Tổng quan luận án

Đề tài nghiên cứu khoa học thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ (mã số 9 44 01 14) mang tên: "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học từ hai loài Wedelia chinensis và Wedelia trilobata, họ Cúc (Asteraceae)" do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Luyến thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hải Đăng và PGS. Nguyễn Tiến Đạt. Luận án được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp cùng Học viện Khoa học và Công nghệ, Trung tâm Nghiên cứu nông dược (Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ) và Trung tâm Ứng dụng các phương pháp phổ (Viện Hóa học).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Việc khai thác các nguồn dược liệu tự nhiên phục vụ y học cổ truyền và công nghiệp dược phẩm hiện đại luôn giữ vị trí quan trọng do các hợp chất thiên nhiên sở hữu sự đa dạng về cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học phong phú, khả năng hấp thụ, chuyển hóa tốt và độc tính tế bào thấp. Việt Nam có hệ thực vật phong phú với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó khoảng 5.000 loài đã được ứng dụng trong y học dân gian.

Chi Wedelia thuộc họ Cúc (Asteraceae) là một nhóm thực vật phân bố rộng và được dùng làm thuốc truyền thống tại nhiều khu vực trên thế giới với các công dụng như hạ sốt, giảm đau, kháng khuẩn, chống oxy hóa, hỗ trợ điều trị đái tháo đường, bảo vệ gan và kháng khối u. Các nghiên cứu sơ bộ cho thấy dịch chiết methanol từ cây Sài đất (Wedelia chinensis) thể hiện hoạt tính diệt một số dòng tế bào ung thư (như ung thư phổi A-549, H1975) và ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trong các phản ứng liên quan đến viêm. Tuy nhiên, việc khảo sát thành phần hóa thực vật một cách hệ thống kết hợp với thử nghiệm hoạt tính sinh học định hướng trên các mẫu thu hái tại Việt Nam của hai loài Sài đất (Wedelia chinensis) và Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata) vẫn cần được thực hiện chuyên sâu để làm rõ các hoạt chất mới và cơ chế tác dụng.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Nghiên cứu xác định thành phần hóa học từ hai loài Wedelia chinensis và Wedelia trilobata thuộc chi Wedelia.
  2. Đánh giá hoạt tính kháng viêm, hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-amylase, $\alpha$-glucosidase và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được để làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Nhiệm vụ nghiên cứu

Để hiện thực hóa các mục tiêu trên, luận án triển khai ba nội dung chính:

  • Phân lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài W. trilobata và W. chinensis bằng các phương pháp sắc ký khác nhau.
  • Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng sự kết hợp giữa các phương pháp vật lý, phương pháp phổ hiện đại và biến đổi hóa học.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của các hợp chất, bao gồm hoạt tính kháng viêm (thông qua ức chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7), hoạt tính ức chế enzyme thủy phân carbohydrate ($\alpha$-amylase và $\alpha$-glucosidase) liên quan đến bệnh tiểu đường, và hoạt tính gây độc tế bào ung thư.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Mẫu cây Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata (L.) Hitchc., tên đồng nghĩa: Sphagneticola trilobata (L.) Pruski), thu hái tại tỉnh Thái Bình vào tháng 9 năm 2017. Tiêu bản mẫu mang ký hiệu 2016.55-W2.
    • Mẫu cây Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck) Merr., tên đồng nghĩa: Sphagneticola calendulacea (L.) Pruski), thu hái tại Hà Nội vào tháng 9 năm 2017. Tiêu bản mẫu mang ký hiệu 2016.55-W1.
    • Cả hai mẫu thực vật được giám định tên khoa học bởi TS. Đỗ Văn Hài (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và được lưu trữ tại Trung tâm Nghiên cứu nông dược, Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ.
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát thành phần hóa học phần trên mặt đất của hai loài thực vật nêu trên và đánh giá hoạt tính sinh học in vitro của các hợp chất thứ cấp phân lập được.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Đặc điểm thực vật học chi Wedelia

Chi Wedelia là chi thực vật thân thảo sống lâu năm thuộc họ Cúc (Asteraceae). Thân mọc đứng hoặc bò lan trên mặt đất, phân nhánh, rễ thường mọc tại các đốt thân. Lá mọc đối (hiếm khi so le), viền lá nguyên hoặc có răng cưa. Cụm hoa đầu có đường kính trên 1 cm mọc ở nách lá hoặc ngọn cành, bao gồm vòng hoa cái hình lưỡi màu vàng tươi ở phía ngoài và hoa lưỡng tính hình ống màu vàng sẫm ở giữa. Trên thế giới có khoảng 107 loài thuộc chi Wedelia đã được công nhận danh pháp khoa học; tại Việt Nam phân bố một số loài chính như W. chinensis, W. trilobata, W. prostrata, W. biflora, W. urticaefolia, W. hookeriana.

Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học chi Wedelia

Các công trình trên thế giới và trong nước đã ghi nhận chi Wedelia chứa nhiều nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng:

  • Sesquiterpene: Năm 1980, Bohlmann và cộng sự đã công bố 5 hợp chất pseudoguaianolide mới (Wedelifloride 6-O-methacrylate, 6-O-(methacryloyloxy)wedelifloride 4-O-acetate, 6-O-(isobutyryloxy)wedelifloride 4-O-acetate, 6-O-(tiglinoyloxy)wedelifloride 4-O-acetate, 6-O-(isovaleryloxy)wedelifloride 4-O-acetate) từ loài W. grandiflora. Giai đoạn 1982–2005, 31 hợp chất eudesmanolide được phân lập từ W. prostrata, W. hispida, W. pinetorum. Năm 2013, Li và cộng sự phân lập 10 eudesmanolide từ W. trilobata (trong đó có wedelolide C–F và wedetrilide A). Năm 2020, Sun và cộng sự phân lập tiếp 8 hợp chất eudesmanolide mới từ hoa của W. trilobata.
  • Diterpene: Các dẫn xuất diterpene dạng khung ent-beyerene và đặc biệt là khung ent-kaurane xuất hiện phổ biến trong chi này. Năm 2006, Nguyễn Thanh Hoàng và cộng sự phân lập từ lá W. trilobata hợp chất 3$\alpha$-(tigloyloxy)-ent-kaur-16-en-19-oic acid và từ hoa W. biflora hợp chất ent-kaur-16-en-19-oic acid. Giai đoạn 2015–2020, các nhóm tác giả quốc tế như Hui et al. (2015), Li et al. (2016), Z. Wu et al. (2019), J. Xu et al. (2020), R. Das et al. (2020) đã phát hiện thêm hàng loạt dẫn xuất ent-kaurane mới từ W. trilobata và W. prostrata.
  • Triterpene và triterpene saponin: De Carvalho et al. (1984) phân lập các este của oleanolic acid từ W. paludosa. Govindachari và Premila (1991) công bố hai saponin bisdesmosidic oleanolic acid từ lá W. chinensis. Luo et al. (2005) công bố hai saponin mới thuộc nhóm oleanane từ W. chinensis. Năm 2006 và 2009, Nguyễn Thanh Hoàng và cộng sự phân lập friedelan-3-$\beta$-ol, $\beta$-amyrin acetate, $\beta$-amyrin và 3-$\beta$-O-tetradecanoylurs-12-en-16-$\beta$-ol từ W. trilobata và W. urticaefolia. Năm 2015, Verma và cộng sự công bố dẫn xuất triterpene mới 19-$\alpha$-hydroxyurs-12(13)-ene-28-oic acid-3-O-$\beta$-D-glucopyranoside từ W. chinensis.
  • Flavonoid và các thành phần khác: Các nghiên cứu của Caleanasan et al., S. Apers et al. (2002), D. Mitle et al. (2005) đã ghi nhận nhiều flavanone, chalcone, isoflavone và flavonol glycoside (quercetin 3-O-$\beta$-D-glucopyranoside, kaempferol 3-O-D-glucopyranoside, luteolin). Ngoài ra, các dẫn xuất coumarin (norwedelic acid, wedelolactone, norwedelolactone), dẫn xuất caffeoylquinic acid (Zhong et al., 2018), phenylethanoid glycoside, steroid (stigmasterol, sitosterol) và các hợp chất chứa lưu huỳnh (thiophene acetylene) cũng được tìm thấy.

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Wedelia

  • Gây độc tế bào ung thư: Chiết xuất methanol của W. chinensis làm giảm thể tích khối u Ehrlich ascites carcinoma (EAC) trên chuột (Gupta et al., 2010); ức chế thụ thể androgen trong ung thư tuyến tiền liệt (Feng-Min Lin et al., 2007). Bốn hợp chất ent-kaurane từ W. prostrata thể hiện độc tính tế bào trên dòng HepG2 với giá trị $\text{IC}_{50}$ từ $11{,}72 \pm 0{,}22$ đến $17{,}35 \pm 0{,}15\ \mu\text{M}$ (Z. Wu et al., 2019). Chiết xuất chloroform từ W. chinensis kích hoạt quá trình tự chết (apoptosis) trên tế bào PBMCs người (Nguyễn Thị Minh Thuận, 2020). Cao ethanol W. chinensis ức chế tế bào u nguyên bào thần kinh đệm GBM (LJ. Chen, 2021).
  • Hạ đường huyết: Dịch chiết và kaurenoic acid từ W. paludosa (Novaes et al.), dịch chiết nước của W. trilobata (trên chuột tiểu đường do streptozotocin, $45\text{ mg/kg}$), và cao ethanol hoa W. trilobata liều $250\text{ mg/kg}$ (Buddhakala et al., 2020) cho thấy khả năng hạ glucose máu lúc đói, giảm lipid peroxide và phục hồi men gan.
  • Chống oxy hóa: Dịch chiết ethanol của W. chinensis thu dọn gốc tự do $\text{DPPH}^\bullet$, $\text{NO}^{\bullet-}$, $\text{O}2^{\bullet-}$ và ức chế peroxy hóa lipid với $\text{IC}{50}$ lần lượt là $9{,}16$, $13{,}21$, $25{,}27$, $17{,}33\ \mu\text{g/mL}$ (Verma et al.). Cao chiết hoa và lá W. trilobata thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH và lực khử sắt FRAP tốt (Govindappa et al., Chethan et al.).
  • Kháng viêm và kháng khuẩn: Dịch chiết W. paludosa kháng nấm da liễu (Trichophyton, Epidermophyton); dẫn xuất ent-kaurane kháng khuẩn với giá trị $\text{LC}_{50}$ đạt $0{,}68\ \mu\text{g/mL}$ (Mottakin et al., 2004). Wedelolactone ức chế NF-$\kappa\text{B}$, làm giảm sinh NO, $\text{PGE}2$, $\text{TNF}-\alpha$ (Yuan et al.). Các dẫn xuất caffeoylquinic acid từ W. chinensis ức chế mạnh NO trên tế bào RAW264.7 với $\text{IC}{50}$ từ $6{,}45 \pm 0{,}26$ đến $12{,}56 \pm 0{,}53\ \mu\text{M}$ (Zhong et al., 2018).
  • Tác động lên hệ thần kinh trung ương: Dịch chiết W. chinensis làm giảm hoạt động vận động, điều hòa các chất dẫn truyền thần kinh NE, DA, 5-HT, 5-HIAA và enzyme monoamine oxidase (MAO) trên mô hình động vật chịu căng thẳng.

Vị trí và đóng góp của luận án

Dù chi Wedelia đã được nghiên cứu ở nhiều nơi, nguồn tài nguyên W. chinensis và W. trilobata tại miền Bắc Việt Nam vẫn chưa được khai thác toàn diện về mặt phân lập hợp chất tinh khiết định hướng hoạt tính. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách phân lập đồng thời thành phần từ cả hai loài, xác định các chất có cấu trúc mới, phân tích cấu hình tuyệt đối và đánh giá song song ba nhóm hoạt tính sinh học (in vitro): kháng viêm, ức chế enzyme chuyển hóa đường ($\alpha$-glucosidase, $\alpha$-amylase) và gây độc tế bào ung thư.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng các nguyên lý của Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Natural Products Chemistry) và Dược lý học thực nghiệm:

  • Phân đoạn dịch chiết dựa trên độ phân cực của dung môi.
  • Sử dụng tương tác hấp phụ và phân bố trong sắc ký để tinh chế đơn chất.
  • Ứng dụng lý thuyết cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều, phổ khối lượng phân giải cao và phương pháp hóa học lập thể (phương pháp Mosher biến tính) để xác định cấu trúc phân tử và cấu hình tuyệt đối.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro thông qua các mô hình tương tác enzyme - cơ chất và đáp ứng miễn dịch tế bào.

Phương pháp phân lập hợp chất

  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\ \text{F}{254}$ (Merck 1.05715) và pha đảo $\text{RP-C}{18}\ \text{F}_{254\text{s}}$ (Merck). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$, hoặc phun dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$ trong ethanol rồi gia nhiệt.
  • Sắc ký lớp mỏng điều chế: Dùng bản mỏng tráng sẵn silica gel $60\ \text{F}_{254}$ (Merck 1.05875), cạo vùng silica mang chất và giải hấp phụ bằng dung môi phù hợp.
  • Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ gồm silica gel pha thường (kích thước hạt $0{,}040\text{--}0{,}063\text{ mm}$, $230\text{--}400\text{ mesh}$), silica gel pha đảo $\text{RP-18}$ ($150\ \mu\text{m}$, Fuji Silysia Chemical Ltd.), và nhựa hấp phụ không phân cực Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Corp.).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

  • Phổ khối lượng: Đo phổ MS trên hệ thống Agilent 1260 HPLC-MS (nguồn ion hóa ESI/APCI).
  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Đo trên thiết bị Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa sinh biển để xác định khối lượng chính xác và công thức phân tử.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học với chất nội chuẩn tetramethylsilane (TMS). Các kỹ thuật ghi phổ bao gồm:
    • Phổ 1D: $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT ($90^\circ$ và $135^\circ$).
    • Phổ 2D: HSQC, HMBC, $^1\text{H-}^1\text{H}\ \text{COSY}$, NOESY.
    • Dung môi đo phổ: $\text{DMSO-}d_6$, $\text{CD}_3\text{OD}$, $\text{CDCl}_3$.
  • Độ quay cực: Xác định góc quay cực riêng $[\alpha]_\text{D}$ trên phân cực kế JASCO P-2000 Polarimeter tại Viện Hóa sinh biển.
  • Phương pháp xác định đường D/L: Thủy phân mẫu (WT1, WT2; $3\text{ mg}$) trong $5\text{ mL}$ dung dịch $\text{KOH/EtOH}\ 10%$ ở $70^\circ\text{C}$ trong $3\text{ giờ}$. Axit hóa bằng $\text{HOAc}$, chiết phân lớp với ethyl acetate và nước. Dịch nước chứa đường đơn được kiểm tra sắc ký TLC (pha động $\text{CHCl}3/\text{MeOH}/\text{H}2\text{O}\ 1{,}5:1:0{,}15$, $R\text{f} = 0{,}3$) và đo độ quay cực riêng so sánh với đường chuẩn ($[\alpha]\text{D} = +10{,}5$ trong $\text{H}_2\text{O}$, xác nhận là D-glucose).
  • Phương pháp Mosher biến tính: Xác định cấu hình tuyệt đối của tâm bất đối chứa nhóm $-\text{OH}$ bậc hai trên hợp chất WC1 bằng cách điều chế các este $(S)\text{-MTPA}$ và $(R)\text{-MTPA}$ với $(R)\text{-}$ và $(S)\text{-}\alpha\text{-methoxy-}\alpha\text{-(trifluoromethyl)phenylacetyl chloride}$ (MTPA-Cl) trong $\text{CH}_2\text{Cl}2$ có mặt DMAP và triethylamine, sau đó tính toán giá trị độ chuyển dịch hóa học $\Delta\delta\text{H}\ (S-R)$ trên phổ $^1\text{H-NMR}$.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính kháng viêm (ức chế sản sinh NO): Đánh giá trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 được kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS). Định lượng nitrite ($\text{NO}_2^-$) sinh ra từ sự oxy hóa NO trong môi trường nuôi cấy thông qua phản ứng tạo phức màu với thuốc thử Griess.
  • Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và $\alpha$-amylase: Đánh giá khả năng ức chế enzyme thủy phân tinh bột in vitro nhằm sàng lọc tiềm năng hỗ trợ điều trị đái tháo đường.
  • Hoạt tính gây độc tế bào: Đánh giá trên các dòng tế bào ung thư người nuôi cấy in vitro (như A-549, HepG-2, MCF-7, HeLa, PC3) thông qua phương pháp đo độ hấp thụ quang học MTT.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về đặc điểm phân loại, hình thái thực vật, công dụng dân gian, thành phần hóa học và hoạt tính dược lý của chi Wedelia, tập trung vào hai loài Wedelia trilobata và Wedelia chinensis:

  • Cung cấp mô tả thực vật chi tiết về thân, lá, cụm hoa, quả bế của W. trilobata và W. chinensis.
  • Tổng thuật 165 hợp chất đã biết từ các loài thuộc chi Wedelia, phân loại thành 5 nhóm chính: sesquiterpene (eudesmanolide, pseudoguaianolide), diterpene (ent-kaurane, ent-beyerene), triterpene và triterpene saponin (oleanane, ursane, friedelane), flavonoid (flavonol, flavanone, chalcone, isoflavone) và các hợp chất phenolic khác (dẫn xuất caffeic acid, coumarin, sterol).
  • Điểm luận các nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư, hạ đường huyết, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm và tác động ức chế thần kinh trung ương.

Chương 2: Phương pháp và thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết về xuất xứ nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, quy trình chiết xuất, phân lập và thông số phổ của các hợp chất:

  • Ghi nhận nguồn gốc thu mẫu Sài đất ba thùy tại Thái Bình và Sài đất tại Hà Nội (tháng 9/2017).
  • Trình bày sơ đồ chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần và quy trình sắc ký cột phân lập thành công 8 hợp chất (ký hiệu WT1 đến WT8) từ W. trilobata và 12 hợp chất (ký hiệu WC1 đến WC12) từ W. chinensis.
  • Cung cấp đầy đủ thông số vật lý (trạng thái, độ tan, độ quay cực) và dữ liệu phổ khối lượng (MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY) cho từng hợp chất phân lập.
  • Trình bày quy trình thực nghiệm thủy phân xác định đường D-glucose trên WT1, WT2 và quy trình ester hóa Mosher xác định cấu hình tuyệt đối của WC1.
  • Mô tả chi tiết quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế sinh NO trên đại thực bào RAW264.7, ức chế enzyme $\alpha$-amylase, $\alpha$-glucosidase và gây độc tế bào ung thư.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 tập trung biện giải cấu trúc hóa học của 20 hợp chất phân lập được và công bố kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học:

Danh mục các hợp chất phân lập từ hai loài nghiên cứu

Ký hiệu Tên hợp chất Loại cấu trúc / Nhóm chất Tình trạng cấu trúc
Từ loài Wedelia trilobata
WT1 Wedtriloside A ent-Kaurane diterpene glycoside Hợp chất mới
WT2 Wedtriloside B ent-Kaurane diterpene glycoside Hợp chất mới
WT3 Paniculoside-IV ent-Kaurane diterpene glycoside Đã biết
WT4 Apigenin Flavonoid (Flavone) Đã biết
WT5 Apigenin 7-O-$\beta$-D-glucopyranoside Flavonoid glycoside Đã biết
WT6 3-O-[$\beta$-D-glucopyranosyl(1-4)-$\beta$-D-glucuronopyranosyl] oleanolic acid 28-O-$\beta$-D-glucopyranosyl ester Triterpene saponin (Oleanane) Đã biết
WT7 4',4,6-Trihydroxyaurone Aurone Đã biết
WT8 Caffeic acid Dẫn xuất phenylpropanoid Đã biết
Từ loài Wedelia chinensis
WC1 Wednenic Hợp chất dẫn xuất phenolic / cyclohexylethanoid Hợp chất mới
WC2 Cleroindicin E Hợp chất cyclohexylethanoid Đã biết
WC3 Wednenol Hợp chất dẫn xuất phenolic / cyclohexylethanoid Hợp chất mới
WC4 Cornoside Cyclohexadienone glucoside Đã biết
WC5 Rengyol Cyclohexylethanoid Đã biết
WC6 Kaempferol-3-O-$\beta$-D-glucopyranoside Flavonoid glycoside (Flavonol) Đã biết
WC7 Quercetin-3-O-$\beta$-D-glucopyranoside Flavonoid glycoside (Flavonol) Đã biết
WC8 Luteolin Flavonoid (Flavone) Đã biết
WC9 Jaceosidin Flavonoid (Flavone) Đã biết
WC10 1-O-Benzyl-$\beta$-D-glucopyranosyl-2-sulfate Benzyl glucoside sulfate Đã biết
WC11 19-Hydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid (pomonic acid) Triterpene (Ursane) Đã biết
WC12 Ilexgenin B (Pubescenolic acid) Triterpene (Ursane) Đã biết

Biện luận cấu trúc các hợp chất mới

  • Wedtriloside A (WT1) và Wedtriloside B (WT2): Được xác định thuộc nhóm diterpene glycoside khung ent-kaurane. Các liên kết glycoside và vị trí nhóm thế được xác định qua tương tác dị hạt nhân xa HMBC ($^1\text{H}\rightarrow^{13}\text{C}$) và tương tác không gian NOESY. Cấu hình phần đường được chứng minh là $\beta$-D-glucopyranosyl sau phản ứng thủy phân kiềm và đo độ quay cực.
  • Wednenic (WC1) và Wednenol (WC3): Được phân lập từ W. chinensis. Cấu trúc phẳng được thiết lập hoàn chỉnh dựa trên phân tích tương quan HSQC, HMBC, COSY. Cấu hình tuyệt đối của WC1 được xác định chắc chắn thông qua việc điều chế cặp este Mosher phân giải tín hiệu phổ $^1\text{H-NMR}$ ($\Delta\delta_\text{H} = \delta_S - \delta_R$).

Đánh giá hoạt tính sinh học

  • Hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7: Các hợp chất flavonoid (Apigenin WT4, Luteolin WC8, Jaceosidin WC9) và các dẫn xuất phenolic thể hiện khả năng ức chế NO rõ rệt ở các nồng độ thử nghiệm không gây độc tế bào.
  • Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-amylase và $\alpha$-glucosidase: Một số hợp chất flavonoid glycoside và diterpenoid thể hiện hiệu lực ức chế enzyme ở mức độ khác nhau.
  • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư: Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư cho thấy một số hợp chất triterpene và dẫn xuất diterpene có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của tế bào khối u in vitro.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  1. Phát hiện 4 hợp chất mới: Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 4 hợp chất mới chưa từng được công bố trong tài liệu khoa học thế giới:
    • Hai hợp chất diterpene glycoside mới từ Wedelia trilobata: Wedtriloside A (WT1) và Wedtriloside B (WT2).
    • Hai hợp chất mới từ Wedelia chinensis: Wednenic (WC1) và Wednenol (WC3).
  2. Bổ sung dữ liệu hóa thực vật: Phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất đã biết từ hai loài, bổ sung dữ liệu phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, 2D-NMR) và phổ khối lượng HR-ESI-MS hoàn chỉnh cho các taxon thực vật thuộc chi Wedelia tại Việt Nam.
  3. Ứng dụng phương pháp Mosher biến tính: Xác định thành công cấu hình tuyệt đối của hợp chất mới WC1 (Wednenic) bằng phương pháp ester hóa Mosher kết hợp tính toán độ chuyển dịch hóa học thực nghiệm.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Dữ liệu hoạt tính sinh học định lượng: Cung cấp số liệu thực nghiệm về hoạt tính kháng viêm (ức chế NO trên dòng tế bào RAW264.7), hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-amylase, $\alpha$-glucosidase và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 20 hợp chất tinh khiết.
  2. Cơ sở khoa học cho y học cổ truyền: Kết quả nghiên cứu chứng minh cơ sở hóa dược cho các kinh nghiệm dân gian sử dụng Sài đất và Sài đất ba thùy trong điều trị mụn nhọt, viêm nhiễm, hạ sốt và các bệnh chuyển hóa.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới chỉ dừng lại ở quy mô in vitro trên các mô hình enzyme và dòng tế bào nuôi cấy; chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật sống đối với các hợp chất mới phân lập do giới hạn về khối lượng chất thu được.
  • Nguồn mẫu thực vật được thu hái tại một thời điểm nhất định (tháng 9/2017) tại hai địa phương (Thái Bình và Hà Nội), chưa đánh giá sự biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và phân lập để thu nhận khối lượng lớn hơn các hợp chất mới (Wedtriloside A, B; Wednenic; Wednenol) nhằm phục vụ các thử nghiệm dược lý chuyên sâu in vivo.
  • Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử tác động của các hợp chất tiềm năng lên các con đường tín hiệu gây viêm (như con đường NF-$\kappa\text{B}$, iNOS, COX-2) và cơ chế kích hoạt apoptosis trên tế bào ung thư.
  • Khảo sát bán tổng hợp hoặc biến đổi cấu trúc hóa học của các khung diterpene và triterpene phân lập được nhằm nâng cao hoạt tính sinh học và độ tan.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật cao đối với:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa hợp chất thiên nhiên và Dược học: Cung cấp tài liệu tra cứu trực tiếp về dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC, COSY, NOESY) của các khung phân tử ent-kaurane, oleanane, ursane, flavonoid và dẫn xuất cyclohexylethanoid.
  • Các nhà nghiên cứu hóa dược và thực vật học: Phương pháp luận rõ ràng trong việc xác định cấu hình tương đối/tuyệt đối (thủy phân chọn lọc xác định đường, phương pháp ester Mosher) và sơ đồ phân lập từng bước các nhóm chất phân cực trung bình đến cao.
  • Các cơ sở sản xuất và phát triển dược liệu: Cung cấp thông tin hoạt chất chỉ điểm (marker compounds) phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng dược liệu Sài đất (Wedelia chinensis) và Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata).

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện ra bao nhiêu hợp chất mới và đó là những hợp chất nào?

Luận án đã phát hiện và xác định cấu trúc của 4 hợp chất mới:

  • Từ loài Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata): Hợp chất Wedtriloside A (WT1) và Wedtriloside B (WT2) (đều thuộc nhóm ent-kaurane diterpene glycoside).
  • Từ loài Sài đất (Wedelia chinensis): Hợp chất Wednenic (WC1) và Wednenol (WC3).

2. Tác giả đã sử dụng phương pháp nào để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất mới WC1?

Tác giả sử dụng phương pháp Mosher biến tính. Cụ thể, hợp chất WC1 được phản ứng với $(R)\text{-}$ và $(S)\text{-MTPA chloride}$ trong dung môi $\text{CH}_2\text{Cl}2$ với xúc tác DMAP và triethylamine để tạo thành hai este tương ứng là $(S)\text{-MTPA}$ và $(R)\text{-MTPA}$. Dựa vào hiệu số độ chuyển dịch hóa học $\Delta\delta\text{H}\ (S-R)$ trên phổ $^1\text{H-NMR}$ của các proton xung quanh tâm bất đối, cấu hình tuyệt đối của tâm mang nhóm hydroxyl đã được xác định.

3. Cấu hình D/L của các phân tử đường trong các hợp chất glycoside mới (WT1, WT2) được xác định ra sao?

Các hợp chất glycoside được tiến hành thủy phân kiềm trong dung dịch $\text{KOH/EtOH}\ 10%$ ở nhiệt độ $70^\circ\text{C}$ trong 3 giờ, sau đó axit hóa bằng $\text{HOAc}$ và chiết tách phân lớp nước chứa đường đơn. Phần đường giải phóng được đối chiếu sắc ký TLC với đường chuẩn và đo độ quay cực riêng ($[\alpha]_\text{D} = +10{,}5$ trong $\text{H}_2\text{O}$), qua đó khẳng định thành phần đường là D-glucose.

4. Tổng số hợp chất phân lập được từ mỗi loài thực vật trong luận án là bao nhiêu?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc tổng cộng 20 hợp chất:

  • 8 hợp chất từ Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata), ký hiệu từ WT1 đến WT8.
  • 12 hợp chất từ Sài đất (Wedelia chinensis), ký hiệu từ WC1 đến WC12.

5. Các hoạt tính sinh học chính được đánh giá trong công trình này gồm những hoạt tính nào?

Ba nhóm hoạt tính sinh học in vitro chính được đánh giá bao gồm:

  • Hoạt tính kháng viêm thông qua đánh giá mức độ ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào đại thực bào chuột RAW264.7 kích thích bởi LPS.
  • Hoạt tính ức chế enzyme liên quan đến bệnh tiểu đường: enzyme $\alpha$-amylase và $\alpha$-glucosidase.
  • Hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Luyến là công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Sài đất (Wedelia chinensis) và Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata) thu hái tại Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 20 hợp chất tinh khiết, trong đó phát hiện 4 hợp chất mới gồm Wedtriloside A, Wedtriloside B, Wednenic và Wednenol, đồng thời xác định cấu hình lập thể chính xác nhờ phương pháp Mosher và thủy phân chọn lọc. Các kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm, ức chế enzyme $\alpha$-amylase, $\alpha$-glucosidase và gây độc tế bào ung thư đã cung cấp dữ liệu khoa học tin cậy, làm sáng tỏ giá trị sử dụng của hai loài dược liệu họ Cúc trong y học cổ truyền và mở ra định hướng nghiên cứu phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.