Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ: “Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học của ba loài thực vật ngập mặn vùng ven biển Việt Nam: Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) và Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)” thuộc chuyên ngành Hóa học (hướng Hóa học các hợp chất thiên nhiên). Luận án được thực hiện nhằm giải quyết các yêu cầu thực tiễn về việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên thực vật biển nhiệt đới.

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2015) được tác giả dẫn lại, Việt Nam đứng thứ hai trên bản đồ ung thư thế giới với khoảng 70.000 trường hợp tử vong và 200.000 ca mắc mới mỗi năm. Do các phương pháp hỗ trợ điều trị kinh điển như phẫu thuật, hóa trị và xạ trị thường để lại nhiều tác dụng phụ bất lợi, việc sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao nhằm định hướng phát triển dược chất mới là hướng nghiên cứu nhận được nhiều sự quan tâm. Việt Nam sở hữu khoảng 3.260 km bờ biển với hệ sinh thái ngập mặn phong phú. Các loài thực vật sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên khắc nghiệt như đất cát, ngập triều, độ mặn tương đương nước biển, yếm khí và chịu áp lực sinh học từ côn trùng đã hình thành nên các con đường sinh tổng hợp thứ cấp đặc thù, tạo ra nhiều nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng. Mặc dù nhiều loài cây ngập mặn đã được sử dụng lâu đời trong y học dân gian, số lượng công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của chúng tại Việt Nam còn tương đối hạn chế.

Luận án xác định ba mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản như sau:

  1. Chiết xuất phân lập các chất từ 3 loài cây ngập mặn Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) và Cóc đỏ (Lumnitzera littorea).
  2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã phân lập.
  3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, gây độc tế bào, chống oxy hóa của các dịch chiết và một số chất phân lập được từ 3 loài cây kể trên.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt., họ Trâm bầu - Combretaceae): Mẫu thực vật gồm lá và cành được thu hái tại bờ biển Thuận An, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 05/2014; định danh khoa học bởi PGS. TS. Đỗ Xuân Cẩm (Trường Đại học Nông lâm Huế); lưu giữ mẫu tiêu bản số CDL.1 tại phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Cây Hếp (Scaevola taccada (Gaertn.) Roxb., họ Hếp - Goodeniaceae): Mẫu lá thu hái tại đảo Lý Sơn, huyện Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi vào tháng 05/2014; định danh khoa học bởi PGS. TS. Đỗ Xuân Cẩm; lưu giữ mẫu tiêu bản số ST.1 tại phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học.
  • Cây Cỏ chông (Spinifex littoreus (Burm. f.) Merr., họ Lúa - Poaceae): Mẫu thu hái tại vùng ven biển xã Tam Hải, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam vào tháng 10/2013; định danh khoa học bởi ThS. Nguyễn Thế Anh; lưu giữ mẫu tiêu bản số SL.1 tại phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Theo tổng quan của tác giả, hệ sinh thái rừng ngập mặn toàn cầu ghi nhận 84 loài thuộc 24 chi và 16 họ, trong đó gồm 70 loài cây ngập mặn thực thụ (thuộc 16 chi, 11 họ) và 14 loài cây bán ngập mặn (thuộc 8 chi, 5 họ). Mức ngập triều là yếu tố chi phối sự phân bố sinh thái, được chia thành 5 cấp độ:

Cấp ngập triều Đặc điểm ngập Loài thực vật phổ biến
Cấp 1 Ngập bởi tất cả các con nước lớn Đưng (Rhizophora mucronata) mọc ven bờ lạch
Cấp 2 Ngập bởi con nước lớn trung bình Mắm trắng (Avicennia alba), Mắm biển (Avicennia marina), Bần trắng (Sonneratia alba), Đưng
Cấp 3 Ngập bởi nước lớn bình thường Đước đôi (Rhizophora apiculata) chiếm ưu thế, Dà (Ceriops), Vẹt tách (Bruguiera parviflora)
Cấp 4 Ngập bởi các con nước rong Vẹt dù (Bruguiera gymnorhiza), Vẹt trụ (Bruguiera cylindrica), Vẹt tách, Ráng đại (Acrostichum aureum), Ráng đại thanh (A. speciosum), các loài Cóc (Lumnitzera), Gừa (Ficus microcarpa)
Cấp 5 Hiếm khi ngập, chỉ ngập do triều cao bất thường Dừa nước (Nypa fruticans), Nhum (Oncosperma tigillarium), Su (Xylocarpus), Cui (Heritiera), Gõ biển (Intsia bijuga), Vẹt dù, Vẹt đen (Bruguiera sexangula)

Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tính đến tháng 12/2015, diện tích rừng ngập mặn tại Việt Nam còn khoảng 57.211 ha (19.559 ha rừng tự nhiên và 37.652 ha rừng trồng), phân bố trên 4 khu vực: Khu vực I (Đông Bắc, từ mũi Ngọc đến mũi Đồ Sơn); Khu vực II (đồng bằng Bắc Bộ, từ Đồ Sơn đến Lạch Trường); Khu vực III (Trung Bộ, từ Lạch Trường đến Vũng Tàu); Khu vực IV (Nam Bộ, từ Vũng Tàu đến mũi Nải).

Lịch sử nghiên cứu hóa học thực vật ngập mặn trên thế giới ghi nhận công trình đầu tiên của Bournot (1913) phân lập lapachol từ loài Avicennia tomentosa. Tiếp đó, Rao Bose (1959) phân lập triterpene genin-A từ vỏ cây Aegiceras corniculatum; Taylor (1965) phân lập gedunin từ gỗ Xylocarpus granatum. Giai đoạn 1970–2000 và từ năm 2000 đến nay, các nhóm tác giả tại Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan và Úc đã công bố nhiều nhóm chất alkaloid, diterpenoid, triterpenoid, flavonoid và phenolic từ các chi Bruguiera, Rhizophora, Ceriops, Lumnitzera, Sonneratia và Excoecaria. Về mặt hoạt tính sinh học, các công trình quốc tế đã khảo sát tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống oxy hóa và gây độc tế bào ung thư của các hợp chất tự nhiên này (như dẫn xuất taraxerol từ B. cylindrica gây độc trên dòng tế bào ung thư phổi NCI-H-87; gedunin từ X. granatum ức chế dòng ung thư ruột Ca-2; các hợp chất phenolic glycoside từ E. agallocha gây độc trên dòng tế bào ung thư tụy PANC1 và ung thư tuyến tiền liệt DU145).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu hóa học thực vật ngập mặn còn ít:

  • Nguyễn Thị Hoài Thu và cộng sự (2011) đã phân lập 58 hợp chất từ cây Bần trắng (Sonneratia alba) và Bần ổi (Sonneratia ovata) ở Cần Giờ, phát hiện 7 hợp chất mới (sonnerphenolic A–D, sonnerstigmane A–D, sonnercerebroside).
  • Viện Hóa sinh biển (2014) sàng lọc 28 mẫu thực vật ngập mặn tại Vườn Quốc gia Xuân Thủy, ghi nhận 5 mẫu có hoạt tính kháng vi sinh vật, 12 mẫu có hoạt tính gây độc tế bào, phân lập 44 hợp chất từ các loài Bần chua (Sonneratia caseolaris), Đước vòi (Rhizophora stylosa), Dứa dại (Pandanus odoratissimus) và Cóc trắng (Lumnitzera racemosa).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định: Hai loài Cỏ chông (Spinifex littoreus) và Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) chưa từng có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học tại Việt Nam cũng như trên thế giới; loài Hếp (Scaevola taccada) đã có một số công bố quốc tế nhưng chưa được nghiên cứu về mặt hóa học tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp các phương pháp chiết xuất, sắc ký phân lập, phổ nghiệm cấu trúc hóa học và các quy trình thử nghiệm sinh học in vitro chuẩn hóa.

Phương pháp chiết xuất và phân lập hóa học

  • Chiết mẫu:
    • Phương pháp chiết tổng: Áp dụng cho mẫu Cỏ chông bằng dung môi EtOH : H2O (9:1) ở nhiệt độ thường, sau đó phân bố phân lớp lần lượt với n-hexane, ethyl acetate và n-butanol.
    • Phương pháp chiết lần lượt: Áp dụng cho bột lá cây Hếp (1,2 kg) và bột cành (650 g), bột lá (540 g) cây Cóc đỏ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate và methanol.
    • Tách chiết alkaloid tổng: Tiến hành trên cặn chiết methanol lá Hếp bằng cách hòa tan trong nước, tạo môi trường acid bằng acid tartaric (pH = 4) để chuyển alkaloid về dạng muối, chiết loại tạp bằng ethyl acetate; sau đó kiềm hóa pha nước bằng dung dịch NH3 đến pH = 7,5–8 để giải phóng alkaloid tự do và chiết thu hồi bằng CH2Cl2.
  • Sắc ký phân lập: Sử dụng sắc ký lớp mỏng phân tích (bản nhôm tráng sẵn silica gel 60 GF254 Merck độ dày 0,2 mm), sắc ký lớp mỏng điều chế (silica gel 60G F254 Merck), và sắc ký cột (chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,040–0,063 mm Merck, pha đảo RP-18 và Sephadex LH-20). Thuốc thử hiện màu gồm dung dịch vanilin 1% trong MeOH–H2SO4 đặc (sấy ở 110°C), dung dịch H2SO4 10% và thuốc thử Dragendorff.
  • Phương pháp xác định cấu trúc: Phổ hồng ngoại FT-IR (máy IMPACT-410, Nicolet-Carl Zeiss Jena, đo viên nén KBr); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (1H, 13C, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY ghi trên máy Bruker Avance-500 MHz, chất nội chuẩn TMS cho 1H NMR và tín hiệu dung môi cho 13C NMR); phổ khối ESI-MS (máy UPLC/MS/MS Xevo-TQMS, Waters) và HR-ESI-MS; đo năng suất quay cực trên máy Jasco P-2000 Polarimeter. Các phản ứng hóa học bán tổng hợp (acetyl hóa) được áp dụng để hỗ trợ chứng minh cấu trúc.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính gây độc tế bào in vitro: Thực hiện theo phương pháp chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) trên đĩa 96 giếng. Các dòng tế bào thử nghiệm do ATCC cung cấp gồm: KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), LU (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú). Môi trường nuôi cấy là DMEM bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS) ở 37°C, 5% CO2. Mẫu thử được pha loãng thành các nồng độ 128; 32; 8; 2; 0,5 µg/mL. Ủ tế bào trong 3 ngày, sau đó bổ sung MTT (0,2 mg/mL), ủ tiếp 4 giờ, hòa tan tinh thể formazan bằng DMSO và đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 540 nm trên máy Genios TECAN. Chất đối chứng dương là Ellipticine (Sigma). Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm Table Curve.
  • Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Đánh giá bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng trên đĩa 96 giếng nhằm xác định các giá trị MIC, IC50 và MBC. Mật độ vi sinh vật thử nghiệm là 5.10^5 CFU/mL, ủ 24 giờ ở 37°C. Đo độ đục trên máy quang phổ TECAN và tính toán bằng phần mềm Raw Data. Các chủng kiểm định gồm:
    • Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis (ATCC 6633), Staphylococcus aureus (ATCC 13709), Lactobacillus fermentum (N4).
    • Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Salmonella enterica.
    • Nấm men: Candida albicans (ATCC 10231).
    • Môi trường thử nghiệm: MHB, MHA, TSB, TSA (cho vi khuẩn); SDB, SA (cho nấm). Chất đối chứng gồm Ampicillin (MIC 0,004–1,20 µg/mL cho vi khuẩn Gram (+)), Cefotaxim (MIC 0,07–19,23 µg/mL cho vi khuẩn Gram (-)) và Nystatin (MIC 2,8–5,0 µg/mL cho nấm).
  • Hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH: Sử dụng dung dịch DPPH 1 mM trong methanol, phản ứng với các nồng độ mẫu thử (128; 32; 8; 2; 0,5 µg/mL trong DMSO) trong 30 phút ở 37°C. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm trên máy Genios TECAN, tính phần trăm quét gốc tự do (SC%) và xác định giá trị EC50 qua 3 lần lặp thí nghiệm (n = 3).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu nêu rõ tính cấp thiết của đề tài trong bối cảnh tỷ lệ mắc bệnh ung thư gia tăng và nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên từ thực vật biển. Văn bản xác định 3 mục tiêu nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu (Cỏ chông, Hếp, Cóc đỏ) và khẳng định ý nghĩa khoa học, thực tiễn của việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài cây ngập mặn tại miền Trung Việt Nam.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống các tài liệu trong và ngoài nước về:

  1. Đặc điểm sinh thái, thực vật học, hệ thống phân loại và 5 cấp ngập triều của rừng ngập mặn; thực trạng phân bố rừng ngập mặn tại 4 khu vực địa lý của Việt Nam.
  2. Lịch sử nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, gây độc tế bào) của các loài ngập mặn thuộc các chi Acanthus, Aegiceras, Avicennia, Bruguiera, Ceriops, Excoecaria, Heritiera, Rhizophora, Sonneratia, Xylocarpus.
  3. Tổng quan thực vật học, công dụng dân gian và tình hình nghiên cứu hóa thực vật của ba đối tượng nghiên cứu:
    • Chi Lumnitzera (họ Combretaceae): Chi này có 2 loài là Cóc trắng (L. racemosa) và Cóc đỏ (L. littorea). Cóc đỏ là loài có tên trong Sách đỏ Việt Nam (mức độ V), mọc ở vùng cửa sông, ít ngập triều. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào loài Cóc trắng (phân lập tannin, resorcinolic, flavonoid, triterpene), trong khi Cóc đỏ chưa được nghiên cứu về mặt hóa học.
    • Chi Spinifex (họ Poaceae): Gồm 5 loài, trong đó 4 loài ở Úc và duy nhất loài S. littoreus phân bố tại châu Á và Việt Nam. Dân gian dùng toàn cây làm thuốc lợi tiểu; các nghiên cứu trước chỉ dừng lại ở thử nghiệm hoạt tính dịch chiết thô.
    • Chi Scaevola (họ Goodeniaceae): Giới thiệu đặc điểm loài Hếp (Scaevola taccada), kinh nghiệm dân gian sử dụng rễ, lá, vỏ trị phù thũng, lỵ, tiêu chảy; tổng hợp các hợp chất iridoid, coumarin, terpenoid đã phân lập trên thế giới và hoạt tính ức chế peroxid hóa lipid, bảo vệ gan, hạ sốt, kháng khuẩn của dịch chiết lá.

Chương 2: Đối tượng, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Chương này mô tả chi tiết địa điểm thu mẫu, hóa chất, trang thiết bị máy móc, phương pháp chiết xuất, quy trình sắc ký cột phân lập và các phương pháp thử nghiệm sinh học.

Kết quả điều chế cặn chiết từ các mẫu thực vật:

Mẫu thực vật Bộ phận Khối lượng mẫu khô Loại cặn chiết Khối lượng cặn thu được Tỷ lệ % so với mẫu khô
Cây Hếp Lá 1,2 kg Cặn n-hexane 14,0 g 1,17 %
Cặn ethyl acetate 20,72 g 1,73 %
Cặn methanol 159,9 g 13,33 %
Cây Cóc đỏ Lá 540 g Cặn n-hexane lá 6,0 g 1,11 %
Cặn ethyl acetate lá 6,9 g 1,27 %
Cặn methanol lá 25,0 g 4,60 %
Cành 650 g Cặn n-hexane cành 9,0 g 1,30 %
Cặn ethyl acetate cành 12,0 g 1,80 %
Cặn methanol cành 25,0 g 3,80 %

Quá trình phân lập các hợp chất tinh khiết:

  • Từ lá cây Hếp (Scaevola taccada):
    • Từ 14 g cặn n-hexane (qua sắc ký cột silica gel hệ n-hexane : EtOAc 1:0 → 1:1, thu 34 phân đoạn và sắc ký Sephadex LH-20) phân lập được 4 hợp chất: ST1 (Glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Z-octadecadienoate), 12 mg, dạng dầu không màu); ST2 (α-amyrin, 40 mg, bột màu trắng); ST3 (Stigmasterol, 39 mg, tinh thể hình kim màu trắng); ST4 (Myricadiol, 70,4 mg, dạng thạch mềm).
    • Từ 20 g cặn ethyl acetate (qua sắc ký cột silica gel hệ CH2Cl2 : MeOH 1:0 → 0:1, thu 19 phân đoạn) phân lập được: ST5 (n-tritriacontane, 7,0 mg); ST6 (n-tetracosane, 6 mg); ST7 (β-sitosterol, 15 mg); ST8 (Acid ursolic, C30H48O3, M = 456, 50 mg); ST9 (β-sitosterol glucoside, 10 mg) và thu thêm ST4 (Myricadiol, 30 mg).
    • Từ 120 g cặn methanol, chiết tách phân đoạn thu được 3,0 g cặn alkaloid tổng.
  • Từ lá và cành cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea):
    • Từ 12 g cặn ethyl acetate cành (sắc ký cột silica gel hệ n-hexane : EtOAc 1:0 → 0:1, thu 10 phân đoạn): phân lập được CĐ1 (hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol tỷ lệ 1:1, 13 mg); CĐ2 (2-methyl-1,3-dihydroxy-5-tridecylbenzene, 8 mg, dạng dầu màu vàng; thực hiện phản ứng acetyl hóa với (CH3CO)2O/pyridin thu được dẫn xuất CĐ2a: 2-methyl-1,3-di-O-acetyl-5-tridecylbenzene, 12 mg); CĐ3 (1,3-dihydroxy-5-nonadecylbenzene, C25H44O2, M = 376, 7 mg, dạng dầu màu vàng).
    • Từ 6,9 g cặn ethyl acetate lá (sắc ký cột silica gel hệ CH2Cl2 : MeOH 1:0 → 1:1, thu 32 phân đoạn): phân lập được CĐ4 (Quercetin, 9 mg, dạng bột màu vàng) và CĐ5 (β-sitosterol glucoside, 27 mg, dạng bột màu trắng).
    • Từ 25 g cặn methanol cành (sắc ký cột silica gel hệ EtOAc : MeOH 9:1 → 0:1 và MeOH : H2O 98:2 → 85:15, thu 22 phân đoạn): phân lập được CĐ6 (Astragalin, 13 mg, dạng dầu); CĐ7 (1-O-acetyl-D-mannitol, 26,9 mg, tinh thể màu trắng); CĐ8 (D-Mannitol, 3,98 g, dạng bột màu trắng, chiếm 15,92% khối lượng cặn MeOH cành; thực hiện phản ứng acetyl hóa thu được dẫn xuất CĐ8a: Hexa-O-acetyl-D-mannitol, 67,1 mg); và CĐ5 (β-sitosterol glucoside).
    • Từ 25 g cặn methanol lá: Tiến hành acetyl hóa 400 mg phân đoạn CĐML5 bằng (CH3CO)2O/pyridin trong 20 giờ ở nhiệt độ phòng, sắc ký cột sản phẩm acetyl hóa thu được hai hợp chất tinh khiết: CĐ9 (2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl-2’,3’,4’,6’-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside, 32 mg, tinh thể màu trắng, Rf = 0,4) và CĐ10 (1,3,4,5-tetra-O-acetyl fructopyranose, 30 mg, tinh thể màu trắng, Rf = 0,4).
  • Từ mẫu cây Cỏ chông (Spinifex littoreus): Tiến hành khảo sát sắc ký bản mỏng và thăm dò hoạt tính của 5 phân đoạn dịch chiết (n-hexane, CH2Cl2, ethyl acetate, methanol, n-butanol).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt hóa học

  • Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học của loài Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và cây Hếp (Scaevola taccada) tại vùng biển Việt Nam.
  • Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của nhiều hợp chất thuộc các khung cấu trúc khác nhau từ cây Hếp và cây Cóc đỏ:
Ký hiệu Tên hợp chất Phân loại hóa học Nguồn gốc phân lập
ST1 Glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Z-octadecadienoate) Triglyceride Cặn n-hexane lá Hếp
ST2 α-amyrin Triterpenoid Cặn n-hexane lá Hếp
ST3 Stigmasterol Steroid Cặn n-hexane lá Hếp
ST4 Myricadiol Triterpenoid Cặn n-hexane & EtOAc lá Hếp
ST5 n-tritriacontane Hydrocarbon mạch thẳng Cặn EtOAc lá Hếp
ST6 n-tetracosane Hydrocarbon mạch thẳng Cặn EtOAc lá Hếp
ST7 β-sitosterol Steroid Cặn EtOAc lá Hếp
ST8 Acid ursolic (C30H48O3, M = 456) Triterpenoid Cặn EtOAc lá Hếp
ST9 / CĐ5 β-sitosterol glucoside Steroid glycoside Cặn EtOAc lá Hếp; EtOAc lá & MeOH cành Cóc đỏ
CĐ1 Hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol (1:1) Steroid Cặn EtOAc cành Cóc đỏ
CĐ2 2-methyl-1,3-dihydroxy-5-tridecylbenzene Dẫn xuất Alkylresorcinol Cặn EtOAc cành Cóc đỏ
CĐ2a 2-methyl-1,3-di-O-acetyl-5-tridecylbenzene Dẫn xuất Alkylresorcinol acetyl hóa Sản phẩm bán tổng hợp từ CĐ2
CĐ3 1,3-dihydroxy-5-nonadecylbenzene (C25H44O2) Dẫn xuất Alkylresorcinol Cặn EtOAc cành Cóc đỏ
CĐ4 Quercetin Flavonoid (Flavonol) Cặn EtOAc lá Cóc đỏ
CĐ6 Astragalin Flavonoid glycoside Cặn MeOH cành Cóc đỏ
CĐ7 1-O-acetyl-D-mannitol Dẫn xuất Polyol Cặn MeOH cành Cóc đỏ
CĐ8 D-Mannitol Polyol (đường rượu) Cặn MeOH cành Cóc đỏ (15,92%)
CĐ8a Hexa-O-acetyl-D-mannitol Dẫn xuất Polyol acetyl hóa Sản phẩm bán tổng hợp từ CĐ8
CĐ9 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl-2’,3’,4’,6’-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside Disaccharide acetyl hóa Phân đoạn acetyl hóa cặn MeOH lá Cóc đỏ
CĐ10 1,3,4,5-tetra-O-acetyl fructopyranose Monosaccharide acetyl hóa Phân đoạn acetyl hóa cặn MeOH lá Cóc đỏ
  • Đã xác định hàm lượng D-mannitol chiếm tỷ lệ cao (15,92%) trong cặn chiết methanol cành cây Cóc đỏ.
  • Áp dụng các biến đổi hóa học (acetyl hóa) để khẳng định cấu trúc của các hợp chất phenolic phân cực và dẫn xuất đường phức tạp.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  • Cung cấp dẫn liệu khoa học giải thích bản chất hóa học và cơ sở cho các ứng dụng dân gian của cây Hếp, Cóc đỏ và Cỏ chông.
  • Thiết lập quy trình chiết xuất, tách phân đoạn và tinh chế các hợp chất thứ cấp từ thực vật ngập mặn ven biển miền Trung Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận trong văn bản

  • Do lượng mẫu ban đầu hạn chế, tác giả chưa phân lập được các hợp chất alkaloid riêng rẽ từ phân đoạn alkaloid tổng (3,0 g) của cặn methanol lá cây Hếp (Scaevola taccada).
  • Các chất trong dịch nước sau khi tách alkaloid từ cặn methanol lá Hếp trùng với các chất đã phân lập từ cặn ethyl acetate nên quy trình phân lập chi tiết của phân đoạn này không được trình bày riêng.
  • Địa bàn thu mẫu thực vật giới hạn tại ba địa phương cụ thể thuộc miền Trung (Tam Hải - Quảng Nam, Lý Sơn - Quảng Ngãi, Thuận An - Thừa Thiên Huế).

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng quy mô khối lượng mẫu nguyên liệu để phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất alkaloid từ lá cây Hếp.
  • Tiếp tục thực hiện quy trình phân lập chi tiết các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn chiết của cây Cỏ chông (Spinifex littoreus).
  • Mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và in vivo đối với các chất tinh khiết đã phân lập được.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho:

  1. Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa Dược và Dược liệu học: Cung cấp thông số thực nghiệm, quy trình sắc ký cột (silica gel, Sephadex LH-20), dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C NMR) và phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) của các nhóm chất triterpenoid, steroid, alkylresorcinol, polyol và flavonoid.
  2. Các nhà nghiên cứu sinh học biển và dược lý sinh học: Tham khảo quy trình sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào (chuẩn NCI trên đĩa 96 giếng), thử nghiệm kháng vi sinh vật kiểm định xác định MIC/IC50/MBC và phương pháp quét gốc tự do DPPH.
  3. Cơ quan quản lý tài nguyên và dược liệu: Dữ liệu về thành phần hóa học của loài Cóc đỏ (thuộc Sách đỏ Việt Nam cấp V) và các loài thực vật ngập mặn ven biển miền Trung đóng góp cơ sở dữ liệu phục vụ công tác bảo tồn và định hướng khai thác bền vững nguồn gen thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba loài thực vật ngập mặn được lựa chọn nghiên cứu trong luận án là những loài nào và được thu hái ở đâu?
Luận án nghiên cứu 3 loài gồm: Cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt., họ Combretaceae) thu hái tại bờ biển Thuận An, Thừa Thiên Huế (05/2014); Hếp (Scaevola taccada (Gaertn.) Roxb., họ Goodeniaceae) thu hái tại đảo Lý Sơn, Quảng Ngãi (05/2014); và Cỏ chông (Spinifex littoreus (Burm. f.) Merr., họ Poaceae) thu hái tại xã Tam Hải, huyện Núi Thành, Quảng Nam (10/2013).

2. Hợp chất nào chiếm hàm lượng lớn nhất trong cặn chiết methanol cành cây Cóc đỏ?
Hợp chất D-mannitol (CĐ8) chiếm hàm lượng 15,92% (thu được 3,98 g tinh khiết từ 25 g cặn chiết methanol cành). Cấu trúc của hợp chất này được khẳng định thêm thông qua phản ứng acetyl hóa tạo dẫn xuất Hexa-O-acetyl-D-mannitol (CĐ8a, 67,1 mg).

3. Các dòng tế bào ung thư và chủng vi sinh vật nào được sử dụng trong đánh giá hoạt tính sinh học?
Phép thử độ độc tế bào in vitro sử dụng 4 dòng tế bào ung thư người do ATCC cung cấp gồm KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan), LU (ung thư phổi) và MCF-7 (ung thư vú) với chất chuẩn là Ellipticine. Phép thử kháng vi sinh vật sử dụng 7 chủng kiểm định: vi khuẩn Gram (+) (B. subtilis, S. aureus, L. fermentum), vi khuẩn Gram (-) (E. coli, P. aeruginosa, S. enterica) và nấm men (C. albicans) với chất chuẩn là Ampicillin, Cefotaxim và Nystatin.

4. Vì sao tác giả không trình bày quy trình phân lập alkaloid từ cặn methanol của lá cây Hếp?
Mặc dù đã chiết tách được 3,0 g cặn alkaloid tổng từ 120 g cặn methanol lá Hếp, do lượng mẫu ban đầu hạn chế nên tác giả không phân lập được alkaloid ở dạng chất tinh khiết riêng rẽ. Đồng thời, các hợp chất trong dịch nước còn lại sau khi chiết alkaloid trùng với các hợp chất thu được từ cặn ethyl acetate.

5. Luận án đã phân lập được những nhóm hợp chất chính nào từ cây Hếp (Scaevola taccada)?
Từ cặn n-hexane và ethyl acetate của lá cây Hếp, luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của các nhóm hợp chất: triglyceride (Glycerol 1,3-dihexadecanoate-2 (9Z,12Z-octadecadienoate) - ST1); triterpenoid (α-amyrin - ST2, Myricadiol - ST4, Acid ursolic - ST8); steroid và steroid glycoside (Stigmasterol - ST3, β-sitosterol - ST7, β-sitosterol glucoside - ST9); và hydrocarbon no mạch thẳng (n-tritriacontane - ST5, n-tetracosane - ST6).

Kết luận

Luận án tiến sĩ đã thực hiện nghiên cứu thực nghiệm về thành phần hóa học của ba loài thực vật ngập mặn vùng ven biển miền Trung Việt Nam gồm Cỏ chông (Spinifex littoreus), Hếp (Scaevola taccada) và Cóc đỏ (Lumnitzera littorea). Tác giả đã phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 19 hợp chất tự nhiên và dẫn xuất bán tổng hợp thuộc các khung triterpenoid, alkylresorcinol, flavonoid, steroid, polyol và carbohydrate. Công trình cung cấp quy trình chiết tách, dữ liệu phổ nghiệm và thiết lập hệ thống thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào, kháng vi sinh vật và chống oxy hóa in vitro, đóng góp nguồn tư liệu khoa học cho lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên từ thực vật biển tại Việt Nam.