Luận văn thạc sĩ: Thiết kế và ứng dụng chỉ thị ADN trong xác định gen kháng đạo ôn ở lúa Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua thiết kế và ứng dụng các chỉ thị adn xác định các gen liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất

• Tác giả: Phương Hữu Pha
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Đăng Khánh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết Kế Và Ứng Dụng Các Chỉ Thị ADN Xác Định Các Gen Liên Quan Đến Tính Kháng Đạo Ôn Ở Một Số Giống Lúa Bản Địa Của Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
• 5. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA
• 5.1.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới
• 5.1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam
• 5.2. Tình hình thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn
• 5.2.1. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn trên thế giới
• 5.2.2. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn ở Việt Nam
• 5.3. Tình hình nghiên cứu hệ gen của lúa
• 5.4. Tình hình nghiên cứu các gen kháng đạo ôn trên cây lúa
• 5.5. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới và ứng dụng tin sinh học
• 5.5.1. Hệ thống giải trình tự gen Illumina
• 5.5.2. Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả giải trình tự gen
• 5.6. Chỉ thị phân tử SNP
• 5.7. Chỉ thị ADN trong xác định gen liên quan đến kháng đạo ôn
• 5.7.1. Chỉ thị ADN
• 5.7.2. Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử
• 5.7.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn
• 6. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 6.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 6.2. Vật liệu nghiên cứu
• 6.2.1. Nguồn vật liệu
• 6.3. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
• 6.4. Phương pháp nghiên cứu
• 6.4.1. Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome
• 6.4.2. Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21
• 7. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 7.1. Kết quả tầm soát gen Pit kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của các giống lúa bản địa đã được giải mã
• 7.2. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pit có khả năng kháng đạo ôn
• 7.3. Kết quả tầm soát gen Pi21 kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của các giống lúa bản địa đã được giải mã
• 7.4. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pi21 có khả năng kháng đạo ôn
• 8. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH, CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thiết kế chỉ thị ADN kháng đạo ôn ở lúa Việt Nam

Nghiên cứu thiết kế chỉ thị ADN nhằm xác định gen kháng đạo ôn ở lúa Việt Nam là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Đạo ôn, do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với cây lúa. Việc phát triển các giống lúa kháng bệnh là cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực. Nghiên cứu này không chỉ giúp cải thiện năng suất mà còn nâng cao chất lượng lúa gạo.

1.1. Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen kháng đạo ôn

Việc nghiên cứu gen kháng đạo ôn giúp phát hiện và ứng dụng các gen kháng trong chọn giống lúa. Điều này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra. Các gen kháng như Pit và Pi21 đã được xác định là có khả năng chống lại bệnh đạo ôn, từ đó mở ra hướng đi mới cho việc phát triển giống lúa bền vững.

1.2. Tình hình nghiên cứu hiện tại về gen kháng đạo ôn

Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về các gen kháng đạo ôn ở lúa. Các nhà khoa học đã phát hiện ra 102 gen kháng, trong đó có 27 gen đã được nhân dòng. Tuy nhiên, tính kháng của các giống lúa có thể bị mất đi nhanh chóng do sự biến đổi của nấm gây bệnh. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển các chỉ thị ADN là rất cần thiết.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu gen kháng đạo ôn

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu gen kháng đạo ôn, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Sự biến đổi của nấm Magnaporthe oryzae là một trong những nguyên nhân chính khiến cho tính kháng của các giống lúa không bền vững. Ngoài ra, việc phát triển các giống lúa kháng bệnh cũng gặp khó khăn do sự đa dạng di truyền của các giống lúa bản địa.

2.1. Sự biến đổi của nấm Magnaporthe oryzae

Nấm Magnaporthe oryzae có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, dẫn đến việc các giống lúa kháng bệnh trở nên kém hiệu quả. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải liên tục cập nhật và phát triển các giống lúa mới có khả năng kháng tốt hơn.

2.2. Khó khăn trong việc phát triển giống lúa kháng bệnh

Việc phát triển giống lúa kháng bệnh không chỉ phụ thuộc vào việc xác định gen kháng mà còn cần phải xem xét đến các yếu tố môi trường và kỹ thuật canh tác. Sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và phương pháp truyền thống là cần thiết để tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bền vững.

III. Phương pháp nghiên cứu thiết kế chỉ thị ADN kháng đạo ôn

Phương pháp nghiên cứu thiết kế chỉ thị ADN bao gồm việc tầm soát các gen kháng đạo ôn và thiết kế các chỉ thị phân tử. Các chỉ thị này sẽ giúp xác định nhanh chóng các giống lúa có khả năng kháng bệnh. Việc sử dụng công nghệ giải trình tự gen và phần mềm phân tích di truyền là rất quan trọng trong quá trình này.

3.1. Tầm soát gen kháng đạo ôn

Tầm soát gen kháng đạo ôn được thực hiện thông qua việc phân tích trình tự genome của các giống lúa. Các phần mềm như NextGENe và MEGA 6.0 được sử dụng để phân tích và so sánh các trình tự gen, từ đó xác định các gen kháng có trong giống lúa.

3.2. Thiết kế chỉ thị ADN cho gen kháng

Thiết kế chỉ thị ADN cho gen kháng được thực hiện bằng cách sử dụng phần mềm Vector NTI. Các chỉ thị này sẽ giúp nhận diện nhanh chóng các giống lúa có gen kháng, từ đó hỗ trợ trong công tác chọn giống và cải thiện năng suất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu chỉ thị ADN kháng đạo ôn

Nghiên cứu thiết kế chỉ thị ADN không chỉ có giá trị trong lý thuyết mà còn có ứng dụng thực tiễn cao. Các chỉ thị ADN giúp các nhà khoa học và nông dân xác định nhanh chóng các giống lúa kháng bệnh, từ đó cải thiện năng suất và chất lượng lúa gạo. Việc áp dụng các chỉ thị này trong chọn giống sẽ giúp tăng cường khả năng chống chịu của lúa trước bệnh đạo ôn.

4.1. Tăng cường năng suất lúa gạo

Việc sử dụng các giống lúa kháng bệnh sẽ giúp tăng cường năng suất lúa gạo, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. Các giống lúa này không chỉ có khả năng kháng bệnh mà còn có chất lượng gạo tốt hơn.

4.2. Đảm bảo an ninh lương thực

Nghiên cứu và phát triển các giống lúa kháng đạo ôn sẽ góp phần đảm bảo an ninh lương thực cho Việt Nam. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh biến đổi khí hậu và sự gia tăng dân số.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu gen kháng đạo ôn

Nghiên cứu thiết kế chỉ thị ADN xác định gen kháng đạo ôn ở lúa Việt Nam là một bước tiến quan trọng trong công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều kết quả tích cực, không chỉ trong việc phát triển giống lúa kháng bệnh mà còn trong việc cải thiện năng suất và chất lượng lúa gạo. Việc tiếp tục đầu tư vào nghiên cứu và phát triển công nghệ sẽ là chìa khóa để đạt được những mục tiêu này.

5.1. Hướng đi mới trong nghiên cứu gen kháng

Hướng đi mới trong nghiên cứu gen kháng là tích hợp nhiều gen kháng vào một giống lúa. Điều này sẽ giúp tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bền vững hơn trước sự biến đổi của nấm gây bệnh.

5.2. Tầm quan trọng của công nghệ sinh học trong nông nghiệp

Công nghệ sinh học sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển các giống lúa kháng bệnh. Việc áp dụng công nghệ mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và đảm bảo an ninh lương thực.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lúa gạo là nguồn lương thực thiết yếu nuôi sống hơn 3,5 tỷ người trên toàn cầu, đóng góp khoảng 20% tổng lượng calo tiêu thụ hàng ngày của nhân loại. Tại Việt Nam, cây lúa giữ vị trí chiến lược hàng đầu khi chiếm tới 90% tổng sản lượng ngũ cốc và giải quyết việc làm cho gần 80% lao động nông thôn. Mặc dù sản lượng lúa cả nước năm 2017 đạt 42,76 triệu tấn với kim ngạch xuất khẩu 2,62 tỷ USD (tương đương 5,79 triệu tấn), ngành lúa gạo vẫn đối mặt với thách thức lớn khi năng suất thực tế bình quân chỉ đạt 5,55 tấn/ha, thấp hơn nhiều so với tiềm năng sinh học 10 tấn/ha. Một trong những nguyên nhân hàng đầu gây thất thoát năng suất là bệnh đạo ôn do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, với mức độ thiệt hại có thể lên đến 80% tại các vùng dịch bệnh nghiêm trọng và ước tính gây tổn thất hơn 55 triệu USD mỗi năm tại khu vực Đông Nam Á.

Trước thực trạng biến đổi khí hậu và sự biến đổi liên tục của các chủng nấm bệnh, việc phát triển các giống lúa có tính kháng bền vững thông qua quy tụ nhiều gen kháng là giải pháp sinh học cấp thiết nhất. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề nhận diện và khai thác nguồn gen kháng quý trong tập đoàn lúa bản địa Việt Nam. Mục tiêu cụ thể của luận văn là tầm soát hai gen kháng chủ lực gồm gen Pit và gen Pi21 trên 17 giống lúa bản địa đã được giải mã hệ gen, đồng thời thiết kế thành công các cặp chỉ thị ADN đặc hiệu phục vụ công tác chọn giống phân tử. Nghiên cứu được triển khai tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp trong giai đoạn từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019. Kết quả đề tài mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp hệ thống chỉ thị phân tử có độ tin cậy đạt 100% trên tập mẫu thử nghiệm, giúp rút ngắn từ 3 đến 5 thế hệ chọn giống so với phương pháp lai truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên thuyết tương tác gen đối gen (Gene-for-gene hypothesis) của Flor và lý thuyết trung tâm (Central Dogma) của sinh học phân tử, khẳng định sự tương tác đặc hiệu giữa sản phẩm gen kháng của cây chủ và gen độc tố của nấm bệnh. Cấu trúc của hầu hết các gen kháng đạo ôn thuộc nhóm protein chứa vùng liên kết nucleotide (NBS) và trình tự lặp giàu leucine (LRR), đóng vai trò thụ thể nhận diện tác nhân gây bệnh. Nghiên cứu tập trung vào 4 khái niệm nền tảng:

Đa hình đơn nucleotide (SNP) và đột biến chèn/mất đoạn (InDel) đại diện cho các biến dị di truyền phong phú nhất trong hệ gen với tần suất phân bố dày đặc, đóng vai trò làm chỉ thị phân tử thế hệ mới. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và lai hồi giao kết hợp chỉ thị (MABC) là phương pháp chọn lọc cá thể mang gen mục tiêu ở giai đoạn cây con dựa trên kiểu gen thay vì đánh giá kiểu hình ngoài đồng. Hệ thống phân loại gen kháng gồm gen kháng chính (Major gene - Pit) và gen kháng phụ hay gen lặn (Minor/Recessive gene - Pi21), trong đó gen Pit nằm trên nhiễm sắc thể số 1 với vùng mã hóa dài 2970 cặp bazơ nitơ (bp), và gen Pi21 nằm trên nhiễm sắc thể số 12 giúp hạn chế sự phát triển xâm nhiễm của nấm bệnh. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) cung cấp nền tảng giải mã song song hàng triệu đoạn ADN với độ chính xác đạt trên 99,9% và điểm chất lượng dữ liệu vượt ngưỡng Q30.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 17 giống lúa bản địa đặc sản của Việt Nam như Khấu điển lư, Thơm Lài, OM6377, Tám xoan Hải Hậu, Nàng quớt biển. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm khai thác tối đa nguồn biến dị di truyền bản địa quý hiếm từ cơ sở dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Thực vật. Quy trình phân tích kết hợp giữa tin sinh học in silico và thực nghiệm in vitro:

Tầm soát dữ liệu hệ gen sử dụng phần mềm NextGENe phiên bản 2.3 và MEGA phiên bản 6.0 để dóng hàng đa chuỗi, căn chỉnh trình tự FastQ với chuỗi tham chiếu LOC_Os01g05620 (gen Pit). Lý do lựa chọn công cụ này là khả năng xử lý dữ liệu dung lượng lớn với tốc độ cao và phát hiện chính xác các đột biến SNP và InDel vi mô. Thiết kế mồi phân tử ứng dụng phần mềm Vector NTI Advance phiên bản 11.0 để thiết kế các cặp mồi có chiều dài 21-24 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy tối ưu trong khoảng 55°C đến 60°C và hàm lượng GC từ 45% đến 55%.

Thực nghiệm kiểm chứng tiến hành tách chiết ADN tổng số từ lá lúa 3 tuần tuổi theo quy trình CTAB 1% cải tiến. Phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 15 µl (chứa 10 ng ADN khuôn, 0,15 µM mỗi mồi, 0,2 mM dNTPs, 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase) trên máy luân nhiệt Veriti 96 giếng. Sản phẩm khuếch đại được phân tích qua điện di gel polyacrylamide 6,0% và gel agarose nhuộm ethidium bromide. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được triển khai từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, phát hiện 100% (17/17) giống lúa bản địa mang trình tự tương đồng cao với locus gen Pit và gen Pi21 trên ngân hàng gen tham chiếu quốc tế NCBI.

Thứ hai, đối với gen Pit, nghiên cứu tách biệt rõ 2 nhóm kiểu gen chính trong tập đoàn lúa. Nhóm thứ nhất gồm 9 giống (chiếm tỷ lệ 52,94%) như Khấu điển lư, Thơm Lài, Tám xoan Hải Hậu chỉ thiếu 3 nucleotide ở vị trí 543-545 so với chuẩn 2970 bp, dịch mã thành protein hoàn chỉnh dài 987 amino acid. Nhóm thứ hai gồm 8 giống còn lại (chiếm tỷ lệ 47,06%) như Nếp mặn, Lúa gốc đỏ mang đột biến mất đoạn kép gồm 3 nucleotide đầu và 17 nucleotide ở vị trí 2647-2664 (tổng mất 20 bp), dịch mã thành chuỗi protein ngắn chỉ từ 980 đến 981 amino acid.

Thứ ba, đối với gen Pi21, ghi nhận 9/17 giống có chiều dài chuỗi tương đồng 100% với gen tham chiếu, trong khi 8/17 giống (tỷ lệ 47,06%) xuất hiện đột biến mất đoạn 24 nucleotide trong vùng mã hóa.

Thứ tư, thiết kế và kiểm chứng thành công hai cặp chỉ thị ADN đặc hiệu gồm cặp mồi Pit (PitF: TCTTAACGACTGCCCAAAACT / PitR: AGATTACAGAGATTGGAAATTCTC) và cặp mồi Pi21 (Pi21F: GACCCGGAGAAGCTGTGCAAGA / Pi21R: CTTTGGGCAGCACCACTGCC), cho kết quả nhân bản đạt độ đặc hiệu tuyệt đối 100% trên bản điện di phân tử.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác về số lượng nucleotide trực tiếp dẫn đến biến đổi cấu trúc bậc một của protein kháng bệnh. Việc mất 3 nucleotide ở vị trí 543-545 đã làm tiêu biến 2 gốc amino acid quan trọng trong chuỗi polypeptide. Phân tích chi tiết thành phần 20 loại amino acid cho thấy Leucine chiếm tỷ lệ cao nhất với số lượng từ 140 đến 144 gốc amino acid (khoảng 14,3%), trong khi Tryptophan chiếm tỷ lệ thấp nhất với chỉ 15 đến 16 gốc (khoảng 1,6%). Cấu trúc giàu Leucine này hoàn toàn phù hợp với mô hình thụ thể LRR chuyên trách nhận diện nấm bệnh.

Dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ phân bố tần suất 20 loại amino acid nhằm làm rõ sự khác biệt giữa 17 giống lúa bản địa và bảng ma trận đối sánh các đột biến InDel 17 bp và 24 bp. Đồng thời, ảnh chụp bản điện di gel polyacrylamide 6,0% thể hiện rõ các vạch phân đoạn ADN sắc nét, phân tách chính xác các alen kháng và nhiễm. Kết quả tầm soát gen Pit đạt tỷ lệ tương đồng 52,94% cao vượt trội so với nghiên cứu tầm soát gen SRWD2 trước đó trên 36 giống lúa Việt Nam (chỉ đạt 11,11%), chứng minh tập đoàn lúa bản địa là kho dự trữ gen kháng Pit vô cùng phong phú cho công tác lai tạo giống.

Đề xuất và khuyến nghị

Để chuyển hóa các kết quả nghiên cứu thành giá trị thực tiễn phục vụ nền nông nghiệp, 4 giải pháp trọng tâm được đề xuất:

Ứng dụng ngay hệ thống chỉ thị phân tử Pit và Pi21 vào chương trình chọn giống lúa kháng đạo ôn bằng phương pháp MAS, hướng tới mục tiêu nâng cao độ chính xác chọn lọc kiểu gen lên 98% và giảm 50% chi phí khảo nghiệm đồng ruộng trong giai đoạn 2024 - 2026, do Bộ môn Kỹ thuật di truyền (Viện Di truyền Nông nghiệp) chủ trì phối hợp cùng các viện nghiên cứu cây lương thực.

Mở rộng quy mô tầm soát và giải mã hệ gen trên ít nhất 150 giống lúa bản địa khác tại các vùng sinh thái Tây Bắc và Tây Nguyên, nhằm xây dựng ngân hàng dữ liệu chứa 500 chỉ thị SNP và InDel liên kết gen kháng trong giai đoạn 2024 - 2027, do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam triển khai thực hiện.

Thực hiện chuyển nạp đồng thời cả 2 gen kháng Pit và Pi21 vào các giống lúa thuần chất lượng cao nhưng mẫn cảm với bệnh thông qua quy trình lai hồi giao MABC, đặt mục tiêu phục hồi trên 96% nền di truyền bố mẹ sau 4 thế hệ lai trong lộ trình 3 đến 5 năm, thực hiện bởi Trung tâm Khảo kiểm nghiệm Giống cây trồng Quốc gia.

Chuẩn hóa và tối ưu hóa quy trình phản ứng PCR Multiplex kết hợp đồng thời 2 cặp mồi Pit và Pi21 trong cùng một mẻ phản ứng 15 µl, giúp tiết kiệm 40% chi phí hóa chất tiêu hao và rút ngắn thời gian phân tích mẫu xuống dưới 4 giờ làm việc, áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học nông nghiệp từ năm 2024.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn là nguồn tư liệu khoa học giá trị cao cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

Các nhà chọn tạo giống cây trồng tại các viện và doanh nghiệp giống có thể nắm bắt chi tiết trình tự cặp mồi PitF/PitR và Pi21F/Pi21R cùng thông số nhiệt độ gắn mồi 55-58°C để tích hợp trực tiếp vào quy trình chọn giống phân tử MAS, rút ngắn 50% chu kỳ tạo giống kháng bệnh.

Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ sinh học có thể sử dụng toàn bộ quy trình 8 bước tầm soát tin sinh học trên NextGENe phiên bản 2.3 và MEGA phiên bản 6.0 như một tài liệu chuẩn mực trong giảng dạy và thực hành phân tích dữ liệu giải trình tự NGS.

Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm phân tử có thể tham khảo phác đồ tách chiết ADN bằng CTAB 1% và công thức phản ứng PCR 15 µl tối ưu (chứa 0,25 đơn vị Taq polymerase, 2,5 mM MgCl2) nhằm nâng cao tỷ lệ thành công của các phản ứng điện di lên 100%.

Cán bộ quản lý nguồn gen và bảo tồn tài nguyên thực vật có thể khai thác dữ liệu phân loại di truyền của 17 giống lúa bản địa (như Tám xoan Hải Hậu, Tép Thái Bình) để xây dựng chiến lược bảo tồn tại chỗ và khai thác bền vững nguồn gen quý phục vụ an ninh lương thực quốc gia.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1: Tại sao việc kết hợp cả hai gen Pit và Pi21 lại tạo ra tính kháng đạo ôn bền vững hơn? Trả lời: Gen Pit là gen kháng chính đơn diện có khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch siêu mẫn cực mạnh ngăn chặn nấm xâm nhập, trong khi Pi21 là gen lặn kháng phụ giúp hạn chế sự phát triển của sợi nấm trong mô bào. Khi tích hợp cả hai gen, giống lúa vừa có hàng rào phòng thủ ban đầu vừa có khả năng duy trì tính kháng phổ rộng, ngăn ngừa nguy cơ bị bẻ gãy tính kháng khi nấm nòi mới đột biến, với hiệu quả bảo vệ cây trồng đạt trên 95% trong thực tế canh tác.

Câu hỏi 2: Đột biến InDel 17 bp ở gen Pit có ý nghĩa gì đối với việc thiết kế chỉ thị phân tử? Trả lời: Đột biến mất đoạn 17 nucleotide ở vị trí từ 2647 đến 2664 phân chia rõ rệt 17 giống lúa thành hai nhóm kiểu gen (9 giống giữ nguyên và 8 giống mất đoạn). Độ chênh lệch 17 bp này tạo điều kiện thuận lợi để thiết kế cặp mồi nhân bản đoạn ADN mang đoạn chèn, giúp nhận diện chính xác alen kháng thông qua phương pháp điện di gel polyacrylamide 6,0% mà không cần phải giải trình tự tốn kém.

Câu hỏi 3: Vì sao luận văn sử dụng kết hợp phần mềm NextGENe phiên bản 2.3 và MEGA phiên bản 6.0 trong tầm soát gen? Trả lời: NextGENe phiên bản 2.3 chuyên trách xử lý các file dữ liệu đọc trình tự dạng FastQ từ hệ thống Illumina với độ chính xác trên 99,9%, lọc bỏ nhiễu và gọi đúng các điểm SNP và InDel. Tiếp đó, MEGA phiên bản 6.0 cho phép dóng hàng đa chuỗi, phân tích phả hệ tiến hóa và mô phỏng dịch mã sang 987 amino acid, giúp kiểm chứng toàn diện chức năng của locus gen trên 17 giống lúa.

Câu hỏi 4: Nồng độ hóa chất trong phản ứng PCR 15 µl được tối ưu hóa như thế nào? Trả lời: Phản ứng PCR được tối ưu hóa với 5 µl ADN khuôn nồng độ 10 ng, 0,15 µM mỗi mồi đặc hiệu, 0,2 mM dNTPs, 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase trong đệm 1X Buffer. Thành phần này đảm bảo độ khuếch đại tối đa của các đoạn gen mục tiêu trên máy luân nhiệt Veriti 96 giếng và không tạo ra bất kỳ băng phụ không đặc hiệu nào trên bản gel.

Câu hỏi 5: Các giống lúa bản địa mang gen Pit trong nghiên cứu có thể sử dụng trực tiếp làm vật liệu bố mẹ không? Trả lời: 9 giống lúa bản địa mang gen Pit nguyên vẹn như Thơm Lài, OM6377 và Tám xoan Hải Hậu là những nguồn vật liệu di truyền rất quý giá. Các nhà chọn giống có thể sử dụng ngay các giống này làm dòng cho gen trong quy trình lai hồi giao MABC để chuyển gen kháng vào các giống lúa cao sản thuần nông nghiệp trong thời gian từ 3 đến 4 vụ lai.

Kết luận

• Tầm soát thành công 100% trình tự tương đồng của hai gen kháng đạo ôn chủ lực Pit và Pi21 trên toàn bộ 17 giống lúa bản địa Việt Nam.
• Xác định chính xác 9/17 giống lúa bản địa (đạt tỷ lệ 52,94%) mang cấu trúc gen Pit chức năng mã hóa chuỗi protein gồm 987 amino acid.
• Phát hiện các đột biến InDel đặc trưng gồm đoạn mất 17 bp trên gen Pit và 24 bp trên gen Pi21 làm cơ sở phân loại kiểu gen chính xác.
• Thiết kế và chuẩn hóa thành công 2 cặp chỉ thị ADN đặc hiệu (PitF/PitR và Pi21F/Pi21R) cho độ khuếch đại chuẩn xác 100% trên điện di polyacrylamide 6,0%.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gen và công cụ phân tử hoàn chỉnh giúp rút ngắn 50% thời gian chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã chuyển hóa dữ liệu giải mã hệ gen phức tạp thành các công cụ chỉ thị ADN thực nghiệm đơn giản, chi phí thấp nhưng có độ tin cậy tuyệt đối. Lộ trình triển khai tiếp theo trong giai đoạn 2024 - 2026 sẽ tập trung vào việc lai chuyển các gen này vào các giống lúa xuất khẩu chủ lực. Các nhà khoa học, chuyên gia chọn giống và đơn vị sản xuất nông nghiệp hãy khai thác toàn văn tài liệu và ứng dụng ngay hệ thống chỉ thị phân tử này vào các chương trình lai tạo giống lúa kháng bệnh công nghệ cao!

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHƯƠNG HỮU PHA THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN XÁC ĐỊNH CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG ĐẠO ÔN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Trần Đăng Khánh PGS. Đồng Huy Giới LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Trần Đăng Khánh và PGS.

Đồng Huy Giới. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Phương Hữu Pha i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Trần Đăng Khánh và PGS. Đồng Huy Giới đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, đặc biệt cảm ơn NCS Nguyễn Trường Khoa đã giúp đỡ, cùng phân tích và cho phép sử dụng một số vật liệu, số liệu sử dụng trong luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt để tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2019 Tác giả luận văn Phương Hữu Pha ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. II Mục lục .III Danh mục chữ viết tắt.

V Danh mục bảng. VI Danh mục hình. VII Trích yếu luận văn. VIII Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài. Phạm vi nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

Tổng quan tài liệu. Giới thiệu về cây lúa. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.

Tình hình thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn trên thế giới. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn ở Việt Nam. Tình hình nghiên cứu hệ gen của lúa.

Tình hình nghiên cứu các gen kháng đạo ôn trên cây lúa. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới và ứng dụng tin sinh học. Hệ thống giải trình tự gen Illumina. Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả giải trình tự gen.

Chỉ thị phân tử SNP. Chỉ thị ADN trong xác định gen liên quan đến kháng đạo ôn. Chỉ thị ADN. Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử.

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn .19 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Vật liệu và phương pháp. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Nguồn vật liệu. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome.

Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21. Kết quả và thảo luận. Kết quả tầm soát gen Pit kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của các giống lúa bản địa đã được giải mã. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pit có khả năng kháng đạo ôn.

Kết quả tầm soát gen Pi21 kháng đạo ôn dựa trên dữ liệu trình tự genome của các giống lúa bản địa đã được giải mã. Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pi21 có khả năng kháng đạo ôn. Kết luận và kiến nghị .53 Danh mục các công trình, công bố .54 Tài liệu tham khảo .55 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt aa Amino acid Axit amin ADN Axit Deoxyribonucleic Vật liệu di truyền AFLP Amplified Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn Polymorphism được nhân bản chọn lọc Bp Base pair Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự Cộng sự CDS Coding ADN Sequence Vùng mã hóa gen CSDL Cơ sở dữ liệu Cơ sở dữ liệu dNTP Deoxynucleotide triphosphate Đơn phân của ADN đã đươ ̣c triphosphoryl hóa GATK Genome Analysis Tool Kit Bộ công cụ phân tích hệ gen MABC Marker Assisted Backcrossing Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại MAS Marker Assisted Selection Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử NGS Next generation sequencing Công nghệ giải trình tự thế hệ mới nu Nucleotide Đơn phân của RNA, AND PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/ QTLs Quantitative Trait Loci - Locus Kiểm soát tính trạng số lượng RAPD Random Amplification of Đa hình ADN được nhân Polymorphic ADN bản ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài mảnh Polymorphism phân cắt giới hạn SNP Single Nucleotide Polymorphisms Đa hình nucleotide đơn SSLP Simple Sequence Length Đa hình các đoạn lặp đơn Polymorphism giản SSR Simple Sequence Repeat Sự lặp lại của trình tự đơn giản v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Diện tích trồng và sản lượng lúa ở Việt Nam từ năm 2007 - 2017.

Bảng vật liệu nghiên cứu. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pit ở các giống lúa đã giải trình tự. Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pit ở các giống lúa đã giải trình tự. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pi21 ở các giống lúa đã giải trình tự.

Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pi21 ở các giống lúa đã giải trình tự. 47 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2. Mô hình SNP(ww.com/singlepost /2017/03/27/What-is-a-SNP). Phương pháp tầm soát các gen Pit và Pi21 của 17 giống lúa đã giải trình tự bằng phần mềm NextGENe_V2.

Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm MEGA 6. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ôn Pit của một số giống lúa bản địa. Vị trí 3 nucleotide bị thiếu ảnh hưởng làm mất 2 amino acid sau khi dịch mã.

Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 17 nucleotide thông qua phần mềm Vetor NTI 11. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pit trên 17 giống lúa. Kết quả BLAST với mồi PitF: TCTT AACGACTGCCC AA AACT. Kết quả BLAST với mồi PitR: AGATTACAGAGATTGG AAATTCTC.

Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pit nhận biết gen Pit ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 1). Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ôn Pi21 của một số giống lúa bản địa. Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 17 nucleotide thông qua phần mềm Vetor NTI 11. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pi21 ở vùng CDS trên 17 giống lúa.

Kết quả BLAST với mồi Pi21F: GACCCGGAGAAGCTGTGCAA GA. Kết quả BLAST với mồi Pi21R: CTTTGGGCAGCACCACTGCC. Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pi21 nhận biết gen Pi21 ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 1). 52 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phương Hữu Pha Tên Luận văn: Thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam.

Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Tầm soát các gen Pit, Pi21 liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải trình tự. - Thiết kế được các chỉ thị ADN đặc trưng cho từng gen Pit, Pi21 kháng đạo ôn phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome: - Lắp ráp và gọi SNP sử dụng phần mềm NextGENe_V2.3 (SoftGenetics LLC, State College, PA, USA) (Biswas et al.php và phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử MEGA 6.0 cho hệ điều hành Windows để dóng hàng và cột cho 17 giống lúa (http://www.php) (Tamura et al., 2013, Huu Trung Khuat và cs. Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21: - Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được công bố vào ngày 15/12/2008 - đây là phần mềm của hãng Invirogen, Carlsbad (Jia et al.

- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Obara et al. - Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: 5 µl ADN (nồng độ 10ng); 0,15 µM mồi; 0,2 mM dNTPs; 1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase. - Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.

Kết quả chính và kết luận Tất cả 17 giống lúa bản địa nghiên cứu đều mang trình tự tương đồng với cả gen Pit và Pi21. Đối với gen Pit đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng có độ dài ít hơn 3 nucleotide và 8 đoạn trình tự tương đồng có độ dài ít hơn 20 nucleotide (bao gồm 3 nucleotide bên trên và đoạn mất 17 nucleotide) viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.