4.2.1. Hợp chất MC1: Knepachycarpic acid A (hợp chất mới)
• 4.2.2. Hợp chất MC2: Knepachycarpic acid B (hợp chất mới)
• 4.2.3. Hợp chất MC3: Knepachycarpanol A (hợp chất mới)
• 4.2.4. Hợp chất MC4: Knepachycarpanol B (hợp chất mới)
• 4.2.5. Hợp chất MC5: Knepachycarpasinol (hợp chất mới)
• 4.2.6. Hợp chất MC6: (+)-Pinoresinol
• 4.2.7. Hợp chất MC7: (+)-epi-Pinoresinol
• 4.2.8. Hợp chất MC8: Piperitol
• 4.2.9. Hợp chất MC9: Knepachycarpanone A (hợp chất mới)
• 4.2.10. Hợp chất MC10: Knepachycarpanone B (hợp chất mới)
• 4.2.11. Hợp chất MC11: Knepachycarpanol C (hợp chất mới)
• 4.2.12. Hợp chất MC12: Globulol
• 4.2.13. Hợp chất MC13: β-Caryolanol
• 4.2.14. Hợp chất MC14: Biochanin A
• 4.2.15. Hợp chất MC15: 5,7,3’-Trihydroxy-5’-methoxyl-isoflavone
• 4.2.16. Hợp chất MC16: Luteolin
• 4.2.17. Hợp chất MC17: Chrysoeriol
• 4.2.18. Hợp chất MC18: Naringenin
• 4.2.19. Hợp chất MC19: (+) - Catechin
• 4.2.20. Hợp chất MC20: Kaempferol-3-glucoside (Astragalin)
• 4.2.21. Hợp chất MC21: Kaempferol-3-O-rutinoside (Nicotiflorine)
• 4.2.22. Hợp chất MC22: (7''R, 8''R) Hydnocarpin D
• 4.2.23. Hợp chất MC23: (7''R, 8''R) Hydnocarpin
• 4.3. Các hợp chất phân lập từ cây máu chó đá
• 4.3.1. Hợp chất MC24: Eriodictyol
• 4.3.2. Hợp chất MC25: Sulfuretin
• 4.3.3. Hợp chất MC26: (+)-Taxifolin
• 4.3.4. Hợp chất MC27: Procyanidin A1
• 4.3.5. Hợp chất MC28: Clovan-2β,9α-diol
• 4.3.6. Hợp chất MC29: (+)-Isolariciresinol
• 4.4. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 4.4.1. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ cây máu chó trái dày
• 4.4.1.1. Hoạt tính ức chế AChE
• 4.4.1.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ loài máu chó trái dày
• 4.4.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập từ loài máu chó đá
• 4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào
• 4.4.2.2. Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase
• CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Nghiên cứu hóa học

Nghiên cứu hóa học của cây máu chó Knema pachycarpa và Knema saxatilis đã chỉ ra sự phong phú của các hợp chất hóa học có giá trị. Các nghiên cứu trước đây đã xác định rằng chi Knema chứa nhiều hợp chất như resorcinol, anacardic acid, cardanol và acetophenone. Những hợp chất này không chỉ có giá trị trong y học cổ truyền mà còn có tiềm năng trong việc phát triển các loại thuốc mới. Việc phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất này được thực hiện thông qua các phương pháp sắc ký và phổ học hiện đại. Đặc biệt, các hợp chất mới như Knepachycarpic acid A và B đã được phát hiện, mở ra hướng nghiên cứu mới cho các ứng dụng trong y học. Theo một nghiên cứu, các hợp chất này có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase, một yếu tố quan trọng trong việc điều trị các bệnh liên quan đến rối loạn thần kinh.

1.1. Tính chất hóa học

Các hợp chất hóa học được phân lập từ cây máu chó cho thấy tính chất hóa học đa dạng. Các hợp chất resorcinol, ví dụ, đã được chứng minh có hoạt tính sinh học mạnh mẽ, bao gồm khả năng kháng khuẩn và chống ung thư. Hơn nữa, các hợp chất anacardic acid và cardanol cũng đã được nghiên cứu và cho thấy tiềm năng trong việc điều trị các bệnh lý khác nhau. Việc phân tích hóa học không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần của cây mà còn cung cấp cơ sở cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Các nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên trong việc phát triển y học hiện đại.

II. Hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của cây máu chó Knema pachycarpa và Knema saxatilis đã được nghiên cứu kỹ lưỡng. Các nghiên cứu cho thấy rằng các chiết xuất từ hai loài này có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase, một yếu tố quan trọng trong việc điều trị bệnh Alzheimer. Ngoài ra, các chiết xuất còn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Các thử nghiệm cho thấy dịch chiết từ quả Knema pachycarpa có khả năng ức chế 100% enzyme acetylcholinesterase ở nồng độ 10 μg/ml, trong khi dịch chiết từ lá và thân cành của Knema saxatilis cũng cho kết quả tương tự. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới cho việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc từ thiên nhiên.

2.1. Tác dụng sinh học

Tác dụng sinh học của các hợp chất từ cây máu chó không chỉ dừng lại ở việc ức chế enzyme mà còn bao gồm các hoạt tính khác như kháng khuẩn, chống viêm và chống oxy hóa. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất từ Knema có thể ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn và nấm, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên. Hơn nữa, hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất này cũng được ghi nhận, điều này có thể giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Những kết quả này không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu mà còn có thể ứng dụng trong thực tiễn, đặc biệt trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.

III. Giá trị và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về cây máu chó Knema pachycarpa và Knema saxatilis không chỉ mang lại giá trị khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn cao. Việc phát hiện các hợp chất mới và hoạt tính sinh học của chúng mở ra cơ hội cho việc phát triển các loại thuốc mới, đặc biệt trong điều trị các bệnh lý như ung thư và Alzheimer. Hơn nữa, việc sử dụng các chiết xuất tự nhiên từ cây thuốc có thể giảm thiểu tác dụng phụ so với các loại thuốc tổng hợp. Các nghiên cứu này cũng góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên, khuyến khích việc sử dụng bền vững các loài thực vật có giá trị trong y học. Điều này không chỉ có lợi cho sức khỏe cộng đồng mà còn thúc đẩy nền kinh tế địa phương thông qua việc phát triển ngành dược liệu.

3.1. Tương lai nghiên cứu

Tương lai của nghiên cứu về cây máu chó hứa hẹn sẽ mang lại nhiều khám phá mới. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định cơ chế hoạt động của các hợp chất sinh học, từ đó phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn. Hơn nữa, việc nghiên cứu các loài khác trong chi Knema cũng có thể dẫn đến việc phát hiện thêm nhiều hợp chất có giá trị. Sự kết hợp giữa nghiên cứu cơ bản và ứng dụng thực tiễn sẽ là chìa khóa để khai thác tối đa tiềm năng của các loài thực vật này trong y học hiện đại.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong bối cảnh chăm sóc sức khỏe cộng đồng và nhu cầu điều trị các bệnh nan y, thoái hóa thần kinh ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài nguyên thực vật tự nhiên đóng vai trò thiết yếu. Hướng tiếp cận chiết tách và phân lập các hoạt chất định hướng bằng các phép thử sinh học (bioassay-guided fractionation) cho phép làm sáng tỏ bản chất hóa học và dược lý của các loài cây thuốc trong thảm thực vật Việt Nam.

Chi Máu chó (Knema), thuộc họ Nhục đậu khấu (Myristicaceae), gồm hơn 80 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Úc, trong đó có khoảng hơn 60 loài tại khu vực Đông Nam Á. Các nghiên cứu hóa thực vật trên thế giới cho thấy chi Knema chứa các nhóm chất chuyển hóa thứ cấp đặc trưng như resorcinol, anacardic acid, cardanol, acetophenone, lignan, flavonoid và các dẫn xuất phenylalkylphenol. Các nhóm hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý, bao gồm ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE), gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng viêm và chống sốt rét.

Tại Việt Nam, chi Knema có 14 loài được ghi nhận. Ngoại trừ một số thông tin sơ lược về thành phần dầu béo của hạt máu chó trong tài liệu y học cổ truyền, phần lớn các loài thuộc chi này chưa được nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Trong quá trình sàng lọc hoạt tính ban đầu, dịch chiết ethyl acetate từ quả của loài Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) thể hiện khả năng ức chế 100% enzyme AChE ở nồng độ 10 µg/mL và ức chế 44% dòng tế bào ung thư biểu mô người (KB) ở nồng độ 1 µg/mL. Đồng thời, dịch chiết ethyl acetate từ lá, thân cành và quả loài Máu chó đá (Knema saxatilis) có khả năng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thư tuyến thượng thận (SW13) ở nồng độ 5 µg/mL. Xuất phát từ cơ sở thực nghiệm đó, luận án tiến hành nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật này.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Nghiên cứu làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của cây Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và cây Máu chó đá (Knema saxatilis).
2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm các chất có hoạt tính, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo.

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận án

1. Phân lập các hợp chất từ hai loài Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và Máu chó đá (Knema saxatilis) bằng các phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học hiện đại.
3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các hợp chất phân lập được.
4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Loài Máu chó trái dày (Knema pachycarpa W.de Wilde): mẫu nghiên cứu gồm quả, thân cành và lá.
  • Loài Máu chó đá (Knema saxatilis W.de Wilde): mẫu nghiên cứu gồm lá và thân cành.
• Phạm vi không gian:
  • Mẫu Knema pachycarpa được thu hái tại huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế (ngày 22/05/2015).
  • Mẫu Knema saxatilis được thu hái tại huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị (ngày 14/05/2006).
  • Mẫu tiêu bản thực vật được giám định tên khoa học bởi TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) và lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (mã số mẫu lần lượt là VN-1527 và VN-1672).
  • Thực nghiệm hóa học và thử nghiệm sinh học được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Viện Hóa hữu cơ (Viện Hàn lâm Khoa học Bulgaria).
• Phạm vi thời gian: Luận án được hoàn thành và bảo vệ năm 2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước về chi Knema

1. Tri thức y học dân gian:

   • Tại Việt Nam: Hạt máu chó (Knema corticosa) được dùng chữa ghẻ (nổi tiếng với bài thuốc ghẻ Tiên Hội ở Bắc Ninh); hạt máu chó lá nhỏ (Knema globularia) dùng chữa ghẻ, ngứa, hắc lào; hạt máu chó lưu linh (Knema erratica) được ép lấy dầu để sử dụng.
   • Tại Thái Lan: Vỏ thân cây Knema furfuracea được dùng điều trị viêm loét, mụn nhọt và ung thư; vỏ thân cây Knema globularia dùng làm thuốc bổ máu, dầu hạt dùng ngoài da.
   • Tại Malaysia, Indonesia, Singapore: Lá loài Knema glaucescens được dùng chữa bệnh dạ dày; loài Knema laurina dùng điều trị bệnh đường tiêu hóa và kháng viêm.

2. Nghiên cứu thành phần hóa học trên thế giới: Từ năm 1978 đến trước thời điểm luận án thực hiện, có 12 loài thuộc chi Knema được nghiên cứu trên thế giới (K. austrosiamensis, K. attenuata, K. elegans, K. furfuraceae, K. glauca, K. hookeriana, K. laurina, K. patentinervia, K. tenuinervia...), phân lập được tổng cộng 93 hợp chất:

   • Resorcinol (24 hợp chất): Spencer và cộng sự (1980) phân lập 10 alkyl resorcinol từ hạt K. elegans; Suwanborirux và cộng sự (1996) phân lập các acyl resorcinol từ thân K. austrosiamensis; Nor Azah và cộng sự (1993) phân lập từ K. furfuraceae; Somprasong và cộng sự (2009) phân lập từ K. glauca.
   • Anacardic acid (17 hợp chất): Được phát hiện từ K. elegans (Spencer et al., 1980), K. laurina (Ismail et al., 2011), K. hookeriana và K. cryptocaryoides (Kuo et al., 2015).
   • Cardanol (11 hợp chất): Được phân lập từ vỏ thân K. attenuata (Pawar et al., 1994), vỏ thân K. hookeriana (2000), vỏ thân K. laurina (2011) và lá K. patentinervia (2015).
   • Acetophenone (4 hợp chất): Tìm thấy trong vỏ thân K. attenuata (1994) và rễ K. elegans (Sriphana et al., 2016).
   • Flavonoid (14 hợp chất): Phân lập từ K. austrosiamensis, K. elegans, K. furfuracea, K. glauca, K. attenuata.
   • Lignan (12 hợp chất): Phân lập từ K. furfuracea, K. austrosiamensis, K. patentinervia.
   • Các hợp chất khác (11 hợp chất): Gồm dẫn xuất resveratrol (stilbene), isocoumarin, terpene (glaucaic acid, 7-megastigmene-3,6,9-triol), sterol (β-sitosterol, daucosterol) và ester.

Lớp hợp chất	Số lượng đã biết trong chi Knema	Loài tiêu biểu đã nghiên cứu
Acyl và Alkyl Resorcinol	24	K. elegans, K. austrosiamensis, K. furfuraceae, K. glauca
Anacardic acid	17	K. elegans, K. laurina, K. hookeriana, K. cryptocaryoides
Cardanol	11	K. attenuata, K. hookeriana, K. laurina, K. patentinervia
Acetophenone	4	K. attenuata, K. elegans
Flavonoid	14	K. austrosiamensis, K. elegans, K. furfuracea, K. glauca
Lignan	12	K. furfuracea, K. austrosiamensis, K. patentinervia
Stilbene, Terpene, Sterol	11	K. glauca, K. patentinervia, K. austrosiamensis

3. Nghiên cứu hoạt tính sinh học:
   • Gây độc tế bào ung thư: Pawar et al. (1994) thử nghiệm các dẫn xuất alkyl/acylphenol trên tế bào A-549, MCF-7, HT-29; Spencer et al. (2005) phát hiện (+)-myristinin A và D từ K. elegans ức chế DNA polymerase β (IC50 12 và 4,3 µM); Somprasong et al. (2009) chứng minh dodecanoylphloroglucinol từ K. glauca gây độc dòng KB, BC, NCI-H187; Zahari et al. (2015) ghi nhận các anacardic acid từ K. hookeriana gắn kết protein Bcl-xL/Bak và Mcl-1/Bid với Ki từ 0,2 đến 18 µM; Sriphana et al. (2016) công bố hoạt tính của 3-undecylphenol trên dòng KB, MCF-7 và NCI-H187.
   • Ức chế acetylcholinesterase: Ismail et al. (2011) phân lập dẫn xuất anacardic acid từ vỏ thân K. laurina ức chế mạnh AChE, tiêu biểu là 2-hydroxy-6-(10'(Z)-heptadecenyl)benzoic acid (IC50 = 0,57 µM, so với tacrine IC50 = 0,25 µM).
   • Các hoạt tính khác: Bảo vệ tế bào thần kinh SH-SY5Y khỏi tổn thương bởi H2O2 và Aβ1-42 (K. laurina), diệt ấu trùng muỗi Aedes albopictus và Anopheles stephensi (K. attenuata), kháng khuẩn Staphylococcus aureus (K. furfuraceae), chống oxy hóa dập tắt gốc DPPH (K. attenuata), kháng lao và kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (malabaricone A từ K. glauca), ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase (K. glauca), kháng viêm và giảm đau (K. attenuata).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù chi Knema có tiềm năng dược lý cao, hai loài Knema pachycarpa (Máu chó trái dày) và Knema saxatilis (Máu chó đá) là các loài thực vật phân bố tại Việt Nam hoàn toàn chưa từng được khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách phân lập, xác định cấu trúc toàn diện các hợp chất tự nhiên và đánh giá hoạt tính ức chế AChE cũng như hoạt tính gây độc tế bào của chúng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Áp dụng các nguyên lý chiết xuất phân đoạn, tách pha sắc ký để phân lập các hợp chất thứ cấp thuộc khung phenylalkylphenol (resorcinol, anacardic acid, cardanol), flavonoid, lignan và sesquiterpenoid.
• Lý thuyết phân mảnh khối phổ GC/MS của dẫn xuất silyl hóa: Phương pháp tạo dẫn xuất di-trimethylsilyl (TMS) bằng phản ứng giữa nhóm hydroxyl/carboxyl của hợp chất phenylalkylphenol với bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA). Phổ khối phân mảnh của dẫn xuất TMS đặc trưng bởi các pic ion mất gốc: $[M - 15]^+$ (mất $\cdot\text{CH}_3$), $[M - 90]^+$ (mất TMSOH), $[M - 105]^+$ (mất đồng thời $\cdot\text{CH}_3$ và TMSOH). Sự phân mảnh tại liên kết $\beta$ hoặc $\gamma$ trên mạch alkyl gắn nhân thơm tạo ra các ion chẩn đoán đặc trưng:
  • Nhóm cardanol: pic ion đặc trưng $m/z = 180$.
  • Nhóm anacardic acid: pic ion đặc trưng $m/z = 219$ (mất một nhóm TMSOH và cắt tại vị trí $\gamma$).
  • Nhóm cardol (resorcinol): pic ion đặc trưng $m/z = 268$.
• Lý thuyết sinh học thần kinh và cơ chế ức chế AChE: Enzyme acetylcholinesterase xúc tác phản ứng thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine (ACh) thành acetate và choline tại khe synap. Sự suy giảm dẫn truyền cholinergic liên quan trực tiếp đến chứng sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer. Ức chế AChE giúp duy trì nồng độ ACh, cải thiện chức năng nhận thức.

Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc

1. Phương pháp sắc ký:
   • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng pha thường DC-Alufolien 60 $F_{254}$ và pha đảo $RP_{18}$ $F_{254}$ (Merck); phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun dung dịch $H_2SO_4$ 10% rồi hơ nóng.
   • Sắc ký lớp mỏng điều chế: Bản mỏng silica gel 60G $F_{254}$ (Merck).
   • Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 0,040–0,063 mm / 240–430 mesh), pha đảo YMC RP-18 (cỡ hạt 30–50 µm) và rây phân tử Sephadex LH-20.
2. Phương pháp phổ và thiết bị xác định cấu trúc:
   • Điểm nóng chảy (Mp): Đo trên máy Thermo MEL-TEMP 3.0.
   • Độ quay cực ($[\alpha]_D$): Đo trên máy phân cực kế JASCO P-2000.
   • Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo trên máy Bruker TENSOR 37 FT-IR.
   • Phổ khối lượng: ESI-MS đo trên hệ thống Agilent 1260; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Q-TOF LC/MS.
   • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker Avance 500 MHz (chuẩn nội TMS) với các kỹ thuật 1D-NMR ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT) và 2D-NMR (HSQC, HMBC, $^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$, NOESY); dung môi sử dụng gồm $\text{DMSO-}d_6$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{CDCl}_3$.
   • Sắc ký khí khối phổ (GC/MS): Hệ thống Agilent 7890B ghép nối đầu dò khối phổ 5977A (cột mao quản HP-5MS: dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, màng phim 0,25 µm; khí mang Heli tốc độ dòng 1 mL/phút, tỷ lệ chia dòng 50:1; chương trình nhiệt 75°C đến 300°C tốc độ 5°C/phút, giữ 300°C trong 20 phút; năng lượng ion hóa 70 eV). Mẫu thử được silyl hóa bằng pyridine khan và BSTFA ở 80°C trong 20 phút.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro (phương pháp MTT):
   • Nguyên lý: Phản ứng oxy hóa khử giữa muối tetrazolium MTT màu vàng và enzyme dehydrogenase trong ty thể tế bào sống tạo tinh thể formazan màu tím. Hòa tan formazan bằng DMSO và đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Biotek.
   • Dòng tế bào thử nghiệm: Tế bào ung thư phổi người (LU-1), ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep3B, Hep G2), ung thư biểu mô (KB), ung thư cổ tử cung (HeLa) và tế bào thận khỉ (VERO).
   • Chất đối chứng dương: Ellipticine hoặc Camptothecine.
   • Nồng độ thử nghiệm: Dãy nồng độ pha loãng 1, 4, 16, 64, 128 µg/mL. Giá trị $IC_{50}$ được tính toán dựa trên % ức chế và phần mềm chuyên dụng Rawdata.
2. Hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase in vitro:
   • Thực hiện theo phương pháp đo màu của Ellman (1961).
   • Chất đối chứng dương: Tacrine.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa toàn bộ các dẫn liệu thực vật học, dược học dân gian, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Knema:

• Trình bày đặc điểm thực vật họ Myristicaceae và chi Knema (14 loài tại Việt Nam).
• Tổng thuật chi tiết 93 hợp chất tự nhiên đã biết thuộc các nhóm phenylalkylphenol (resorcinol, anacardic acid, cardanol, acetophenone), flavonoid, lignan, stilbene và terpene.
• Tổng hợp các kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học: kháng u, độc tế bào, ức chế enzyme AChE, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng lao, sốt rét và kháng viêm.
• Phân tích cơ chế bệnh sinh của chứng suy giảm nhận thức/Alzheimer, vai trò của enzyme AChE và tổng quan các lớp hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế AChE (alkaloid, terpenoid, steroid, xanthone, flavonoid, phenylalkylphenol).
• Mô tả chi tiết hình thái thực vật và phân bố địa lý của hai loài nghiên cứu: Máu chó trái dày (Knema pachycarpa W.de Wilde) và Máu chó đá (Knema saxatilis W.de Wilde).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày quy chuẩn thực nghiệm:

• Xuất xứ, địa điểm thu hái, thời gian và quy trình giám định mẫu tiêu bản Knema pachycarpa (A Lưới, Thừa Thiên Huế) và Knema saxatilis (Hướng Hóa, Quảng Trị).
• Thiết lập quy trình chiết xuất dung môi phân đoạn và các hệ sắc ký phân lập (TLC, Prep-TLC, cột silica gel pha thường, pha đảo RP-18, rây phân tử Sephadex LH-20).
• Các thông số vận hành của hệ thống thiết bị phân tích phổ (Mp, $[\alpha]_D$, IR, ESI-MS, HR-ESI-MS, NMR 500 MHz, GC/MS).
• Giao thức chuẩn thử nghiệm sinh học in vitro: phương pháp MTT xác định độc tính tế bào trên các dòng ung thư người và phương pháp Ellman đánh giá ức chế AChE.

Chương 3: Thực nghiệm

Chương 3 mô tả chi tiết quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất:

• Cây Máu chó trái dày (Knema pachycarpa):
  • Mẫu quả khô: chiết ngâm với methanol, cô cặn thu dịch chiết tổng, chiết phân bố lỏng - lỏng với n-hexan và ethyl acetate. Phân lập từ cặn n-hexan và ethyl acetate thu được các hợp chất MC1–MC11.
  • Mẫu thân cành: chiết ngấm kiệt với methanol, phân đoạn thu cặn ethyl acetate, tiến hành sắc ký cột thu được các hợp chất MC12–MC19.
  • Mẫu lá: chiết phân đoạn thu cặn n-hexan và ethyl acetate, phân lập thu được các hợp chất MC20–MC23.
• Cây Máu chó đá (Knema saxatilis):
  • Mẫu thân cành: chiết ngâm phân đoạn, phân lập từ cặn n-butanol thu được các hợp chất MC24–MC27.
  • Mẫu lá: chiết phân đoạn thu cặn ethyl acetate, phân lập sắc ký thu được các hợp chất MC28 và MC29.
• Ghi nhận đầy đủ hằng số vật lý (điểm nóng chảy, độ quay cực) và dữ liệu phổ ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, MS, HR-ESI-MS) cho toàn bộ 29 hợp chất phân lập.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 là phần nội dung trọng tâm của luận án, tập trung vào:

1. Phân tích GC/MS cặn n-hexan quả cây Máu chó trái dày: Nhận dạng thành phần hỗn hợp phenylalkylphenol thông qua phản ứng tạo dẫn xuất silyl hóa BSTFA và giải tích các mảnh ion đặc trưng ($m/z$ 180, 219, 268).
2. Xác định cấu trúc 23 hợp chất từ loài Knema pachycarpa:
   • 8 hợp chất mới:
     • MC1: Knepachycarpic acid A (dẫn xuất anacardic acid mới).
     • MC2: Knepachycarpic acid B (dẫn xuất anacardic acid mới).
     • MC3: Knepachycarpanol A (dẫn xuất phenylalkylphenol mới).
     • MC4: Knepachycarpanol B (dẫn xuất phenylalkylphenol mới).
     • MC5: Knepachycarpasinol (hợp chất mới).
     • MC9: Knepachycarpanone A (dẫn xuất phenylalkyl ketone mới).
     • MC10: Knepachycarpanone B (dẫn xuất phenylalkyl ketone mới).
     • MC11: Knepachycarpanol C (dẫn xuất phenylalkylphenol mới).
   • 15 hợp chất đã biết: (+)-Pinoresinol (MC6), (+)-epi-Pinoresinol (MC7), Piperitol (MC8), Globulol (MC12), β-Caryolanol (MC13), Biochanin A (MC14), 5,7,3’-Trihydroxy-5’-methoxyl-isoflavone (MC15), Luteolin (MC16), Chrysoeriol (MC17), Naringenin (MC18), (+)-Catechin (MC19), Kaempferol-3-glucoside / Astragalin (MC20), Kaempferol-3-O-rutinoside / Nicotiflorine (MC21), (7''R, 8''R) Hydnocarpin D (MC22), (7''R, 8''R) Hydnocarpin (MC23).

Ký hiệu	Tên hợp chất	Loại hợp chất	Bộ phận phân lập	Tình trạng cấu trúc
MC1	Knepachycarpic acid A	Anacardic acid	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC2	Knepachycarpic acid B	Anacardic acid	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC3	Knepachycarpanol A	Phenylalkylphenol	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC4	Knepachycarpanol B	Phenylalkylphenol	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC5	Knepachycarpasinol	Phenylalkylphenol	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC6	(+)-Pinoresinol	Lignan	Quả K. pachycarpa	Đã biết
MC7	(+)-epi-Pinoresinol	Lignan	Quả K. pachycarpa	Đã biết
MC8	Piperitol	Lignan	Quả K. pachycarpa	Đã biết
MC9	Knepachycarpanone A	Phenylalkyl ketone	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC10	Knepachycarpanone B	Phenylalkyl ketone	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC11	Knepachycarpanol C	Phenylalkylphenol	Quả K. pachycarpa	Hợp chất mới
MC12	Globulol	Sesquiterpenoid	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC13	β-Caryolanol	Sesquiterpenoid	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC14	Biochanin A	Isoflavonoid	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC15	5,7,3’-Trihydroxy-5’-methoxyl-isoflavone	Isoflavonoid	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC16	Luteolin	Flavone	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC17	Chrysoeriol	Flavone	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC18	Naringenin	Flavanone	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC19	(+)-Catechin	Flavan-3-ol	Thân cành K. pachycarpa	Đã biết
MC20	Kaempferol-3-glucoside (Astragalin)	Flavonol glycoside	Lá K. pachycarpa	Đã biết
MC21	Kaempferol-3-O-rutinoside (Nicotiflorine)	Flavonol glycoside	Lá K. pachycarpa	Đã biết
MC22	(7''R, 8''R) Hydnocarpin D	Flavonolignan	Lá K. pachycarpa	Đã biết
MC23	(7''R, 8''R) Hydnocarpin	Flavonolignan	Lá K. pachycarpa	Đã biết

3. Xác định cấu trúc 6 hợp chất từ loài Knema saxatilis:
   • Phân lập và làm sáng tỏ 6 hợp chất tự nhiên: Eriodictyol (MC24), Sulfuretin (MC25), (+)-Taxifolin (MC26), Procyanidin A1 (MC27), Clovan-2β,9α-diol (MC28) và (+)-Isolariciresinol (MC29).

Ký hiệu	Tên hợp chất	Loại hợp chất	Bộ phận phân lập	Tình trạng cấu trúc
MC24	Eriodictyol	Flavanone	Thân cành K. saxatilis	Đã biết
MC25	Sulfuretin	Aurone	Thân cành K. saxatilis	Đã biết
MC26	(+)-Taxifolin	Flavanonol	Thân cành K. saxatilis	Đã biết
MC27	Procyanidin A1	Proanthocyanidin	Thân cành K. saxatilis	Đã biết
MC28	Clovan-2β,9α-diol	Sesquiterpenoid	Lá K. saxatilis	Đã biết
MC29	(+)-Isolariciresinol	Lignan	Lá K. saxatilis	Đã biết

4. Kết quả thử hoạt tính sinh học:
   • Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase: Các hợp chất thuộc lớp phenylalkylphenol và anacardic acid phân lập từ loài Máu chó trái dày thể hiện hoạt tính ức chế rõ rệt trên enzyme AChE. Mạch carbon dài liên kết với nhân thơm đóng vai trò tạo tương tác kỵ nước và liên kết hydro, chui sâu vào vị trí hoạt động của enzyme.
   • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất trên các dòng tế bào ung thư người (LU-1, MCF-7, Hep G2, KB, HeLa) và tế bào lành (VERO). Các dẫn xuất phenylalkylphenol từ K. pachycarpa và một số hợp chất flavonoid từ K. saxatilis thể hiện độc tính tế bào chọn lọc ở các mức độ khác nhau.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Phát hiện hóa học mới:
   • Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu toàn diện, có hệ thống về thành phần hóa học của hai loài thực vật Knema pachycarpa W.de Wilde và Knema saxatilis W.de Wilde.
   • Từ hai loài nghiên cứu, đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 29 hợp chất tinh khiết (23 hợp chất từ K. pachycarpa và 6 hợp chất từ K. saxatilis).
   • Trong số 29 hợp chất thu được, đã phát hiện và xác định cấu trúc của 8 hợp chất mới lần đầu tiên được tìm thấy trong tự nhiên, bao gồm: Knepachycarpic acid A (MC1), Knepachycarpic acid B (MC2), Knepachycarpanol A (MC3), Knepachycarpanol B (MC4), Knepachycarpasinol (MC5), Knepachycarpanone A (MC9), Knepachycarpanone B (MC10) và Knepachycarpanol C (MC11).
   • Cung cấp tập dữ liệu phổ hoàn chỉnh (1D-NMR, 2D-NMR, HR-ESI-MS, IR, GC/MS) phục vụ công tác tra cứu cấu trúc hóa học của các lớp chất phenylalkylphenol, anacardic acid, flavonoid, lignan và sesquiterpene.
2. Đóng góp về hoạt tính sinh học:
   • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase và khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ hai loài máu chó nghiên cứu.
   • Làm rõ mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học (đặc biệt là khung phenylalkylphenol với mạch carbon dài) và hoạt tính ức chế enzyme AChE, bổ sung cơ sở khoa học cho hướng nghiên cứu các hợp chất hỗ trợ điều trị suy giảm trí nhớ và bệnh Alzheimer từ tự nhiên.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ tác giả

• Tiếp tục khảo sát, thu thập mẫu với khối lượng lớn hơn để phân lập thêm các hợp chất thứ cấp có hàm lượng vết từ các phân đoạn chưa khai thác hết.
• Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác phân tử, mô phỏng docking phân tử giữa các hợp chất mới (như knepachycarpic acid và knepachycarpanol) với trung tâm hoạt động của enzyme AChE.
• Triển khai thử nghiệm độc tính và hiệu lực ức chế AChE trên mô hình động vật thực nghiệm in vivo để đánh giá tính an toàn và khả năng ứng dụng làm tiền chất phát triển thuốc.
• Nghiên cứu tổng hợp hoặc bán tổng hợp các dẫn xuất tương tự nhằm tối ưu hóa hoạt tính sinh học và giảm độc tính đối với tế bào lành.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học (ức chế AChE và gây độc tế bào ung thư) mới dừng lại ở phạm vi sàng lọc in vitro, chưa thực hiện trên mô hình in vivo.
• Do hàm lượng của một số chất phân lập được trong mẫu thực vật còn thấp, việc đánh giá hoạt tính sinh học chưa thể thực hiện đồng thời trên toàn bộ các mô hình thử nghiệm cho tất cả 29 hợp chất.
• Chưa tiến hành phân tích sâu về động học ức chế enzyme (kinetic assay) để xác định kiểu ức chế cạnh tranh, không cạnh tranh hay hỗn hợp của các chất mới.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng nghiên cứu chiết tách trên các bộ phận khác (vỏ thân, rễ) của cây Máu chó trái dày và Máu chó đá.
• Thực hiện các nghiên cứu in vivo trên mô hình suy giảm trí nhớ ở động vật đối với các hợp chất phenylalkylphenol có hoạt tính cao.
• Nghiên cứu chuyển hóa, biến đổi cấu trúc hóa học của nhóm anacardic acid và resorcinol nhằm gia tăng độ bền sinh học và hoạt tính hướng đích.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng sử dụng

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các chuyên ngành Hóa học hữu cơ, Hóa dược, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Sinh học thực nghiệm.
• Giảng viên và nhà khoa học: Tại các viện nghiên cứu và trường đại học chuyên ngành Hóa sinh, Dược liệu, Công nghệ sinh học quan tâm đến quy trình phân lập các hợp chất chuyển hóa thứ cấp phức tạp.
• Các nhóm nghiên cứu phát triển thuốc: Quan tâm đến việc tìm kiếm các cấu trúc khung dẫn đường (lead compounds) có tác dụng ức chế enzyme AChE phục vụ định hướng điều trị bệnh thoái hóa thần kinh (Alzheimer) hoặc hợp chất kháng u.

Các phần nội dung đáng tham khảo

• Quy trình phân tích GC/MS tạo dẫn xuất silyl hóa: Phương pháp ứng dụng pyridine và BSTFA để nhận diện nhanh các hợp chất mạch dài thuộc nhóm alkylphenol, anacardic acid, cardanol trong cặn chiết thực vật.
• Hồ sơ giải tích phổ 1D và 2D-NMR của 8 hợp chất mới: Các lập luận biện giải tương tác HSQC, HMBC, $^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$ và phân mảnh khối phổ HR-ESI-MS chi tiết cho từng cấu trúc MC1, MC2, MC3, MC4, MC5, MC9, MC10, MC11.
• Quy trình thực nghiệm kết hợp sắc ký đa dạng: Phối hợp sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo RP-18 và rây phân tử Sephadex LH-20 trong tinh chế các chất phân cực và bán phân cực.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất và có bao nhiêu cấu trúc mới được công bố?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của tổng cộng 29 hợp chất tinh khiết từ hai loài thực vật. Trong đó, 23 hợp chất (MC1–MC23) được phân lập từ loài Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và 6 hợp chất (MC24–MC29) được phân lập từ loài Máu chó đá (Knema saxatilis). Có 8 hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện và công bố cấu trúc, tất cả đều từ loài Máu chó trái dày, bao gồm: Knepachycarpic acid A (MC1), Knepachycarpic acid B (MC2), Knepachycarpanol A (MC3), Knepachycarpanol B (MC4), Knepachycarpasinol (MC5), Knepachycarpanone A (MC9), Knepachycarpanone B (MC10) và Knepachycarpanol C (MC11).

2. Mẫu thực vật nghiên cứu được thu hái ở đâu và được cơ quan nào giám định?

Mẫu nghiên cứu của hai loài được thu thập tại khu vực miền Trung Việt Nam:

• Máu chó trái dày (Knema pachycarpa W.de Wilde): Thu hái ngày 22/05/2015 tại huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế bởi ThS. Đào Đình Cường.
• Máu chó đá (Knema saxatilis W.de Wilde): Thu hái ngày 14/05/2006 tại huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị bởi ThS. Đào Đình Cường. Cả hai mẫu thực vật đều được TS. Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) giám định tên khoa học chính xác và được lưu giữ tiêu bản tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với số hiệu mẫu lần lượt là VN-1527 và VN-1672.

3. Phương pháp GC/MS nhận diện các hợp chất phenylalkylphenol như thế nào?

Trước khi phân tích GC/MS, mẫu cặn chiết hoặc chất sạch được phản ứng với bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) và pyridine khan ở 80°C trong 20 phút để chuyển thành các dẫn xuất trimethylsilyl (TMS). Trên phổ khối, các dẫn xuất TMS biểu hiện các pic ion mất gốc đặc trưng gồm $[M - 15]^+$, $[M - 90]^+$, $[M - 105]^+$. Đặc biệt, các nhóm chất phenylalkylphenol được phân biệt nhờ các pic ion chẩn đoán tạo thành do phân cắt tại vị trí $\beta$ hoặc $\gamma$ trên mạch alkyl: pic $m/z = 180$ đặc trưng cho nhóm cardanol, pic $m/z = 219$ đặc trưng cho nhóm anacardic acid và pic $m/z = 268$ đặc trưng cho nhóm cardol (resorcinol).

4. Kết quả sàng lọc hoạt tính ban đầu của dịch chiết hai loài cây máu chó ghi nhận những số liệu nào?

Trong giai đoạn thử nghiệm sàng lọc định hướng ban đầu:

• Dịch chiết ethyl acetate từ mẫu quả của cây Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) thể hiện khả năng ức chế 100% hoạt tính của enzyme acetylcholinesterase ở nồng độ 10 µg/mL và ức chế 44% sự phát triển của dòng tế bào ung thư biểu mô người (KB) ở nồng độ 1 µg/mL.
• Dịch chiết ethyl acetate từ lá, thân cành và quả của cây Máu chó đá (Knema saxatilis) thể hiện khả năng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thư tuyến thượng thận (SW13) ở nồng độ 5 µg/mL.

5. Những phương pháp phân tích phổ nào được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các chất?

Luận án sử dụng phối hợp đồng bộ các phương pháp hóa lý và phổ nghiệm hiện đại:

• Đo điểm nóng chảy (Mp) trên máy Thermo MEL-TEMP 3.0.
• Đo độ quay cực ($[\alpha]_D$) trên phân cực kế JASCO P-2000.
• Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên thiết bị Bruker TENSOR 37.
• Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS trên hệ thống Agilent 1260 và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS trên máy Q-TOF LC/MS.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC, $^1H\text{-}^1H\text{ COSY}$, NOESY) đo trên máy Bruker Avance 500 MHz.
• Sắc ký khí khối phổ (GC/MS) trên hệ thống Agilent 7890B/5977A.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Trần Hữu Giáp đã hoàn thành nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật Knema pachycarpa và Knema saxatilis thuộc chi Máu chó tại Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 29 hợp chất tự nhiên, trong đó phát hiện 8 hợp chất mới có cấu trúc thuộc khung phenylalkylphenol và dẫn xuất anacardic acid. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học đã chứng minh tiềm năng ức chế enzyme acetylcholinesterase và gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này, cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học có giá trị phục vụ nghiên cứu và phát triển dược chất từ nguồn tài nguyên thiên nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khoẻ ban đầu và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới. Do đó, nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y ngày càng cao. Một trong những hƣớng nghiên cứu để giải quyết vấn đề này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc từ thiên nhiên. Trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại thuốc mới từ thực vật có hoạt tính mạnh và đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh.

Việc nghiên cứu thành phần hoá học và khảo sát hoạt tính sinh học không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả, mà trên cơ sở đó chúng ta có thể tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp các hoạt chất mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị. Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình nghiên cứu về cây thuốc của hệ thực vật Việt Nam đã có những đóng góp quan trọng vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Mô hình nghiên cứu tách chiết và phân lập hoạt chất định hƣớng bằng các phép thử sinh học nhằm tìm kiếm những chất có hoạt tính là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có tính định hƣớng cao, nhằm làm sáng tỏ bản chất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên và góp phần đƣa nhanh các kết quả nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn. Chi Máu chó (Knema) thƣờng đƣợc tìm thấy ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ châu Á, châu Phi và Châu Úc.

Một số loài thuộc chi Knema đã đƣợc sử dụng trong y học, hạt đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị bệnh liên quan đến da hoặc miệng và đau họng [5]. Chi Knema có đặc trƣng là nhựa đỏ nhƣ máu nên đƣợc gọi tên là chi Máu chó. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, chi Knema chứa các lớp chất nhƣ: acetophenone, stilbene, lignan, flavonoid, resorcinol và dẫn xuất phenylalkylphenol. Các loài thuộc chi này thể hiện nhiều hoạt tính đáng quan tâm nhƣ: kháng khuẩn, chống ung thƣ, độc tính tế bào, và ức chế enzyme acetylcholinesterase [5].

Tuy nhiên nghiên cứu về các loài thuộc chi này vẫn còn nhiều hạn chế. Ở Việt Nam, hầu hết các loài thuộc chi Máu chó chƣa đƣợc nghiên cứu, ví dụ nhƣ loài: Máu chó trái dày (Knema pachycarpa), Máu chó đá (Knema 1 luan an saxatilis).Trong quá trình sàng lọc hoạt tính các loài thực vật ở Việt Nam để tìm kiếm các hoạt chất sinh học, chúng tôi phát hiện một số loài thuộc chi Knema thể hiện hoạt tính gây độc tế bào và ức chế enzyme acetylcholinesterase cụ thể nhƣ sau: Dịch chiết ethyl acetate quả loài Máu chó trái dày (Knema pachycarpa) thể hiện khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase 100% ở nồng độ 10 μg/ml và ức chế 44% tế bào ung thƣ biểu mô (KB) ở nồng độ 1 μg/ml. Dịch chiết ethyl acetate từ lá, thân cành và quả loài Máu chó đá (Knema saxatilis) có tác dụng ức chế 100% sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ tuyến thƣợng thận (SW13) ở nồng độ 5 µg/ml [1]. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Knema ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và cây máu chó đá (Knema saxatilis)‖.

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của cây máu chó trái dày (Knema pachycarpa) và cây máu chó đá (Knema saxatilis). Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase và hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc để tìm kiếm một số chất có hoạt tính, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ 2 loài: Máu chó trái dày (Knema pachycarpa), Máu chó đá (Knema saxatilis) bằng các phƣơng pháp sắc ký.

Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa học. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các hợp chất phân lập đƣợc 4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc. 2 luan an CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu về chi Máu chó (Knema) 1. Đặc điểm thực vật của chi Máu chó (Knema) Chi Knema (Máu chó) là chi lớn thuộc họ Myristicaceae. Chi này đƣợc phân bố khắp nơi trên thế giới và nhiều nhất tại Ấn Độ, Malaysia, Trung Quốc, Việt Nam. Chi Knema có khoảng hơn 60 loài ở Đông Nam Á [5], Ở Việt Nam chi Knema gồm 14 loài [2, 3]: Knema erratica Sincl.

(Máu chó lƣu linh) Knema globularia Warb. (Máu chó cầu) Knema elegans Warb. (Máu chó thanh) Knema lenta Warb. (Máu chó thấu kính) Knema mixta de Wilde.

(Máu chó trộn) Knema pachycarpa de Wilde. (Máu chó trái dày) Knema petelotii Merr. (Máu chó Petelot) Knema pierrei Warb. (Máu chó Pierre) Knema poilanei de Wilde.

(Máu chó Poilane) Knema saxatilis de Wilde. (Máu chó đá) Knema sessiliflora de Wilde. (Máu chó hoa không cọng) Knema squamulosa de Wilde. (Máu chó vảy nhỏ) Knema tonkinensis de Wilde.

Knema corticosa Lour. (Máu chó) Mô tả thực vật: Cây to cao có thể tới hơn 10 m. Cành non có lông tơ màu hung đỏ. Lá mọc so le, có cuống, mặt trên bóng.

Hoa khác gốc, có lông mịn màu nâu nhạt. Quả hình trứng hay hình cầu, khi chín thì nhẵn, vỏ quả mỏng. Hạt có vỏ mỏng và nhẵn. Phân bố, thu hái và chế biến: Cây máu chó mọc hoang ở khắp miền rừng núi các tỉnh miền Bắc, miền Trung và miền Nam.

Vào tháng 9-10 ngƣời ta thu hoạch hạt. Quả máu chó khi còn non có màu xanh, lúc già có màu vàng, để lâu vỏ nứt làm 3 luan an 2 mảnh, phía trong có hạt. Ngƣời ta dùng nguyên cả hạt máu chó hay ép lấy dầu dùng [3]. Knema poilanei Knema mixta de wilde Hình 1.

Hình ảnh của một số loài thuộc chi Knema [1] 1. Một số loài máu chó đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền các nƣớc Đông Nam Á. Ở Việt Nam: Hạt máu chó (K.) đƣợc nhân dân ta dùng làm chữa ghẻ. Trƣớc đây làng Tiên Hội (Bắc Ninh) sản xuất một loại thuốc ghẻ nổi tiếng gọi là thuốc ghẻ Tiên Hội [3].

Hạt máu chó lá nhỏ (Knema globularia Warb.) thƣờng dùng để chữa ghẻ, ngứa, hắc lào. Dầu hạt máu chó lƣu linh (Knema erratica Sincl. Tại Thái Lan: Vỏ thân cây K. furfuraceae đƣợc sử dụng để điều trị viêm loét, mụn nhọt và bệnh ung thƣ.

Vỏ thân cây K. globularia đƣợc dùng làm thuốc bổ máu, dầu hạt dùng để chữa bệnh ngoài da [5]. Ở Indonesia, Malaysia, Singapore: Lá loài K. đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh dạ dày [5].

Ngoài ra ở Malaysia: Loài K. laurina Warb, đƣợc sử dụng để điều trị bệnh tiêu hóa và sử dụng với công dụng kháng viêm [5]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Knema 1. Nghiên cứu trong nƣớc Trong cuốn ―Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam‖, Giáo sƣ Đỗ Tất Lợi có đề cập sơ lƣợc về thành phần hóa học của loài K.: Trong hạt máu chó (K.) có 7-10% độ ẩm, 1,5-2% chất vô cơ, 24-28% chất béo, 8% prôtit, 4-5% chất đƣờng, 22-26% tinh bột, ngoài ra còn xenluloza và một số chất khác.

Dầu máu chó có màu đỏ sẫm, mùi hắc, rất nhầy, tỷ trọng ở 26oC là 0,94, chỉ số khúc xạ ở 26oC là 1,483, chỉ số axít là 90,2, chỉ số xà phòng là 196,1, chỉ số Iốt 59,55, phần không xà phòng hóa đƣợc là 1,14%, Trong phần không xà phòng hóa đƣợc có phytosterol và lecxitin [3]. Ngoài ra hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học về chi Knema đƣợc báo cáo. Nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu từ năm 1978 cho đến nay cho thấy có 12 loài thuộc chi Knema đã đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm: K. Các lớp chất đƣợc tìm thấy trong chi này bao gồm resorcinol, anacardic acid, cardanol, acetophenone, stilbene, lignan, flavonoid, và một số hợp chất khác [5].

Các hợp chất resorcinol Các hợp chất resorcinol đƣợc tìm thấy ở các loài: K. austrosiamensis de Wilde. Nghiên cứu đầu tiên đƣợc tiến hành từ năm 1980, khi các nhà khoa học Mỹ xác định thành phần hóa học từ dầu hạt loài K. Qua nghiên cứu các nhà khoa học đã xác định đƣợc 10 hợp chất thuộc nhóm alkyl resorcinol (15-24) [6].

Những năm tiếp theo nhóm acyl resorcinol đƣợc tìm thấy ở các loài: thân loài K. austrosiamensis de Wilde ở Thái Lan năm 1996 [7], lá loài K. furfuraceae Warb ở Malaysia năm 1993 [8]; quả, thân và lá loài K. glauca Warb ở Thái Lan năm 2009 [9].

Lớp chất resorcinol là một trong những lớp chất chính của 5 luan an chi Knema, thƣờng đƣợc tìm thấy ở quả, thân các loài thuộc chi Knema dƣới dạng dầu. Lớp chất resorcinol cũng đƣợc tìm thấy với hàm lƣợng lớn trong vỏ hạt điều [10]. Cho đến nay, có 24 hợp chất resorcinol (1-24) trong đó có 14 hợp chất acyl resorcinol và 10 hợp chất alkyl resorcinol đƣợc công bố từ chi Knema (xem bảng 1. Các hợp chất resorcinol từ chi Knema Acyl resorcinol KH Tên chất Loài TLTK 1-(2,6-Dihydroxyphenyl) K.

austrosiamensis de Wilde. austrosiamensis de Wilde. 7 oxotetradecyl)benzene 1,3-Dihydroxy-2-(1'- 3 K. austrosiamensis de Wilde.

austrosiamensis de Wilde 7, 11 4 Dodecanoylphloroglucinol K. austrosiamensis de Wilde. 7 oxodecyl)benzene 1,3,5-Trihydroxy-2-(1'- 6 K. austrosiamensis de Wilde., austrosiamensis de Wilde.

austrosiamensis de Wilde. 11 phenylnonan-l-one 9 Knerachelin A K. austrosiamensis de Wilde 7 tetradecan-1-one (7) (Z)-1-(2,4,6- 14 Trihydroxyphenyl)tetradecen-l- K. austrosiamensis de Wilde 7 one 6 luan an Alkyl resorcinol 15 5-Undecylresorcinol K.

6 enyl)benzene 1,3-Dihydroxy-5-(pentadec-10Z- 19 K. 6 enyl)benzene 1,3-Dihydroxy-5-(heptadec-10Z- 20 K. 6 enyl)benzene 1,3-Dihydroxy-5-(heptadec-12Z- 21 K. 7 enyl)benzene Các hợp chất acyl resorcinol Các hợp chất alkyl resorcinol Hình 1.

Cấu trúc các hợp chất resorcinol từ chi Knema 7 luan an 1. Các hợp chất anacardic acid Nhóm chất anacardic acid xuất hiện khá phổ biến trong chi Knema, cho đến nay có 17 dẫn chất anacardic acid đƣợc phân lập từ 7 loài thuộc chi Knema (xem Bảng 1. Cùng với lớp chất resorcinol có trong dầu hạt loài K. elegans Warb, các nhà khoa học Mỹ còn phát hiện ra các dẫn chất của anacardic acid [6].

Năm 2011 các nhà khoa học Malaysia khi nghiên cứu vỏ thân loài K. laurina đã phát hiện ra nhóm anacardic acid là nhóm chất có khả năng ức chế ức chế tốt enzyme acetylcholinesterase, một enzyme có liên quan đến việc điều trị bệnh Alzheimer [13]. Lớp chất này còn đƣợc tìm thấy trong loài Ginkgo biloba (họ Bạch quả) [14], loài đƣợc sử dụng rộng rãi làm thực phẩm chức năng hỗ trợ trí não. Các hợp chất anacardic acid từ chi Knema KH Tên chất Loài TLTK 2-Hydroxy-6-(8Z-pentadecenyl)- K.

13 enyl)benzoic acid 2-Hydroxy-6-(10'(Z)- 27 K. 13 heptadecenyl)benzoic acid 2-Hydroxy-6-(12'(Z)- 28 K.