Tổng quan nghiên cứu

Cao khô lá Bạch quả (Ginkgo biloba L.) chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế (EGb 761) chứa khoảng 24% flavonoid glycosid và 6% terpen lacton, là thành phần chủ lực trong hơn 80% sản phẩm hỗ trợ tuần hoàn não trên thị trường với liều dùng phổ biến từ 40 mg đến 120 mg/đơn vị phân liều. Trong khi nhóm flavonoid phân bố rộng ở nhiều loài thực vật khác và dễ bị làm giả, các hợp chất terpen lacton (bao gồm bilobalid, ginkgolid A, ginkgolid B, ginkgolid C) là hoạt chất chỉ thị sinh học đặc hữu duy nhất của cây Bạch quả.

Thực tế kiểm nghiệm hiện nay cho thấy đa số thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) lưu hành tại Việt Nam chỉ công bố hàm lượng cao hoặc định lượng flavonoid toàn phần mà chưa kiểm soát hàm lượng terpen lacton, do thiếu quy chuẩn kỹ thuật quốc gia chính thức cho các dạng bào chế phức tạp như viên nang mềm chứa dầu đậu nành, sáp ong hoặc viên nén đa thành phần. Trước khoảng trống pháp lý và kỹ thuật này, luận văn thạc sĩ dược học chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất (mã số 8720210) của học viên Dương Thế Bắc tại Trường Đại học Dược Hà Nội (năm 2025) đã thực hiện đề tài nhằm:

  • Xây dựng và thẩm định toàn diện quy trình định tính, định lượng đồng thời 4 terpen lacton trong TPBVSK bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi (HPLC-ELSD) trên 2 dạng nền mẫu rắn và dầu theo hướng dẫn AOAC International.
  • Khảo sát thực trạng chất lượng của 13 mẫu TPBVSK, 4 mẫu thuốc và 2 mẫu nguyên liệu cao khô lưu hành trên thị trường Hà Nội.

Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn cấp thiết khi cung cấp quy trình phân tích chuẩn hóa có độ thu hồi từ 92,4% đến 105,3%, hỗ trợ trực tiếp các cơ quan quản lý dược phẩm và an toàn thực phẩm siết chặt chất lượng sản phẩm bổ não.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) kết hợp nguyên lý phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD). Do các phân tử terpen lacton không chứa hệ liên kết đôi liên hợp hoặc nhân thơm, chúng hấp thụ bức xạ tử ngoại (UV) rất yếu ở bước sóng ngắn (dưới 220 nm), dễ bị ảnh hưởng bởi tạp chất nền và dung môi. Đầu dò ELSD khắc phục triệt để nhược điểm này thông qua 3 giai đoạn: tạo sương aerosol từ dịch rửa giải, bay hơi pha động trong buồng gia nhiệt ở 80 °C và đo cường độ ánh sáng tán xạ từ các hạt chất phân tích bằng cảm biến quang. Tín hiệu đo tuân theo hàm phi tuyến $S = a \cdot C^b$, được tuyến tính hóa qua mô hình hồi quy logarit $\ln(S) = a \ln(C) + b$.

Đề tài áp dụng khung đánh giá thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn AOAC International (Appendix K - 2019) cho nền mẫu thực phẩm chức năng và dược liệu, đối chiếu trực tiếp với các chuyên luận Dược điển Việt Nam V (DĐVN V), Dược điển Mỹ (USP 47-NF 42) và Dược điển Trung Quốc 2020. Tiêu chuẩn USP quy định tổng hàm lượng 4 terpen lacton trong cao khô lá Bạch quả chuẩn hóa phải đạt từ 5,4% đến 12,0% tính theo chế phẩm khô kiệt.

Phương pháp nghiên cứu

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Nhóm tác giả thu thập 19 mẫu nghiên cứu ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội hoặc tiếp nhận tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội, gồm 13 mẫu TPBVSK (5 mẫu viên nén, 3 mẫu viên nang cứng, 5 mẫu viên nang mềm có hàm lượng công bố từ 5 mg đến 150 mg cao/viên), 4 mẫu thuốc thành phẩm và 2 mẫu cao khô nguyên liệu.
  • Quy trình xử lý mẫu tối ưu: Mẫu dạng rắn (nghiền mịn 20 viên) hoặc dịch dầu (đồng nhất 20 viên) được cân chính xác 1,0 g, hòa tan trong 10 mL dung dịch đệm phosphat pH 5,8 và lắc 5 phút. Dịch chiết được chuyển lên cột chiết pha lỏng trên chất mang rắn (cột Chem Elut 20 mL nhồi đất silic), để yên 15 phút, sau đó rửa giải 5 lần bằng 100 mL ethyl acetat. Dịch rửa giải được cô cách thủy ở 60 °C đến cắn khô, hòa tan lại bằng methanol 50% vào bình định mức 20,0 mL và lọc qua màng lọc 0,45 µm. Kỹ thuật này giúp loại bỏ triệt để chất béo, sáp ong và tá dược dính, ngăn ngừa hiện tượng nhũ hóa so với chiết lỏng - lỏng cổ điển.
  • Điều kiện sắc ký HPLC-ELSD: Phân tích thực hiện trên hệ thống Shimadzu 40Dx3 kết nối detector ELSD; cột pha đảo InertSustain C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 µm); pha động Methanol - Nước rửa giải gradient tuyến tính từ 25% đến 48% Methanol trong 45 phút, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL; nhiệt độ đầu dò ELSD 80 °C, độ khuếch đại tín hiệu (gain) mức 10 và áp suất khí nén cố định 3,5 bar. Toàn bộ nghiên cứu hoàn thành trong khung thời gian 2024 - 2025.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Độ đặc hiệu và độ thích hợp hệ thống vượt trội: Sắc ký đồ phân tách hoàn toàn 4 pic hoạt chất riêng biệt mà không bị cản trở bởi mẫu trắng hay tá dược nền. Thời gian lưu trung bình lần lượt là Bilobalid (13,05 phút), Ginkgolid C (16,83 phút), Ginkgolid A (26,29 phút) và Ginkgolid B (28,20 phút). Số đĩa lý thuyết đạt từ 19.101 đến 50.273 đĩa (vượt xa yêu cầu tối thiểu 15.000 đĩa), hệ số kéo đuôi cân đối từ 0,904 đến 1,152 và độ phân giải giữa các pic lân cận đạt tối thiểu $R_s = 2,8$.
  2. Khoảng tuyến tính và độ nhạy phân tích cao: Khoảng tuyến tính logarit $\ln(S) - \ln(C)$ được xác lập từ 10 µg/mL đến 500 µg/mL cho cả 4 hoạt chất với hệ số tương quan $R^2 \ge 0,994$. Độ chệch các điểm nồng độ đều nằm trong khoảng ±15% (tại LOQ đạt 16,0% - 18,0%, dưới ngưỡng ±20% theo AOAC). Giới hạn phát hiện (LOD) trên mẫu rắn là 0,048 - 0,058 mg/g và mẫu dầu là 0,041 - 0,052 mg/g. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được thiết lập ở mức 0,20 mg/g (tương đương 10,0 µg/mL trong dịch đo).
  3. Độ đúng và độ chụm đạt chuẩn quốc tế: Thử nghiệm độ thu hồi trên mẫu tự tạo ở 4 mức nồng độ (10, 50, 200, 400 µg/mL) đạt từ 97,7% đến 105,3% trên nền rắn (RSD 0,41% - 2,07%) và từ 92,4% đến 103,4% trên nền dầu (RSD 0,47% - 2,78%). Độ lặp lại nội bộ ($RSD_r$) đạt từ 1,09% đến 1,83% (yêu cầu < 3,0%), độ chính xác trung gian khác ngày/khác kiểm nghiệm viên ($RSD_R$, $n=12$) đạt từ 1,65% đến 2,96% (yêu cầu < 6,0%).
  4. Thực trạng bất cập về chất lượng chế phẩm thương mại: Khảo sát 13 mẫu TPBVSK cho thấy có 3/13 mẫu (tỷ lệ 23,08%) không đạt yêu cầu hàm lượng terpen lacton theo tiêu chuẩn USP. Đáng chú ý, mẫu viên nén VN1 hoàn toàn không phát hiện 4 terpen lacton (< LOD) dù nhãn ghi chứa 5 mg cao; mẫu viên nang cứng VNC3 không có bilobalid; mẫu viên nang mềm VNM2 chỉ chứa vết terpen lacton dưới mức LOQ. Tỷ lệ terpen lacton thực tế quy đổi theo lượng cao công bố dao động bất thường từ 0% đến 10,3%. Ngược lại, cả 4 mẫu thuốc và 2 mẫu nguyên liệu cao khô đều đạt chuẩn USP (chứa 5,4% - 12,0% terpen lacton).

Thảo luận kết quả

Kết quả thực nghiệm cho thấy quy trình xử lý mẫu qua cột Chem Elut giữ vai trò quyết định trong việc giải phóng hoạt chất khỏi mạng lưới tá dược kỵ nước dạng dầu (gelatin, lecithin, dầu cọ), mang lại độ thu hồi vượt trội 101,7% so với 75,4% của phương pháp chiết lỏng - lỏng thông thường. Dữ liệu phân tích thực tế có thể được trực quan hóa sinh động qua biểu đồ phân bố tỷ lệ 4 thành phần hoạt chất trong 13 mẫu TPBVSK hoặc bảng so sánh hiệu suất thu hồi giữa các nền mẫu.

Khi đối chiếu với phương pháp UHPLC-MS/MS của một nghiên cứu gần đây trong nước, phương pháp HPLC-ELSD của đề tài cho độ chính xác tương đương trên dải nồng độ 10 - 500 µg/mL nhưng tiết kiệm chi phí đầu tư thiết bị và bảo trì khoảng 60%, hóa chất vận hành đơn giản (Methanol - Nước), phù hợp triển khai đại trà tại mạng lưới kiểm nghiệm tuyến tỉnh. Sự chênh lệch lớn về hàm lượng hoạt chất giữa các nhãn hàng chứng minh lỗ hổng trong việc chỉ kiểm soát tiêu chuẩn chất lượng theo flavonoid toàn phần.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Ban hành Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia: Bộ Y tế và Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cần xây dựng và ban hành Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia (QCVN) về thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa cao Bạch quả trước quý IV/2026, trong đó bắt buộc bổ sung chỉ tiêu định lượng tổng 4 terpen lacton (Bilobalid, Ginkgolid A, B, C) đạt tỷ lệ tối thiểu 5,4% theo khối lượng cao công bố.
  2. Triển khai thường quy kiểm nghiệm đồng bộ: Các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm - Thực phẩm tại 63 tỉnh, thành phố cần ứng dụng quy trình phân tích HPLC-ELSD (mã hiệu TQKT/HPLC/043 đã được ban hành tại Hà Nội) vào công tác kiểm tra định kỳ từ năm 2025, nhằm chuẩn hóa năng lực phân tích nền mẫu dầu mỡ phức tạp với mục tiêu kiểm soát 100% mẫu nghi ngờ.
  3. Thắt chặt kiểm soát nguyên liệu đầu vào: Các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm bắt buộc phải thẩm định nhà cung ứng cao khô lá Bạch quả, yêu cầu phiếu kiểm nghiệm (CoA) thể hiện rõ hàm lượng terpen lacton đạt ngưỡng 5,4% - 12,0% theo USP trước khi đưa vào dây chuyền sản xuất từ quý II/2025.
  4. Tăng cường hậu kiểm và xử lý vi phạm nhãn: Cục An toàn thực phẩm phối hợp Cục Quản lý Dược tăng cường tần suất lấy mẫu hậu kiểm ngẫu nhiên trên thị trường ít nhất 4 đợt/năm; xử phạt nghiêm và thu hồi các lô sản phẩm không có hoạt chất đặc trưng hoặc gian lận hàm lượng cao khô.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Kiểm nghiệm viên và chuyên viên phân tích tại các phòng thí nghiệm: Nắm vững quy trình xử lý nền mẫu viên nang mềm phức tạp bằng cột Chem Elut, phương pháp tối ưu hóa thông số detector ELSD (nhiệt độ 80 °C, áp suất 3,5 bar) và kỹ thuật thẩm định phương pháp sắc ký theo AOAC.
  2. Cán bộ nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các nhà máy Dược - TPBVSK: Ứng dụng phương pháp để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm mới, kiểm soát chất lượng nguyên liệu cao khô lá Bạch quả đầu vào và tối ưu hóa độ ổn định của hoạt chất trong dạng bào chế viên nén, viên nang.
  3. Cơ quan quản lý nhà nước và nhà hoạch định chính sách y tế: Sử dụng bộ số liệu thực chứng 23,08% mẫu TPBVSK không đạt chuẩn làm cơ sở khoa học để ban hành quy định pháp lý, siết chặt quản lý hoạt chất chỉ thị sinh học trong thực phẩm chức năng.
  4. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Dược/Hóa phân tích: Tài liệu học thuật chuyên sâu phục vụ giảng dạy và nghiên cứu về sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ/ELSD, kỹ thuật hồi quy phi tuyến tính và quy trình chuẩn hóa dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phải sử dụng đầu dò ELSD thay vì đầu dò UV/DAD để định lượng terpen lacton? Các terpen lacton trong lá Bạch quả thiếu hệ nối đôi liên hợp nên hấp thụ tia UV rất yếu ở bước sóng ngắn (< 220 nm), nơi các dung môi hữu cơ và tá dược cũng hấp thụ mạnh gây nhiễu nền nghiêm trọng. Đầu dò ELSD đo trực tiếp tán xạ ánh sáng của hạt chất sau khi bay hơi dung môi ở 80 °C, cho đáp ứng chọn lọc theo khối lượng với LOQ đạt 0,20 mg/g.

2. Kỹ thuật chiết mẫu qua cột Chem Elut có ưu thế gì so với chiết lỏng - lỏng truyền thống? Cột Chem Elut chứa chất mang đất silic giúp giữ pha nước phân cực (đệm phosphat pH 5,8) trên diện tích bề mặt lớn. Khi rửa giải bằng 100 mL ethyl acetat, các terpen lacton được hòa tan chọn lọc và chiết kiệt mà không tạo lớp nhũ tương khó tách với tá dược dầu của viên nang mềm, nâng độ thu hồi lên 98,3% - 102,1%.

3. Vì sao đường chuẩn định lượng bằng HPLC-ELSD phải xây dựng theo phương trình logarit? Trong đầu dò ELSD, cường độ ánh sáng tán xạ phụ thuộc vào nồng độ hạt chất theo hàm mũ $S = a \cdot C^b$. Do đó, việc lấy logarit tự nhiên hai vế biến đổi phương trình về dạng tuyến tính $\ln(S) = a \ln(C) + b$, giúp mở rộng khoảng tuyến tính đo từ 10 µg/mL đến 500 µg/mL với hệ số tương quan $R^2 \ge 0,994$.

4. Quy định quốc tế hiện hành về hàm lượng terpen lacton trong cao lá Bạch quả là bao nhiêu? Theo chuyên luận của Dược điển Mỹ (USP 47-NF 42) và Dược điển Việt Nam V, cao khô lá Bạch quả chuẩn hóa bắt buộc phải chứa tổng hàm lượng 4 terpen lacton (Bilobalid, Ginkgolid A, B, C) từ 5,4% đến 12,0% tính theo chế phẩm khô kiệt.

5. Khảo sát 13 mẫu TPBVSK trên thị trường chỉ ra thực trạng đáng báo động nào? Nghiên cứu phát hiện 23,08% số mẫu TPBVSK thương mại không đạt hàm lượng terpen lacton theo chuẩn USP. Cá biệt có mẫu viên nén hoàn toàn không chứa 4 hoạt chất chỉ thị sinh học, cho thấy sự thiếu kiểm soát trong công bố nhãn và rủi ro nguyên liệu kém chất lượng trên thị trường thực phẩm bổ não.

Kết luận

  • Xây dựng thành công quy trình HPLC-ELSD định tính, định lượng đồng thời 4 terpen lacton (Bilobalid, Ginkgolid A, B, C) trên 2 dạng nền mẫu rắn và dầu của TPBVSK.
  • Thẩm định phương pháp đạt đầy đủ các chỉ tiêu theo AOAC International: khoảng tuyến tính rộng 10 - 500 µg/mL ($R^2 \ge 0,994$), độ thu hồi cao từ 92,4% đến 105,3%, độ lặp lại $RSD_r \le 1,83%$ và độ chính xác trung gian $RSD_R \le 2,96%$.
  • Phát hiện 3/13 mẫu TPBVSK thương mại (23,08%) không đạt tiêu chuẩn hàm lượng terpen lacton theo USP, phản ánh sự bất cập trong công tác kiểm soát nhãn sản phẩm hiện hành.
  • Quy trình nghiên cứu đã được nghiệm thu và ban hành thành thường quy kỹ thuật TQKT/HPLC/043 tại Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội.
  • Kế hoạch giai đoạn 2025 - 2026: Mở rộng kiểm nghiệm trên 100 mẫu chế phẩm toàn quốc và đề xuất Bộ Y tế đưa chỉ tiêu terpen lacton vào quy chuẩn kỹ thuật quốc gia.

Các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và sản xuất dược phẩm có thể ứng dụng ngay quy trình kỹ thuật này để nâng cao chất lượng sản phẩm và bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng.