MỞ ĐẦU ---o0o--- Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzyme và ứng dụng. Enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm hiện đại. Enzyme được bổ sung một cách định hướng và chọn lọc vào các thực phẩm trong quá trình chế biến nhằm tạo cho sản phẩm có được kết cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù. Ngoài ra Enzyme còn được bổ sung vào các phế phẩm của thực phẩm để xử lý và tách các chất có lợi trong các phế phẩm đó.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân cắt. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên [8]. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm ( đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp….Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1,5 tỷ USD, và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp [8] Chitin và dẫn xuất của nó đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, xử lý môi trường, nông nghiệp… Từ trước đến nay chitin chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp hóa học trong đó loại khoáng bằng axit và loại protein 15 Trần Thị Nguyệt Cao học thực phẩm09 Luận văn cao học TP Viện CNSH & TP bằng kiềm. Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng protein, khoáng còn lại thấp và thời gian tiến hành ngắn.
Tuy nhiên phương pháp này làm giảm chất lượng chitin và nếu nước thải không được xử lý gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. Một hướng mới là sử dụng phương pháp sinh học để thu hồi chitin. Trong nghiên cứu này, tôi kết hợp một số chế phẩm protease và vi khuẩn lactic để thu hồi chitin. Thành phần khoáng được loại bỏ bởi quá trình lên men lactic, 4 chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn để tìm ra chủng có khả năng sinh enzyme thủy phân protein cao nhất.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic đều được nghiên cứu như: thời gian chuẩn bị giống, tỉ lệ giống, pH ban đầu, thời gian lên men. Sau quá trình thủy phân trên vỏ tôm, ngoài chitin thu được, chúng ta còn thủ được các sản phẩm khác như: protein, chất màu… Nội dung cần nghiên cứu bao gồm: +Lựa chọn vi khuẩn lactc từ một số thực phẩm lên men truyền thống có khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân protein. + Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân protein của vi khuẩn đã lựa chọn. +Ứng dụng thử nghiệm trên vỏ tôm.
Kết quả thu được : xác định được chủng Lactobacillus platarum HA6 có khả năng sinh enzyme thủy phân protein cao nhất.Khi nghiên cứu trên môi trường MRS nhận thấy: môi trường thuận lợi tạo enzyme thủy phân protein là môi trường có pH = 5.5, thời gian 48h, nhiệt độ 30 oC , dựa vào kết quả này để ứng dụng thử nghiệm trên vỏ tôm. Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic thu được các điều kiện tốt nhất để loại protein trong vỏ tôm là chuẩn bị giống trong thời gian 18h, tỉ lệ giống 10%, pH ban đầu là 5,5, thời gian lên men là 144 giờ. Hiệu suất loại protein là 84. 16 Trần Thị Nguyệt Cao học thực phẩm09 Luận văn cao học TP Viện CNSH & TP PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---o0o--- 1.Tổng quan về vi khuẩn lactic và quá trình lên men lactic 1.Định nghĩa: Vi khuẩn lactic là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh axit lactic như là sản phẩm chính của quá trình chuyển hóa hydratcacbon.
Do đặc tính chung này chúng được xếp vào họ Lactobacterlaceae.[6] Trước đây vi khuẩn lactic được coi là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men và đông tụ sữa bao gồm cả vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn lactic. Sau đó đã có rất nhiều các nghiên cứu về vi khuẩn lactic, nhờ các kĩ thuật hiện đạic con người đã miêu tả đầy đủ hơn về hình dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic.Phân loại vi khuẩn lactic:[6] Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic. Dựa vào những tính chất cơ bản của chúng mà người ta có thể phân lọai theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm.Theo Orla-Jensen (1919) chia làm 4 loài chính 17 Trần Thị Nguyệt Cao học thực phẩm09 Luận văn cao học TP Viện CNSH & TP Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Streptococcus Lactobacillus Streptococcus thermophilus Leuconostoc mensenteroides Hình 1.1 : Hình dạng 4 loại vi khuẩn lactic b.Phân loại theo hình dạng tế bào: Hình que: Lactobacillus, Carnobacterium Hình cầu: các giống còn lại Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que) Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu (Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus) 18 Trần Thị Nguyệt Cao học thực phẩm09 Luận văn cao học TP Viện CNSH & TP C.Phân loại theo cách thức lên men: Lên men đồng hình (homofermentative): Chuyển glucoza thành axit lactic Lên men dị hình (heterofermentative): Chuyển glucoza thành axit lactic, rượu ethylic, axit acetic, CO2 Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, một số Lactobacillus Ngoài ra còn có thể phân loại vi khuẩn lactic theo một số đặc điểm sau: Nhiệt độ sinh trưởng: 10-45oC Khả năng chịu muối Khả năng sinh trưởng ở pH khác nhau Khả năng sinh tổng hợp các đồng phân khác nhau của axit lactic 1.Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic: Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc dù nhóm này không có sự giống nhau về hình thái và, bao gồm cả vi khuẩn hình que dài, hình que ngắn lẫn các vi khuẩn hình cầu, song về mặt sinh lý chúng có chung các đặc điểm khá đặc trưng.
Tất cả các đại diện đều là các vi khuẩn gram dương, không tạo thành bào tử (trừ Sporolactobacillus) và không di động. Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra acid lactic (lactate) [9] Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu. 19 Trần Thị Nguyệt Cao học thực phẩm09 Luận văn cao học TP Viện CNSH & TP - Do đó, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí, là loại có khả năng lên men hiếu khí cũng như kỵ khí. - Chúng thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que - Vi khuẩn lactic lên men được mono và disacarit, nhưng không phải tất cả các vi sinh vật này đều sử dụng được bất kỳ loại disacarit nào - Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong quá trình lên men.
Các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột và các polysacarit khác (chỉ có loài L. delbrueckii là đồng hóa được tinh bột). Một số khác sử dụng được pentoza và acid xitric mà chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình. -Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân hủy được protein của sữa thành các peptit và acid amin.
Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn. Giới thiệu về enzyme protease của vi khuẩn lactic 1. Đại cương về enzyme Protease Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzyme và ứng dụng. Enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong ngành công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm hiện đại.
Enzyme được bổ sung một cách định hướng và chọn lọc vào các thực phẩm trong quá trình chế biến nhằm tạo cho sản phẩm có được kết cấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù khác. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử.[26] Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là các enzyme có khả năng thủy phân các liên kết peptide của chuỗi peptide, protein thành các đoạn peptide ngắn hơn và các axit amin. Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Theo phân loại quốc tế enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 nhóm: 1.
Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ở đầu Nito của mạch polypeptide 2. Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ở đầu Cacbon của mạch polypeptide. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo- peptidase. Dipeptihydrolase: xúc tác sự thủy phân liên kết dipeptide.
Proteinase: xúc tác sự thủy phân các liên kết peptide nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ qan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus), đến thực vật ( đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…) Ở Việt Nam những nghiên cứu về protease được tiến hành từ thập kỷ 60. Về Protease động vật có những nghiên cứu tìm hiểu đặc tính protease của một số loài thường dùng trong sản xuất nước mắm. Về protease thực vật có những nghiên cưú về bromelain, parapin, protease của cây sung [17].
Các nghiên cứu liên quan đến protease từ vi sinh vật tập trung vào protease axit của vi khuẩn Bacillus, của nấm mốc Aspergillus và hầu hết hướng vào mục đích sử dụng cho công nghệ thực phẩm. Một số thành tựu đã đạt tới các bước ứng dụng cụ thể như sau: 21 Trần Thị Nguyệt Cao học thực phẩm09 Luận văn cao học TP Viện CNSH & TP Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một số phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Trong công nghiệp chế biến thủy sản: Hiện nay quy trinh sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm [8,3]. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện về công nghệ.
Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. mesentericus… được dùng trong sản xuất phomat Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc.