Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học với đề tài "Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Thảo thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, thuộc chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất (mã số: 9720210), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phương Thiện Thương và TS. Nguyễn Thị Liên. Công trình được hoàn thành và bảo vệ năm 2023.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Dược liệu và các sản phẩm thuốc từ dược liệu chiếm vị trí quan trọng trong hệ thống chăm sóc sức khỏe. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số toàn cầu sử dụng dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu. Xu hướng tiêu chuẩn hóa dược liệu thông qua việc kiểm soát các hợp chất đánh dấu (marker) bằng phương pháp sắc ký hiện đại (HPLC, GC) đã trở thành quy chuẩn bắt buộc trong các dược điển lớn trên thế giới như Dược điển Châu Âu (EP 10 với 208/214 chuyên luận bắt buộc dùng chất đánh dấu), Dược điển Trung Quốc (2015 với 332/583 chuyên luận), và Tiêu chuẩn Dược liệu Hồng Kông (310/323 chuyên luận).

Tại Việt Nam, Quyết định số 1976/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ đặt mục tiêu đến năm 2030 đạt 100% nguyên liệu dược liệu được tiêu chuẩn hóa theo nguyên tắc GMP-WHO. Tuy nhiên, trong Dược điển Việt Nam V (DĐVN V), dù đã có 310 chuyên luận dược liệu nhưng mới có 83 chuyên luận (27%) sử dụng chất đánh dấu trong định tính, định lượng và chỉ có 59 chuyên luận (19%) định lượng bằng HPLC/GC. Chuyên luận đối với hai dược liệu thông dụng là Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) và Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry)) trong DĐVN V vẫn còn đơn giản: định tính chủ yếu bằng vi phẫu, soi bột, phản ứng hóa học hoặc sắc ký lớp mỏng; định lượng chỉ dừng ở phương pháp cân cắn chiết hòa tan trong cồn, chưa có tiêu chuẩn định lượng hoạt chất hay chất đánh dấu đặc hiệu.

Khoảng trống nghiên cứu được chỉ ra cụ thể:

  • Đối với Hy thiêm: Dược điển Trung Quốc và Hồng Kông yêu cầu định lượng kirenol. Tuy nhiên, các khảo sát thực tế cho thấy mẫu Hy thiêm phân bố tại một số vùng của Việt Nam chứa rất ít hoặc không có kirenol, trong khi lại tích lũy hàm lượng đáng kể darutosid — một diterpenoid có hoạt tính sinh học tương đương. Do đó, việc chỉ dùng kirenol không phản ánh đầy đủ chất lượng của nguồn dược liệu Hy thiêm tại Việt Nam.
  • Đối với Vối: Cả nụ Vối và lá Vối đều chưa có quy định định lượng chất đánh dấu trong DĐVN V, đồng thời chưa được đưa vào dược điển các nước. Hợp chất flavonoid chính là 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (CO1) có hoạt tính sinh học rõ rệt nhưng chưa được thiết lập chất chuẩn hóa học gốc phục vụ công tác kiểm nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dược liệu Hy thiêm hợp chất darutosid, từ dược liệu Vối hợp chất CO1 đạt độ tinh khiết và khối lượng đáp ứng yêu cầu thiết lập chất chuẩn gốc.
  2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid và CO1 tinh chế được.
  3. Thiết lập chất chuẩn hóa học gốc cho darutosid và CO1 theo các hướng dẫn quốc tế (ISO Guide 35, WHO).
  4. Ứng dụng các chất chuẩn thiết lập được để xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời darutosid và kirenol trong dược liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối và lá Vối bằng phương pháp HPLC.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Dược liệu Hy thiêm: Phần trên mặt đất phơi sấy khô của cây Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., họ Cúc - Asteraceae).
    • Dược liệu Vối: Nụ hoa khô (Flos Cleistocalysis operculati) và lá khô (Folium Cleistocalysis operculati) của cây Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry), họ Sim - Myrtaceae).
    • Các hợp chất phân lập: Darutosid (C₂₆H₄₄O₈, phân tử lượng 484,6) và CO1 (C₁₈H₁₈O₄, phân tử lượng 298,3).
    • Chất chuẩn đối chứng thương mại: Kirenol chuẩn Dược điển Trung Quốc (SKS: 111726-200601, hàm lượng 100%).
  • Phạm vi không gian và thời gian:
    • Mẫu Hy thiêm: 08 mẫu (HT1 – HT8) thu hái từ tháng 06/2019 đến tháng 05/2022 tại Thanh Hóa (Thạch Thành, TP. Thanh Hóa), Hà Tĩnh (Thạch Hà), và Hòa Bình. Mẫu HT2 (Thạch Thành - Thanh Hóa, 05/2020) được chọn để phân lập darutosid và thẩm định phương pháp.
    • Mẫu Vối: 08 mẫu nụ (NV1 – NV8) và 08 mẫu lá (LV1 – LV8) thu hái từ tháng 04/2019 đến tháng 05/2021 tại 8 tỉnh/thành phố phía Bắc và Bắc Trung Bộ (Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Tĩnh, Yên Bái, Thanh Hóa, Hòa Bình, Hà Nam, Cao Bằng). Mẫu NV5 và LV5 (TP. Thanh Hóa, 05/2019) được dùng để phân lập CO1 và thẩm định phương pháp phân tích.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

  1. Nghiên cứu về Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) và hợp chất diterpenoid:

    • Thành phần hóa học: P. Giang và cộng sự (2005) đã phân lập từ cây Hy thiêm thu hái tại Hà Giang các hợp chất darutigenol, darutosid, 16-O-acetyldarutosid (hythiemosid A), 15-O-acetyldarutosid (hythiemosid B) và ent-(15R),16,19-trihydroxypimar-8(14)-ene 19-O-β-D-glucopyranosid. Goud và cộng sự phân tích hàm lượng darutosid (0,185%) và hythiemosid-A (0,852%) trong Hy thiêm tại Ấn Độ bằng HPLC. Fei Wang và Li-Li Wang phân lập hàng loạt ent-pimarane diterpenoid từ Hy thiêm Trung Quốc bao gồm kirenol, darutosid và các dẫn xuất acetyldarutigenol. XiaoXu Gao và cộng sự (2020) công bố 9 ent-pimarane mới (Siegesbeckia A–I). Yuan Yang và cộng sự phân lập nhóm ent-kaurant diterpenoid.
    • Tác dụng sinh học: Diterpenoid trong Hy thiêm được chứng minh có tác dụng chống viêm và giảm đau cục bộ. Kirenol có tác dụng giảm phù chân chuột tương đương piroxicam gel. Darutosid có khả năng làm lành vết thương, giảm viêm thông qua ức chế sự thâm nhiễm tế bào viêm gắn kết cyclooxygenase-2 (COX-2), đồng thời có hiệu quả trong điều trị bệnh gout cấp tính trên chuột thực nghiệm.

  2. Nghiên cứu về Vối (Cleistocalyx operculatus) và hợp chất chalcon CO1:

    • Thành phần hóa học: Byung Sun Min và cộng sự (2010) phân lập các flavonoid glycosid từ Vối. Phương Thiện Thương và cộng sự (2013) phân lập 14 hợp chất flavonoid từ nụ Vối, xác định CO1 là thành phần chính chiếm tỷ lệ lớn cùng với các chalcon và flavanon có nhóm thế methyl hoặc formyl ở vòng A. Liu Wen-Jun và cộng sự (2018) phân lập auron mới và CO1, chứng minh hoạt tính ức chế PGE₂ của CO1 (IC₅₀ = 6,12 nmol/l) mạnh hơn ibuprofen (IC₅₀ = 68,66 nmol/l).
    • Phương pháp chiết tách CO1: Nguyễn Quốc Tuấn (2012) chiết ngâm cồn từ nụ Vối, tinh chế qua sắc ký cột silica gel thu được 4,3 g CO1. Trương Thị Tố Chinh chiết từ lá Vối thu được 407 mg CO1. Huỳnh Như Tuấn kết hợp sắc ký silica gel và Sephadex LH-20 thu được 1,6 g CO1. Jin Woo Choi và Takashi Izumi cũng đã tiến hành phân lập CO1 từ nụ và lá Vối với quy mô phòng thí nghiệm.

  3. Nguyên tắc và hướng dẫn thiết lập chất chuẩn hóa học:

    • Hướng dẫn của WHO (Technical Report Series No. 943, Annex 3) và tiêu chuẩn ISO Guide 35 phân loại chất chuẩn thành: Chất chuẩn hóa học gốc (PCRS), Chất chuẩn hóa học thứ cấp (SCRS) và Chất đánh dấu (Marker).
    • Yêu cầu kỹ thuật đối với chất chuẩn gốc định lượng: Xác định cấu trúc toàn diện bằng các phương pháp phổ (NMR 1D/2D, MS, IR, UV-Vis); xác định độ tinh khiết thông qua việc định lượng các loại tạp chất độc lập (tạp chất liên quan bằng HPLC-DAD, tạp chất bay hơi bằng sấy khô hoặc TGA, tạp chất vô cơ bằng tro sulfat).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có các công trình nghiên cứu chiết tách darutosid và CO1, quy trình tinh chế trước đây thường qua nhiều bước phân đoạn phức tạp, hiệu suất chưa cao, chưa tối ưu hóa để thu được sản lượng lớn phục vụ sản xuất chất chuẩn. Quan trọng hơn, chưa có công trình nào tại Việt Nam tiến hành xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đầy đủ, đánh giá tính đồng nhất, độ ổn định và xác định giá trị ấn định kèm độ không đảm bảo đo cho darutosid và CO1 theo đúng hướng dẫn của ISO Guide 35 và WHO để thiết lập chúng thành các Chất chuẩn hóa học gốc. Đồng thời, DĐVN V chưa có phương pháp sắc ký HPLC định lượng đồng thời cả hai chất diterpenoid chính trong Hy thiêm và chưa có phương pháp định lượng CO1 trong nụ và lá Vối.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và nguyên tắc xác định hàm lượng chất chuẩn gốc

Theo hướng dẫn của WHO và Dược điển Châu Âu (EP), hàm lượng ấn định (GTAĐ) của chất chuẩn hóa học gốc dùng cho mục đích định lượng được xác định theo phương pháp cân bằng khối lượng (mass balance approach) dựa trên công thức:

$$\text{Hàm lượng (%)} = \frac{% \text{ Độ tinh khiết sắc ký} \times (100 - % \text{ Tạp bay hơi} - % \text{ Tạp vô cơ})}{100}$$

Trong đó:

  • Độ tinh khiết sắc ký (% TKSK): Xác định bằng kỹ thuật HPLC-DAD qua phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (100% trừ tổng % diện tích các pic tạp chất liên quan).
  • Tạp chất bay hơi (%): Xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hoặc phân tích nhiệt trọng lượng (TGA).
  • Tạp chất vô cơ (%): Xác định bằng phương pháp tro sulfat nung ở nhiệt độ cao.
  • Phương pháp bổ trợ: Quét nhiệt vi sai (DSC) dùng để đánh giá điểm nóng chảy và độ tinh khiết nhiệt của hợp chất kết tinh dạng rắn.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích

  1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế:

    • Darutosid: Chiết xuất bột dược liệu Hy thiêm bằng cồn 96% ở nhiệt độ phòng; cô thu hồi dung môi; phân tán cắn trong nước và chiết phân đoạn lỏng - lỏng với ethyl acetat. Tinh chế darutosid từ cao ethyl acetat bằng sắc ký cột silica gel pha thường và sắc ký cột silica gel pha đảo (RP-18).
    • CO1: Chiết ngâm lạnh nụ Vối bằng ethanol 96%; cô cắn; phân tán trong nước, rửa loại tạp kém phân cực bằng n-hexan, sau đó chiết phân đoạn bằng ethyl acetat. Cao ethyl acetat được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thuận và tinh chế phân đoạn giàu CO1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Preparative HPLC).

  2. Xác định cấu trúc hóa học:

    • Đo điểm nóng chảy và phân tích nhiệt quét vi sai (DSC).
    • Quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) trong dung môi methanol.
    • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).
    • Khối phổ phân giải cao (HR-LC-ESI-MS) và MS/MS.
    • Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ 1D ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT) và phổ 2D (COSY, HSQC, HMBC) trên máy Bruker 500 MHz và 600 MHz.

  3. Thiết lập và thẩm định quy trình kiểm tra chất lượng chất chuẩn:

    • Kiểm tra độ đồng nhất trong quá trình đóng lọ: Chọn ngẫu nhiên các lọ đầu, giữa và cuối quá trình đóng gói; phân tích hàm lượng TKSK bằng HPLC; đánh giá bằng phân tích phương sai (ANOVA) hoặc kiểm định Fisher ($F_{\text{tính}} < F_{\text{bảng}}$).
    • Đánh giá độ ổn định: Theo dõi hàm lượng chất chuẩn trong điều kiện bảo quản thực tế và gia tốc theo thời gian.
    • Tính toán độ không đảm bảo đo ($U$) mở rộng với hệ số phủ $k = 2$ (độ tin cậy 95%).

  4. Thẩm định quy trình định tính, định lượng trên dược liệu bằng HPLC:

    • Thực hiện theo hướng dẫn của Hội nghị Quốc tế về Hòa hợp (ICH) và AOAC với các chỉ tiêu: Tính thích hợp của hệ thống, độ đặc hiệu/chọn lọc, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng (tỷ lệ phục hồi), độ lặp lại (RSD), độ chính xác trung gian (giữa 2 kiểm nghiệm viên/2 ngày khác nhau), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

Dữ liệu và vật liệu nghiên cứu

  • Trang thiết bị chính: Hệ thống HPLC Agilent 1260 DAD, Waters Alliance, Shimadzu Prominence 20A; Hệ thống HPLC điều chế Shimadzu LC-20AP/CBM-20A; Máy DSC Shimadzu DSC-60; Máy quang phổ FT-IR; Cân phân tích Mettler Toledo XPE-26 (độ phân giải $1\ \mu\text{g}$).
  • Mẫu kiểm nghiệm: 08 mẫu Hy thiêm (HT1 - HT8), 08 mẫu nụ Vối (NV1 - NV8), 08 mẫu lá Vối (LV1 - LV8).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp có hệ thống cơ sở lý luận và thực tiễn về chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu, hệ thống phân loại chất chuẩn theo WHO và ISO Guide 35. Tác giả tổng quan chi tiết về vị trí phân loại thực vật, đặc điểm hình thái, vùng phân bố, thành phần hóa học chính và các nghiên cứu dược lý của hai cây thuốc Siegesbeckia orientalis L. (họ Asteraceae) và Cleistocalyx operculatus (Roxb. et Perry) (họ Myrtaceae). Chương này phân tích chi tiết cấu trúc phân tử của nhóm ent-pimarane diterpenoid (đặc biệt là kirenol và darutosid) cùng nhóm chalcon (đặc biệt là CO1), đồng thời tổng thuật các phương pháp phân lập, các chỉ tiêu kiểm soát chất lượng trong các dược điển hiện hành (DĐVN V, Dược điển Trung Quốc, Dược điển Châu Âu, Dược điển Nhật Bản, Tiêu chuẩn Hồng Kông). Qua đó, chương 1 khẳng định sự cần thiết phải thiết lập chất chuẩn hóa học gốc darutosid và CO1 nhằm phục vụ nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm Hy thiêm và Vối tại Việt Nam.

Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc, địa điểm thu hái và mã hóa các mẫu dược liệu Hy thiêm (HT1 đến HT8) và Vối (NV1 đến NV8, LV1 đến LV8) được giám định tên khoa học tại Viện Dược liệu. Chương này trình bày toàn bộ hóa chất, dung môi phân tích, trang thiết bị chuyên dụng đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP; sơ đồ tổng thể các bước tiến hành nghiên cứu từ chiết xuất, tinh chế, xây dựng dữ liệu phổ, thẩm định phương pháp xác định tạp chất, đóng lọ, đánh giá độ đồng nhất, xác định giá trị ấn định, đến thẩm định quy trình định tính, định lượng trên nền dược liệu thực tế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Đối tượng Ký hiệu mẫu Địa điểm thu hái Thời gian thu hái
Hy thiêm HT1 Thạch Thành, Thanh Hóa Tháng 06/2019
HT2 Thạch Thành, Thanh Hóa (Vùng trồng Dược VTYT Thanh Hóa) Tháng 05/2020
HT3 TP. Thanh Hóa (TT Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung Bộ) Tháng 04/2020
HT4 Thạch Thành, Thanh Hóa Tháng 05/2021
HT5 TP. Thanh Hóa Tháng 05/2021
HT6 Thạch Hà, Hà Tĩnh Tháng 06/2020
HT7 TP. Hòa Bình Tháng 06/2021
HT8 Thạch Thành, Thanh Hóa Tháng 05/2022
Nụ Vối & Lá Vối NV1 / LV1 TP. Bắc Giang, Bắc Giang Tháng 05/2021
NV2 / LV2 TP. Hưng Yên, Hưng Yên Tháng 04/2019
NV3 / LV3 Cẩm Xuyên, Hà Tĩnh Tháng 04/2021
NV4 / LV4 TP. Yên Bái, Yên Bái Tháng 04/2020
NV5 / LV5 TP. Thanh Hóa, Thanh Hóa Tháng 05/2019
NV6 / LV6 Đà Bắc, Hòa Bình Tháng 04/2019
NV7 / LV7 Lý Nhân, Hà Nam Tháng 04/2019
NV8 / LV8 TP. Cao Bằng, Cao Bằng Tháng 05/2020

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

1. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc chất chuẩn

  • Darutosid: Tinh chế từ cao ethyl acetat của mẫu Hy thiêm HT2 qua sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18, thu được bột vô định hình màu trắng ngà. Dữ liệu phổ UV-Vis ($\lambda_{\max}$ tại 205 nm), phổ FT-IR (các dải hấp thụ đặc trưng cho nhóm -OH, C-H bão hòa, C=C), phổ HR-LC-ESI-MS và NMR một chiều, hai chiều ($^1\text{H-NMR}$ 600 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ 150 MHz) hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc darutosid ($C_{26}H_{44}O_8$).
  • CO1: Tinh chế từ nụ Vối NV5 bằng sắc ký cột pha thuận kết hợp HPLC điều chế pha đảo (cột Shim-pack RP18), thu được tinh thể màu vàng cam. Cấu trúc được xác định là 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon ($C_{18}H_{18}O_4$) thông qua phân tích nhiệt vi sai DSC (pic nóng chảy sắc nhọn tại $126^\circ\text{C}$), phổ UV-Vis ($\lambda_{\max}$ tại 338 nm), phổ IR (pic liên kết carbonyl và OH liên kết hydro), phổ MS và NMR ($^1\text{H-NMR}$ 500 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ 125 MHz).

2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu và thiết lập chất chuẩn gốc

  • Thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan (TCLQ) bằng HPLC-DAD:
    • Đối với darutosid: Phương pháp HPLC sử dụng đầu dò DAD phân tách hoàn toàn darutosid khỏi các pic tạp chất liên quan; tính thích hợp hệ thống đạt yêu cầu ($RSD < 1%$ đối với diện tích pic và thời gian lưu); độ tuyến tính cao; giới hạn phát hiện LOD và định lượng LOQ được xác định rõ ràng.
    • Đối với CO1: Phương pháp HPLC-DAD chứng minh tính đặc hiệu cao, tách riêng pic CO1 với các tạp chất phân hủy và tạp chất liên quan.
Chỉ tiêu đánh giá chất chuẩn Chất chuẩn Darutosid Chất chuẩn CO1
Cảm quan Bột vô định hình màu trắng ngà Tinh thể/bột màu vàng cam
Độ đồng nhất đóng lọ ($F_{\text{tính}}$ so với $F_{\text{bảng}}$) $F_{\text{tính}} < F_{\text{bảng}}$ (Đạt độ đồng nhất) $F_{\text{tính}} < F_{\text{bảng}}$ (Đạt độ đồng nhất)
Độ tinh khiết sắc ký (% TKSK) Xác định bằng HPLC-DAD Xác định bằng HPLC-DAD
Tạp chất bay hơi (Mất khối lượng/TGA) Xác định bằng TGA/sấy khô Xác định bằng TGA/sấy khô
Tạp chất vô cơ (Tro sulfat) Kiểm tra cắn vô cơ Kiểm tra cắn vô cơ
Giá trị ấn định hàm lượng (GTAĐ) Công bố trên chứng chỉ chuẩn gốc Công bố trên chứng chỉ chuẩn gốc
Theo dõi độ ổn định Ổn định ở điều kiện bảo quản quy định Ổn định ở điều kiện bảo quản quy định

3. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích trên dược liệu

  • Quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC:
    • Khảo sát tối ưu hóa dung môi chiết xuất mẫu và điều kiện sắc ký pha đảo.
    • Thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn ICH: Độ đặc hiệu tốt (không có hiện tượng chồng pic tạp tại thời gian lưu của kirenol và darutosid); độ đúng đạt tỷ lệ phục hồi trong khoảng quy định; độ lặp lại và độ chính xác trung gian có $RSD < 2%$.
    • Khảo sát trên 08 mẫu Hy thiêm (HT1 - HT8): Hàm lượng darutosid chiếm tỷ lệ ưu thế rõ rệt trong các mẫu dược liệu thu hái tại Việt Nam so với hàm lượng kirenol.
  • Quy trình định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC:
    • Xây dựng quy trình xử lý mẫu tối ưu cho cả hai bộ phận dùng.
    • Thẩm định phương pháp chứng minh tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian đạt tiêu chuẩn phân tích định lượng dược liệu.
    • Khảo sát hàm lượng trên 08 mẫu nụ (NV1 - NV8) và 08 mẫu lá (LV1 - LV8): Xác nhận CO1 có hàm lượng cao trong nụ Vối (dao động trong khoảng 1,32% – 1,86%) và có mặt ổn định trong lá Vối (dao động khoảng 0,43% – 0,49%).

Chương 4: Bàn luận

Chương Bàn luận tập trung phân tích sâu các khía cạnh khoa học và kỹ thuật:

  • Về chiết xuất và tinh chế: So sánh hiệu quả của việc kết hợp sắc ký phân đoạn lỏng - lỏng với HPLC điều chế so với các nghiên cứu cổ điển trước đây. Tác giả luận giải việc lựa chọn phân đoạn ethyl acetat là tối ưu nhất để thu hồi darutosid và CO1 với hàm lượng và độ sạch cao.
  • Về phương pháp xác định độ tinh khiết và giá trị ấn định: Bàn luận về tính ưu việt của phương pháp cân bằng khối lượng (mass balance) theo khuyến cáo của WHO và EP so với việc chỉ dựa thuần túy vào diện tích pic sắc ký. Luận án phân tích chi tiết ảnh hưởng của tạp chất bay hơi và tạp chất vô cơ đến độ chính xác của giá trị ấn định công bố trên chứng thư chất chuẩn.
  • Về ứng dụng thực tiễn: Bàn luận về sự phân bố hàm lượng diterpenoid trong các mẫu Hy thiêm Việt Nam, khẳng định việc đưa chỉ tiêu định lượng đồng thời cả darutosid và kirenol vào Dược điển Việt Nam là yêu cầu khoa học cấp thiết, tránh việc đánh giá sai lệch chất lượng dược liệu nếu chỉ dựa vào một chỉ tiêu kirenol như Dược điển Trung Quốc. Đối với Vối, kết quả định lượng CO1 cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm tin cậy để lần đầu tiên xây dựng tiêu chuẩn định lượng hoạt chất cho nụ và lá Vối trong DĐVN.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Luận án đã áp dụng thành công quy trình khoa học, chặt chẽ theo tiêu chuẩn ISO Guide 35 và hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) để thiết lập 02 chất chuẩn hóa học gốc (Primary Chemical Reference Standard - PCRS) từ nguồn dược liệu trong nước là darutosid (từ Hy thiêm) và CO1 (từ nụ Vối).
  2. Xây dựng và công bố bộ dữ liệu phổ cấu trúc hoàn chỉnh, có độ phân giải cao ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, HR-LC-ESI-MS, FT-IR, UV-Vis, DSC) cho nguyên liệu chuẩn darutosid và CO1, làm cơ sở đối chiếu định danh tin cậy cho các nghiên cứu kiểm nghiệm sau này.
  3. Cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm về sự hiện diện ưu thế của darutosid trong các quần thể Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) sinh trưởng tại Việt Nam, đóng góp vào nhận thức về hóa thực vật học và kiểm soát chất lượng dược liệu theo vùng địa lý.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Cung cấp 02 chất chuẩn hóa học gốc darutosid và CO1 kèm theo đầy đủ hồ sơ thiết lập chuẩn (tiêu chuẩn cơ sở, quy trình kiểm tra chất lượng, đánh giá độ đồng nhất đóng lọ, độ ổn định và chứng chỉ phân tích với giá trị ấn định có độ không đảm bảo đo xác định), sẵn sàng cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm thuốc trên toàn quốc.
  2. Xây dựng và thẩm định thành công 02 quy trình phân tích định lượng bằng HPLC có độ đặc hiệu, độ đúng và độ lặp lại cao:
    • Quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong dược liệu Hy thiêm.
    • Quy trình định tính, định lượng CO1 trong dược liệu nụ Vối và lá Vối.
  3. Đóng góp dữ liệu phân tích thực tế trên các lô mẫu thu thập tại nhiều địa phương, làm cơ sở trực tiếp để đề xuất sửa đổi, nâng cấp và hoàn thiện các chuyên luận Hy thiêm, Nụ Vối và Lá Vối trong Dược điển Việt Nam các lần xuất bản tiếp theo.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề nghị Hội đồng Dược điển Việt Nam xem xét bổ sung chỉ tiêu định tính và định lượng đồng thời darutosid và kirenol bằng phương pháp HPLC vào chuyên luận Hy thiêm; bổ sung chỉ tiêu định tính, định lượng CO1 bằng HPLC vào chuyên luận Nụ Vối và Lá Vối trong DĐVN.
  • Đề xuất Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tiếp tục duy trì, bảo quản và định kỳ đánh giá lại độ ổn định của các lô chất chuẩn gốc darutosid và CO1 đã thiết lập, đồng thời triển khai sản xuất chất chuẩn thứ cấp (SCRS) phục vụ nhu cầu thường xuyên của các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án: Số lượng mẫu dược liệu khảo sát (08 mẫu Hy thiêm, 08 mẫu nụ Vối và 08 mẫu lá Vối) chủ yếu tập trung tại một số tỉnh thuộc khu vực miền Bắc và Bắc Trung Bộ, chưa bao phủ toàn bộ các vùng sinh thái trên phạm vi cả nước. Thời gian theo dõi độ ổn định dài hạn của chất chuẩn mới dừng lại ở các mốc thời gian quy định trong khuôn khổ thực hiện luận án.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Mở rộng thu thập và phân tích hàm lượng darutosid, kirenol và CO1 trên các mẫu Hy thiêm và Vối ở các vùng sinh thái miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ nhằm xây dựng bản đồ phân bố hàm lượng hoạt chất toàn diện.
    • Tiếp tục chương trình theo dõi độ ổn định dài hạn (real-time stability) của 02 chất chuẩn gốc darutosid và CO1 ở các điều kiện bảo quản khác nhau.
    • Nghiên cứu mở rộng ứng dụng quy trình phân tích sắc ký đã thiết lập trên các dạng bào chế, chế phẩm thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng có chứa thành phần Hy thiêm và Vối lưu hành trên thị trường.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao cho nhiều nhóm đối tượng:

  • Hệ thống cơ quan kiểm nghiệm dược phẩm (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh, các Trung tâm Kiểm nghiệm tỉnh/thành phố): Cung cấp tài liệu kỹ thuật chuẩn về quy trình thiết lập chất chuẩn từ dược liệu và phương pháp thẩm định quy trình định lượng HPLC.
  • Hội đồng Dược điển Việt Nam và các nhà quản lý dược: Cung cấp số liệu thực nghiệm và dự thảo phương pháp phân tích để hoàn thiện và nâng cấp các chuyên luận dược liệu trong Dược điển Việt Nam.
  • Các viện nghiên cứu, trường đại học đào tạo khối ngành Dược (Bộ môn Kiểm nghiệm thuốc, Hóa dược, Dược liệu): Là tài liệu tham khảo cho giảng viên, nghiên cứu sinh, học viên cao học về phương pháp phân lập hợp chất tự nhiên, giải đoán phổ cấu trúc 1D/2D NMR, và quy trình thiết lập chuẩn hóa học theo hướng dẫn quốc tế (ISO Guide 35, WHO).
  • Các doanh nghiệp sản xuất thuốc từ dược liệu: Cung cấp phương pháp phân tích kiểm soát chất lượng đầu vào của nguyên liệu Hy thiêm, Nụ Vối, Lá Vối và quy trình chiết xuất hoạt chất tinh khiết.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao luận án lựa chọn thiết lập chất chuẩn darutosid thay vì chỉ sử dụng kirenol cho dược liệu Hy thiêm?

Dược điển Trung Quốc và Tiêu chuẩn Hồng Kông định lượng Hy thiêm theo chất đánh dấu kirenol. Tuy nhiên, các nghiên cứu thực nghiệm tại Việt Nam chỉ ra rằng nhiều mẫu Hy thiêm thu hái trong nước chứa rất ít hoặc không phát hiện thấy kirenol, nhưng lại có hàm lượng đáng kể darutosid. Darutosid là một diterpenoid đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm đau và làm lành vết thương tương đương kirenol. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn darutosid và xây dựng quy trình định lượng đồng thời cả darutosid và kirenol là cần thiết để đánh giá đúng chất lượng nguồn dược liệu Hy thiêm Việt Nam.

2. Hợp chất CO1 phân lập từ cây Vối có tên hóa học đầy đủ và đặc điểm lý hóa như thế nào?

Hợp chất CO1 có tên khoa học đầy đủ là 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcon (công thức phân tử $C_{18}H_{18}O_4$, khối lượng mol 298,3 g/mol). Đây là một dẫn xuất flavonoid thuộc nhóm chalcon, tồn tại ở dạng tinh thể hoặc bột màu vàng cam, dễ tan trong aceton, chloroform, isopropanol, có nhiệt độ nóng chảy khoảng $126^\circ\text{C}$ (xác định bằng phương pháp quét nhiệt vi sai DSC). Hợp chất này có hoạt tính chống viêm, chống oxy hóa, phục hồi tế bào gan và ức chế hấp thu glucose.

3. Công thức xác định giá trị ấn định hàm lượng chất chuẩn gốc định lượng trong luận án được tính toán như thế nào?

Theo hướng dẫn của WHO và ISO Guide 35, giá trị ấn định hàm lượng của chất chuẩn gốc được tính theo phương pháp cân bằng khối lượng (mass balance):

$$\text{Hàm lượng (%)} = \frac{% \text{ Độ tinh khiết sắc ký} \times (100 - % \text{ Tạp bay hơi} - % \text{ Tạp vô cơ})}{100}$$

Trong đó, độ tinh khiết sắc ký được xác định bằng HPLC-DAD qua phương pháp chuẩn hóa diện tích pic; tạp chất bay hơi xác định bằng phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) hoặc sấy khô; tạp chất vô cơ xác định bằng phương pháp tro sulfat.

4. Những kỹ thuật phổ nào đã được sử dụng để khẳng định cấu trúc của darutosid và CO1?

Để nhận dạng và xác định công thức cấu tạo của darutosid và CO1, luận án đã sử dụng tổ hợp các phương pháp quang phổ hiện đại:

  • Quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis).
  • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR).
  • Khối phổ phân giải cao (HR-LC-ESI-MS) và MS/MS.
  • Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC) trên thiết bị tần số 500 MHz và 600 MHz.

5. Phạm vi thu thập các mẫu dược liệu Hy thiêm và Vối trong nghiên cứu bao gồm những khu vực nào?

Nghiên cứu tiến hành thu thập 08 mẫu Hy thiêm (HT1 – HT8) từ năm 2019 đến năm 2022 tại Thanh Hóa (huyện Thạch Thành và TP. Thanh Hóa), Hà Tĩnh (huyện Thạch Hà), và Hòa Bình. Đối với Vối, 08 mẫu nụ (NV1 – NV8) và 08 mẫu lá (LV1 – LV8) được thu thập từ năm 2019 đến năm 2021 tại 8 tỉnh/thành phố gồm Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Tĩnh (Cẩm Xuyên), Yên Bái, Thanh Hóa, Hòa Bình (Đà Bắc), Hà Nam (Lý Nhân), và Cao Bằng. Tất cả các mẫu đều được định danh thực vật tại Viện Dược liệu.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc chiết xuất, tinh chế và thiết lập thành công 02 chất chuẩn hóa học gốc đạt chuẩn quốc tế là darutosid (từ Hy thiêm) và CO1 (từ nụ Vối). Công trình đã xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng phổ cấu trúc toàn diện, xác định giá trị ấn định hàm lượng và thẩm định các quy trình sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phục vụ định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu thực tế. Các kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn trực tiếp để nâng cấp, hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng cho Hy thiêm và Vối trong Dược điển Việt Nam, đóng góp thiết thực cho công tác kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu trong nước.