Luận án tiến sỹ hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của hai loài hải miên

Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos tại Việt Nam.

• Tác giả: Đỗ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Văn Kiệm
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Giới thiệu chung về hải miên
• 1.2. Tổng quan về hải miên thuộc giống Rhabdastrella
• 1.2.1. Giới thiệu chung
• 1.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
• 1.3. Tổng quan về hải miên thuộc giống Aaptos
• 1.3.1. Giới thiệu chung về hải miên thuộc giống Aaptos
• 1.3.2. Thành phần hóa học của loài hải miên giống Aaptos
• 1.3.3. Hoạt tính sinh học của loài hải miên giống Aaptos
• 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.1.1. Loài hải miên Rhabdastrella globostellata (Carter, 1883)
• 2.1.2. Loài hải miên Aaptos aaptos (Schmidt, 1864)
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
• 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.3. Phân lập các hợp chất
• 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên R.
• 2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên A.
• 2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được
• 2.4.1. Thông số vật lý của các hợp chất phân lập từ loài hải miên R.
• 2.4.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài hải miên A.
• 2.5. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được
• 2.5.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài R.
• 2.5.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài Aaptos aaptos
• 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
• 3.1. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của loài R.
• 3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài R.
• 3.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài R.
• 3.4. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ loài A.
• 3.4.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài A.
• 3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài A.
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung về hóa học hải miên

Hóa học hải miên là lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong khoa học tự nhiên, đặc biệt là trong việc khám phá các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Hải miên là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất hóa học độc đáo, nhiều trong số đó có tiềm năng ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong điều trị ung thư. Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos là hai loài hải miên được nghiên cứu trong luận án này, với mục tiêu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chúng. Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc hiểu biết sâu hơn về hóa học hải miên mà còn mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong phát triển thuốc điều trị ung thư.

1.1. Tổng quan về hải miên

Hải miên thuộc ngành động vật thân lỗ Porifera, là nhóm động vật đa bào nguyên thủy nhất hiện còn sống. Chúng có cấu trúc cơ thể đơn giản, không có hệ thần kinh, tiêu hóa hay tuần hoàn. Hải miên sống bám đáy và phân bố rộng khắp từ vùng thủy triều đến độ sâu hơn 8800m. Chúng được chia thành bốn lớp chính: Demospongiae, Calcarea, Hexactinellida và Homoscleromorpha. Hóa học hải miên đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học từ những năm 1950, với nhiều hợp chất mới được phát hiện hàng năm, đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu hóa học hải miên

Nghiên cứu thành phần hóa học của hải miên không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của các hợp chất tự nhiên mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y học. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất từ hải miên đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu, đặc biệt là trên các dòng tế bào ung thư phổi, vú, gan và da. Việc khám phá các hợp chất mới từ Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos tại Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Luận án sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos. Các hợp chất được phân lập bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá trên các dòng tế bào ung thư phổi (LU1), vú (MCF7), gan (HepG2) và da (SKMel2). Kết quả cho thấy nhiều hợp chất có tiềm năng cao trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

2.1. Phương pháp phân lập hợp chất

Các hợp chất từ Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos được phân lập bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Quá trình này bao gồm các bước chiết xuất, tách chiết và tinh chế các hợp chất từ mẫu hải miên. Các hợp chất được xác định cấu trúc bằng phổ NMR, bao gồm phổ 1H-NMR, 13C-NMR và các phổ tương tác như HMBC và COSY. Phương pháp này đảm bảo độ chính xác cao trong việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.

2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các dòng tế bào ung thư phổi (LU1), vú (MCF7), gan (HepG2) và da (SKMel2). Kết quả cho thấy nhiều hợp chất có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào ung thư, với giá trị IC50 thấp. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của các hợp chất từ Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả.

III. Thảo luận và ứng dụng

Nghiên cứu này đã làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos tại Việt Nam. Các hợp chất phân lập được có cấu trúc độc đáo và hoạt tính sinh học mạnh, đặc biệt là trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.

3.1. Đóng góp của nghiên cứu

Luận án đã đóng góp quan trọng vào việc làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos. Các hợp chất mới được phát hiện có cấu trúc độc đáo và hoạt tính mạnh, đặc biệt là trong việc ức chế tế bào ung thư. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Các hợp chất từ Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos có tiềm năng ứng dụng cao trong việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này đã được chứng minh qua các thử nghiệm in vitro, mở ra cơ hội ứng dụng trong y học. Nghiên cứu này cũng góp phần vào việc bảo tồn và khai thác bền vững nguồn tài nguyên biển tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Nghiên cứu các chất chuyển hóa thứ cấp từ sinh vật biển nhằm tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính gây độc tế bào ung thư, là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của giới khoa học. Thống kê quốc tế ghi nhận trung bình mỗi năm có khoảng 10% hợp chất mới từ biển được công bố, trong đó ngành Thân lỗ (Porifera - hải miên) và ruột khoang chiếm phần lớn số lượng phát hiện mới. Nhiều loại thuốc có nguồn gốc từ hải miên đã được phê duyệt và lưu hành thương mại trong điều trị ung thư và nhiễm khuẩn như Cytarabine, Vidarabine, Halaven và Trabectedin.

Việt Nam sở hữu vùng biển đặc quyền kinh tế hơn 1 triệu km² cùng bờ biển dài 3.260 km, tồn tại hệ sinh thái nhiệt đới với hơn 300.000 loài động thực vật biển. Tuy nhiên, các khảo sát chuyên sâu về hóa học và hoạt tính sinh học của các loài hải miên tại vùng biển Việt Nam mới bắt đầu được đẩy mạnh từ năm 2006. Đặc biệt, hai giống hải miên Rhabdastrella và Aaptos phân bố tại vùng biển miền Trung chứa đựng tiềm năng hóa sinh lớn nhưng chưa được làm rõ đầy đủ về thành phần hóa học và phổ hoạt tính gây độc tế bào ung thư.

Luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Đỗ Thị Trang với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos ở Việt Nam" (chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số 9.14) được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phan Văn Kiệm và TS. Bùi Hữu Tài, được tài trợ kinh phí bởi đề tài TĐDLB0.

Mục tiêu cụ thể của luận án được xác định gồm:

1. Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata (Carter, 1883) và Aaptos aaptos (Schmidt, 1864) thu tại vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa.
2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được trên 4 dòng tế bào ung thư ở người: ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF-7), ung thư biểu mô gan (HepG2) và ung thư da (SK-Mel-2).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng hóa sinh: Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp chiết xuất và phân lập từ hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos.
• Địa bàn và thời gian thu mẫu: Cả hai mẫu sinh vật đều được thu thập tại khu vực vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa vào tháng 5 năm 2020. Mẫu R. globostellata (40 kg tươi) được định danh phân tử bởi TS. Trần Mỹ Linh (mã tiêu bản NCCT-B139); mẫu A. aaptos (30 kg tươi) được giám định hình thái bởi GS. Đỗ Công Thung (mã tiêu bản NCCT-70), đều được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống về đặc điểm sinh học ngành Porifera (gồm 4 lớp: Demospongiae chiếm 83%, Calcarea chiếm 8%, Hexactinellida chiếm 8% và Homoscleromorpha chiếm 1%), lịch sử nghiên cứu hóa học hải miên bắt đầu từ công trình của Bergmann và Feeney (1950) trên loài Tethya crypta, dẫn đến các dược chất Cytarabine và Vidarabine.

Đối với giống Rhabdastrella (họ Ancorinidae, bộ Astrophorida, lớp Demospongiae):

• Cơ sở dữ liệu Scifinder ghi nhận 52 công trình tập trung vào 3 loài: Rhabdastrella globostellata, Rhabdastrella aff. distincta và Rhabdastrella providentiae.
• Khung cấu trúc đặc trưng nhất là isomalabaricane triterpenoid với hệ 3 vòng 6,6,5 ngưng tụ kiểu trans-syn-trans kết hợp mạch nhánh polyene liên hợp:
  • Năm 1997, nhóm tác giả Trung Quốc phân lập rhabdastrellic acid-A (R1) từ Rhabdastrella. Năm 2008, công trình nghiên cứu chứng minh R1 gây độc tế bào ung thư bạch cầu HL-60 (IC50 = 0,68 µg/mL) và tế bào ung thư buồng trứng A-2780 (IC50 = 4,23 µM), cùng các dòng A-549, BGC-823, HCT-8, Bel-7402.
  • Các dẫn xuất stellettin-E (R2), stellettin C và D (R39, R40) được Li và cộng sự phân lập, chỉ ra đồng phân hình học 13Z có hoạt tính ức chế dòng tế bào HL-60 (IC50 = 0,01 µM) mạnh hơn đồng phân 13E (IC50 = 3,61 µM).
  • Năm 2006, 14 hợp chất isomalabaricane được tìm thấy từ R. globostellata, bao gồm các dẫn xuất mang gốc đường hiếm gặp như 13E-stelliferin riboside (R5), 3-O-deacetyl-13Z-stelliferin riboside (R6), globostelletin (R7), acid globostellatic F-M (R8-R15). Clement và cộng sự phân lập stelliferin riboside (R24), 3-epi-29-acetoxystelliferin E (R25), stellettin J-K (R26-R27). Aoki và cộng sự phân lập 4 đồng phân hình học của globostellatic-X methyl ester (R28-R31).
  • Hirashima và cộng sự mô tả con đường sinh tổng hợp tạo vòng cyclopentane ở mạch nhánh qua liên kết C17-C24 (R43-R49, globostelletin Q - R57).
  • Các hợp chất isomalabaricane nortriterpenoid (khung 29C và khung cắt ngắn 16C–27C): Isogeoditin A (R59) và (13E)-isogeoditin A (R60) từ Rhabdastrella aff. distincta; 8 hợp chất R66-R73 thu tại New Caledonia (năm 2000); globostelletin A-I (R78-R86) và jaspolide F (R87) thử nghiệm trên dòng A2780 cho thấy hoạt tính phụ thuộc vào chiều dài liên kết đôi và nhóm định chức aldehyde/carboxyl ở cuối mạch.
  • Nhóm nghiên cứu của Viện Hóa sinh biển trước đó đã phân lập rhabdaprovidine G (R36) từ R. providentiae (năm 2018, ức chế NO trên tế bào microglia BV2 với IC50 = 19,4 µM) và dãy hợp chất R88-R95 (năm 2020), trong đó R95 có cấu trúc vòng lactone C8-C12 kiểu trans-syn-cis.

Đối với giống Aaptos (họ Suberitidae, bộ Hadromerida, lớp Demospongiae):

• Khoảng 20 loài đã được định danh, tập trung 123 nghiên cứu trên các loài A. aaptos, A. suberitoides, A. ciliata.
• Hơn 2/3 hợp chất từ giống Aaptos là nhóm aaptamine alkaloid chứa khung [1,6]naphthyridine:
  • Năm 1982, Nakamura và cộng sự lần đầu tiên phân lập aaptamine (A1) từ A. aaptos ở Okinawa. Tiếp đó là demethylaaptamine (A2), demethyloxyaaptamine (A3), isoaaptamine (A9), aaptic acid (A11).
  • Utkina và cộng sự phân lập aaptanone (A14) và N-demethylaaptanone (A15) dạng lưỡng cực zwitterion từ A. aaptos biển Việt Nam.
  • Năm 2019, các dẫn xuất gắn nhóm amino bậc 1 và bậc 2 ở vị trí C-8 (A21-A26) cùng khung 5,8-diazabenz[cd]azulene (aaptosine - A27, aaptosamine - A28) được phát hiện tại Malaysia. Liu và cộng sự công bố suberitine A-D (A29-A32) dạng dimer từ A. suberitoides. Khung 4 vòng ngưng tụ (A33-A46) được ghi nhận với cấu trúc triazapyrene hoặc imidazole ngưng tụ [1,6]naphthyridine.
  • Về hoạt tính sinh học: Aaptamine (A1) gây độc tế bào ung thư HeLa (IC50 = 15 µg/mL; Tsukamoto, 2010), K562 (GI50 = 10 µM, bắt giữ pha G2/M và tăng biểu hiện p21; Jin, 2011), kháng HSV-1 và kích thích phát triển rễ cây. Các dẫn xuất A21, A22 ức chế mạnh tế bào HL-60 và K562 (IC50 < 0,1 µM; Yu, 2014) và ức chế HIV-1.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Mặc dù vùng biển vịnh Vân Phong có điều kiện sinh thái đặc thù, các nghiên cứu trước đây về R. globostellata và A. aaptos tại khu vực này chưa bao quát đầy đủ sự đa dạng hóa học của các phân đoạn phân cực trung bình và yếu, chưa phân lập và xác định cấu hình lập thể tuyệt đối của các đồng phân isomalabaricane mới và dẫn xuất aaptamine hiếm, đồng thời thiếu dữ liệu sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào chuẩn hóa trên 4 dòng tế bào ung thư người (LU-1, MCF-7, HepG2, SK-Mel-2).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp phương pháp chiết tách sắc ký hiện đại, phân tích phổ thực nghiệm đa chiều, hóa học tính toán mô phỏng lượng tử và thử nghiệm sinh học chuẩn quốc tế.

Phương pháp phân lập và tinh sạch hóa học

• Chiết xuất mẫu: Chiết ngâm siêu âm mẫu tươi thái nhỏ với methanol (MeOH, 3 lần × 50 L, mỗi lần 2 giờ) ở nhiệt độ phòng, cô hồi lưu áp suất giảm thu cặn tổng MeOH. Phân bố lỏng - lỏng giữa nước và dichloromethane (CH2Cl2) để thu phân đoạn tan trong CH2Cl2.
• Kỹ thuật sắc ký:
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng pha thường Silica gel 60 F254 và pha đảo RP-18 F254S (Merck); phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff, soi đèn UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun dung dịch H2SO4 10% sấy nóng hiện màu.
  • Sắc ký cột (CC): Pha tĩnh Silica gel cỡ hạt 0,040–0,063 mm (240–430 mesh), pha đảo RP-18 (kích thước hạt 150 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.), và hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical).
  • Sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế (HPLC): Máy AGILENT 1100, cột J'sphere ODS H-80 (kích thước 250 mm × 20 mm), tốc độ dòng 3 mL/phút, đầu dò UV đa bước sóng (205, 230, 254, 280 nm).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học và lập thể

• Phổ khối lượng phân giải cao: Máy đo AGILENT 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS sử dụng nguồn ion hóa phun mù điện tử (HR-ESI-MS) ở chế độ ion dương [M+H]+ và ion âm [M-H]-, [M+Cl]-.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Máy đo Bruker AM500 FT-NMR (tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR), chất nội chuẩn Tetramethylsilane (TMS). Sử dụng các kỹ thuật phổ 1D (1H, 13C, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY) đo trong các dung môi CD3OD, CDCl3, DMSO-d6.
• Độ quay cực: Đo trên phân cực kế tự động JASCO P-2000 Polarimeter ở vạch D của natri (bước sóng 589 nm).
• Phổ lưỡng sắc tròn (CD): Đo trên máy Chirascan CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., UK).
• Hóa học tính toán lượng tử mô phỏng cấu hình lập thể:
  • Tìm kiếm cấu dạng không gian: Sử dụng phần mềm Spartan 18 với trường lực cơ học phân tử MMFF kết hợp phương pháp bán thực nghiệm PM3. Các cấu dạng có hệ số phân bố Boltzmann > 1% được chọn để tối ưu hóa hình học.
  • Tính toán phổ ECD lý thuyết: Phương pháp phiếm hàm mật độ phụ thuộc thời gian (TD-DFT) trên phần mềm Gaussian 16, sử dụng các phiếm hàm và bộ hàm cơ sở B3LYP/6-31G(d,p), CAM-B3LYP/6-31G(d,p) hoặc wB97XD/6-31G(d,p). Mô hình dung môi methanol IEFPCM được áp dụng. Phổ ECD trung bình theo phân bố Boltzmann được xử lý và xuất qua phần mềm SpecDis v1.71 để so sánh với phổ đo thực nghiệm.
  • Tính toán dịch chuyển hóa học 13C-NMR lý thuyết: Tối ưu hóa trên Gaussian 16 (mức wB97XD/6-31G(d)), tính toán che chắn từ bằng phương pháp GIAO và phân tích sai số theo mô hình thống kê STS (Sorted Training Sets).
  • Tính toán khoảng cách liên proton: Tối ưu hóa cấu trúc trên Gaussian 16 để tính khoảng cách không gian (Å) giữa các proton tương ứng với tương tác NOE thực tế.
  • Phổ phức chất với Mo2(OAc)4: Xác định cấu hình tuyệt đối của các nhóm diol liền kề.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

• Phương pháp thử độc tính tế bào: Phép thử Sulforhodamine B (SRB) chuẩn theo hướng dẫn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI - Skehan, 1990), thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học - VAST.
• Nguyên lý: Nhuộm protein tổng số của tế bào sống bằng thuốc nhuộm SRB gắn tĩnh điện, đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek). Mật độ quang tỷ lệ thuận với lượng tế bào sống trong giếng thử nghiệm.
• Dòng tế bào thử nghiệm: 4 dòng tế bào ung thư người gồm LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư biểu mô gan), SK-Mel-2 (ung thư da).
• Điều kiện thử nghiệm: Ủ tế bào trong đĩa 96 giếng với các dải nồng độ chất thử trong 72 giờ tại 37 °C, cố định tế bào bằng trichloroacetic acid (TCA) 20%, rửa acid acetic 1%, hòa tan SRB bằng dung dịch Tris base 10 mM.
• Đối chứng: Ellipticine (ở các nồng độ 10; 2; 0,4; 0,08 µg/mL) làm đối chứng dương; dung dịch DMSO 1% làm đối chứng âm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần độc lập.
• Xử lý số liệu: Giá trị nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào (IC50) được tính toán bằng phần mềm TableCurve 2Dv4.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu trình bày tổng quan về tiềm năng dược liệu biển, tầm quan trọng của việc nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ hải miên biển Việt Nam, xác định tính cấp thiết, mục tiêu và 3 nội dung nghiên cứu chính của luận án.

Tổng quan

Nội dung chương Tổng quan phân tích toàn diện các cơ sở lý luận và tài liệu khoa học liên quan:

• Giới thiệu tổng quan về ngành Thân lỗ, phân loại học 4 lớp, đặc điểm sinh thái thích nghi và lịch sử khai thác hợp chất thứ cấp.
• Tổng quan cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của giống Rhabdastrella: Phân loại 95 hợp chất isomalabaricane triterpenoid (58 chất khung 30C đầy đủ và 37 chất nortriterpenoid khung < 30C), phân tích các quy luật hóa học lập thể hệ ba vòng 6,6,5 ngưng tụ trans-syn-trans, cơ chế đồng phân hình học 13Z/13E và 17Z/17E trên mạch nhánh polyene, sự hình thành dị vòng lactone, epoxy và cyclopentane, cùng các phổ hoạt tính độc tế bào ung thư, kháng viêm qua ức chế NO trên tế bào microglia BV2.
• Tổng quan cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của giống Aaptos: Tổng hợp 62 hợp chất đã biết với 47 aaptamine alkaloid (chứa nhân benzo[de][1,6]naphthyridine 3 vòng, 4 vòng, dạng zwitterion và dạng dimer), hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư máu K562, HeLa, MCF-7, kháng virus HSV-1, kháng khuẩn Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis và kháng retrovirus HIV-1.

Thực nghiệm và kết quả

Chương Thực nghiệm và kết quả mô tả chi tiết quy trình xử lý 40 kg mẫu hải miên R. globostellata và 30 kg mẫu hải miên A. aaptos, quy trình chiết phân đoạn, phân lập tinh sạch bằng sắc ký cột kết hợp HPLC bán điều chế, bảng thông số vật lý, độ quay cực, dữ kiện phổ khối HR-ESI-MS, phổ NMR (1D, 2D) và kết quả thử hoạt tính độc tế bào in vitro.

Quy trình phân lập từ Rhabdastrella globostellata

Từ 40 kg mẫu tươi chiết MeOH thu 420 g cặn chiết tổng, phân bố lỏng - lỏng thu 320,0 g cặn chiết CH2Cl2. Sắc ký cột Silica gel giải hấp gradient CH2Cl2/MeOH thu 4 phân đoạn RD1–RD4:

• Từ phân đoạn RD2 (200,0 g): Sắc ký cột Silica gel (n-hexan/acetone) thu RD2A–RD2D. Phân đoạn RD2B qua cột RP-18 và HPLC (cột J'sphere ODS H-80, 30% ACN/nước) thu được RG11 (7,3 mg, tR = 22,4 phút) và RG6 (15,2 mg, tR = 42,3 phút). Phân đoạn RD2C qua cột RP-18 và HPLC (60–65% ACN/nước) phân lập được RG1 (5,9 mg, tR = 38,0 phút), RG2 (17,5 mg, tR = 48,7 phút), RG3 (5,2 mg, tR = 34,0 phút) và RG7 (6,2 mg, tR = 58,8 phút).
• Từ phân đoạn RD3 (60,0 g): Qua cột RP-18 (MeOH/nước 3:1) thu RD3A–RD3D. Phân đoạn RD3A qua Silica gel và HPLC (22% ACN/nước) thu được RG12 (5,2 mg, tR = 53,3 phút). Phân đoạn RD3C qua Silica gel (n-hexan/EtOAc 2:1) và HPLC tinh chế thu được RG10 (5,4 mg, 70% ACN), RG8 (5,8 mg, 70% ACN), RG9 (5,7 mg, 95% ACN), RG4 (10,0 mg, 85% ACN) và RG5 (19,5 mg, 70% ACN).

Mã chất	Tên hợp chất	Phân loại / Tính chất	Công thức phân tử	Khối lượng phân tử (g/mol)	Phổ HR-ESI-MS (m/z)	Độ quay cực $[\alpha]_D^{25}$
RG1	Rhabdaglostelone A	Mới / Gel vàng	C30H38O5	478	479,2795 [M+H]+	+58,4 (c 0,1, MeOH)
RG2	Rhabdaglostelone B	Mới / Gel vàng	C30H38O5	478	479,2791 [M+H]+	-39,7 (c 0,1, MeOH)
RG3	Rhabdaglostelone C	Mới / Gel vàng	C29H38O5	466	467,2797 [M+H]+	-22,5 (c 0,1, MeOH)
RG4	Rhabdastrenone A	Mới / Sáp không màu	C29H40O3	436	437,3040 [M+H]+	-32,4
RG5	Rhabdastrenone B	Mới / Sáp không màu	C30H48O4	472	507,3219 [M+Cl]-	-25,2
RG6	Rhabdastrenone C	Mới / Dầu vàng	C30H42O5	482	483,3093 [M+H]+	-27,0
RG7	Rhabdastrellin G	Đã biết / Dầu không màu	C29H38O4	450	—	-42,5 (c 0,1, MeOH)
RG8	Isogeoditin A	Đã biết / Dầu vàng nhạt	C29H38O4	450	—	+23,7 (c 0,1, MeOH)
RG9	Stelliferin A	Đã biết / Dầu không màu	C32H48O4	496	—	-62,3 (c 0,1, MeOH)
RG10	13-(E)-isogeoditin A	Đã biết / Dầu vàng	C29H38O4	450	—	-15,8 (c 0,1, MeOH)
RG11	Rhabdastrenone D	Mới / Dầu vàng nhạt	C8H10O3	154	155,0706 [M+H]+	-79,7 (c 0,1, MeOH)
RG12	2,3-dihydro-3-hydroxy-2-methylinden-1-one	Đã biết / Dầu vàng	C10H10O2	162	—	—

Quy trình phân lập từ Aaptos aaptos

Từ 30 kg mẫu tươi chiết MeOH thu 490 g cặn tổng, chiết phân bố thu 215,0 g cặn CH2Cl2 (AD). Phân tách qua cột Silica gel gradient (CH2Cl2/MeOH 1:0 → 0:1) thu 7 phân đoạn AD1–AD7:

• Phân đoạn AD2 (15,3 g): Qua cột RP-18 (MeOH/nước 1,5:1) và Silica gel cột pha thường thu được AA6 (18,2 mg, dung môi CH2Cl2/acetone 8:1), AA2 (13,9 mg) và AA7 (20,6 mg, dung môi EtOAc/MeOH/nước 9:1:0,1).
• Phân đoạn AD5 (21,3 g): Qua cột Silica gel (hexane/EtOAc 3:1) thu AD5A–AD5E. Phân đoạn AD5A qua cột Silica gel (CH2Cl2/MeOH 10:1) thu được AA3 (9,0 mg) và AA8 (22,1 mg). Phân đoạn AD5C qua cột Silica gel (CH2Cl2/acetone 2:1) thu được AA4 (5,3 mg). Phân đoạn AD5D qua cột Silica gel và HPLC (15% ACN) thu được AA9 (9,8 mg). Phân đoạn AD5E qua cột YMC (acetone/nước 1:1) và Silica gel (CH2Cl2/EtOAc 2:1) thu được AA1 (6,4 mg) và AA5 (9,6 mg).

Thảo luận kết quả

Chương Thảo luận kết quả phân tích lập luận hóa học chi tiết cấu trúc từng hợp chất và đối chiếu hoạt tính sinh học:

1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ Rhabdastrella globostellata:

• Nhóm hợp chất mới rhabdaglostelone A–C (RG1–RG3): Các hợp chất isomalabaricane triterpenoid có khung cyclopentenone hoặc mạch polyene biến đổi. Cấu hình lập thể của RG1 và RG2 được xác định dựa trên tương tác phổ NOESY, tính toán khoảng cách liên proton H9–H17/H16 trên các cấu dạng tối ưu bằng Gaussian 16 và tính toán phổ ECD lý thuyết TD-DFT so sánh với phổ thực nghiệm, khẳng định cấu hình tuyệt đối (5R,8S,9S,10R,12R,16R) cho RG1 và (5R,8S,9S,10R,12R,16S) cho RG2. Cấu hình lập thể của RG3 được giải quyết bằng phương pháp GIAO tính toán phổ 13C-NMR lý thuyết kết hợp mô hình thống kê STS và phổ TD-DFT ECD cho dạng đồng phân (5R,8S,9S,10R,12S,16R,23R).
• Nhóm hợp chất mới rhabdastrenone A–D (RG4–RG6, RG11): RG4 là isomalabaricane nortriterpene; RG5 và RG6 có cấu hình nhóm diol xác định thông qua phổ ECD của phức tạo với Mo2(OAc)4; RG11 là hợp chất thơm phân tử nhỏ (C8H10O3) được xác định cấu hình lập thể qua tính toán phổ ECD cho cặp đối quang 7R/7S.
• Các hợp chất đã biết (RG7–RG10, RG12): Cấu trúc được xác định qua phân tích phổ 1D, 2D-NMR và so sánh đối chiếu với các dữ liệu phổ chuẩn đã công bố.

2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ Aaptos aaptos:

• Phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 9 hợp chất aaptamine alkaloid (AA1–AA9). Hợp chất AA1 được so sánh chi tiết dữ liệu phổ NMR trong dung môi CD3OD và DMSO-d6 với hợp chất tham khảo N-demethylaaptanone.
• Hợp chất AA9 được xác định cấu hình tuyệt đối tại tâm bất đối C-9 thông qua tính toán phổ TD-DFT ECD lý thuyết cho hai đồng phân đối quang 9R và 9S so sánh với phổ ECD thực nghiệm.
• Cấu trúc các hợp chất AA2–AA8 được khẳng định qua hệ tương tác trên phổ HMBC, HSQC, COSY và NOESY.

3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập:

• Các hợp chất từ R. globostellata (RG1–RG12) và A. aaptos (AA1–AA9) được đánh giá độc tính tế bào in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư người (LU-1, MCF-7, HepG2, SK-Mel-2) theo phương pháp SRB, lấy Ellipticine làm đối chứng dương.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả khoa học chính như sau:

1. Về mặt hóa học:

• Đã phân lập được tổng số 21 hợp chất từ hai loài hải miên thu tại vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa.
• Từ loài Rhabdastrella globostellata: Phân lập và xác định cấu trúc của 12 hợp chất (RG1–RG12), trong đó có 7 hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện trong tự nhiên gồm rhabdaglostelone A (RG1), rhabdaglostelone B (RG2), rhabdaglostelone C (RG3), rhabdastrenone A (RG4), rhabdastrenone B (RG5), rhabdastrenone C (RG6) và rhabdastrenone D (RG11), cùng 5 hợp chất đã biết (RG7–RG10, RG12).
• Từ loài Aaptos aaptos: Phân lập và xác định cấu trúc của 9 hợp chất aaptamine alkaloid (AA1–AA9).
• Đã ứng dụng thành công sự kết hợp giữa phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D (COSY, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, phổ lưỡng sắc tròn phức chất Mo2(OAc)4 và các phương pháp hóa học tính toán lượng tử (TD-DFT ECD, GIAO STS 13C-NMR, tính khoảng cách liên proton) để giải quyết cấu hình tuyệt đối của các tâm lập thể phức tạp trên khung isomalabaricane và aaptamine alkaloid.

2. Về mặt hoạt tính sinh học:

• Đã thử nghiệm và cung cấp bộ dữ liệu hoàn chỉnh về hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập trên 4 dòng tế bào ung thư người (LU-1, MCF-7, HepG2, SK-Mel-2).
• Kết quả sàng lọc đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho nghiên cứu mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học (SAR) của nhóm hợp chất isomalabaricane triterpenoid và aaptamine alkaloid từ sinh vật biển Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung thực tế của luận án:

• Mẫu hải miên mới được thu thập tại một vùng địa lý duy nhất là vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa vào thời điểm tháng 5/2020, chưa khảo sát sự biến đổi thành phần chuyển hóa thứ cấp theo mùa hoặc theo các vùng biển khác của Việt Nam.
• Hoạt tính sinh học của các hợp chất mới chủ yếu tập trung vào thử nghiệm sàng lọc độc tính tế bào in vitro theo phương pháp nhuộm SRB trên 4 dòng tế bào ung thư người tiêu chuẩn; chưa đi sâu nghiên cứu cơ chế phân tử chi tiết (như sự điều hòa chu kỳ tế bào, con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt, hoặc con đường apoptosis) đối với các hợp chất mới phân lập được do giới hạn về lượng mẫu tinh khiết.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: Mở rộng diện tích khảo sát thu mẫu tại các vùng biển đảo khác; tối ưu hóa quy trình phân lập để thu nhận hàm lượng lớn hơn các hợp chất mới phục vụ thử nghiệm in vivo và làm rõ cơ chế tác động dược lý ở mức độ phân tử.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao cho các đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp quy trình chi tiết về chiết tách, sắc ký cột phân đoạn, sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế (HPLC) và hệ thống dữ liệu phổ thực nghiệm (HR-ESI-MS, 1D/2D-NMR) của nhóm isomalabaricane triterpenoid và aaptamine alkaloid.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu cấu trúc hóa học: Cung cấp phương pháp luận mẫu mực trong việc kết hợp dữ liệu phổ NOESY với tính toán lượng tử mô phỏng TD-DFT ECD, tính toán khoảng cách liên proton và mô hình thống kê GIAO STS 13C-NMR để xác định cấu hình lập thể tuyệt đối cho các phân tử thiên nhiên phức tạp.
• Các phòng thí nghiệm sinh học dược phẩm: Bổ sung dữ liệu thử nghiệm hoạt tính độc tế bào in vitro chuẩn hóa theo quy trình NCI làm cơ sở định hướng sàng lọc các hoạt chất kháng ung thư từ tài nguyên biển Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện bao nhiêu hợp chất mới và thuộc các nhóm cấu trúc nào?

Luận án đã phát hiện và làm sáng tỏ cấu trúc của 7 hợp chất mới từ loài hải miên Rhabdastrella globostellata, gồm:

• Rhabdaglostelone A (RG1, công thức C30H38O5).
• Rhabdaglostelone B (RG2, công thức C30H38O5).
• Rhabdaglostelone C (RG3, công thức C29H38O5).
• Rhabdastrenone A (RG4, công thức C29H40O3).
• Rhabdastrenone B (RG5, công thức C30H48O4).
• Rhabdastrenone C (RG6, công thức C30H42O5).
• Rhabdastrenone D (RG11, công thức C8H10O3). Các hợp chất mới này chủ yếu thuộc lớp isomalabaricane triterpenoid/nortriterpenoid và dẫn xuất liên quan.

2. Hai loài hải miên nghiên cứu trong luận án được thu thập ở đâu và định danh như thế nào?

Cả hai loài hải miên đều được thu thập tại vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa vào tháng 5 năm 2020:

• Loài Rhabdastrella globostellata (khối lượng 40 kg tươi) được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử bởi TS. Trần Mỹ Linh (Viện Hóa sinh biển, VAST), lưu mẫu tiêu bản mã số NCCT-B139.
• Loài Aaptos aaptos (khối lượng 30 kg tươi) được định danh bởi GS. Đỗ Công Thung (Viện Tài nguyên và Môi trường biển, VAST), lưu mẫu tiêu bản mã số NCCT-70.

3. Tác giả đã sử dụng những công cụ hóa học lượng tử nào để giải quyết cấu hình tuyệt đối của các hợp chất?

Tác giả đã sử dụng chuỗi công cụ tính toán mô phỏng lượng tử hiện đại:

• Tìm kiếm cấu dạng không gian trên phần mềm Spartan 18 (phương pháp MMFF và bán lượng tử PM3).
• Tối ưu hóa năng lượng hình học và tính toán phổ hấp thụ quang học lưỡng sắc tròn lý thuyết (TD-DFT ECD) trên phần mềm Gaussian 16 với các hàm cơ sở B3LYP/6-31G(d,p), CAM-B3LYP/6-31G(d,p) hoặc wB97XD/6-31G(d,p), tính hiệu ứng dung môi theo mô hình IEFPCM, xử lý xuất phổ qua SpecDis v1.71.
• Tính toán dịch chuyển hóa học 13C-NMR bằng phương pháp GIAO wB97XD/6-31G(d) kết hợp phân tích tương quan thống kê thực nghiệm theo mô hình STS (Sorted Training Sets).
• Tính toán khoảng cách không gian giữa các nguyên tử proton trên mô hình phân tử để kiểm chứng tương tác NOE thực tế.
• Đo phổ CD của phức chất tạo với Mo2(OAc)4 để xác định cấu hình tuyệt đối nhóm diol liền kề.

4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được đánh giá trên những dòng tế bào ung thư nào và bằng phương pháp gì?

Hoạt tính được thử nghiệm in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư ở người tại Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học (VAST):

• Dòng LU-1 (ung thư phổi).
• Dòng MCF-7 (ung thư vú).
• Dòng HepG2 (ung thư biểu mô gan).
• Dòng SK-Mel-2 (ung thư da). Phương pháp đánh giá là phép thử nhuộm Sulforhodamine B (SRB) chuẩn của NCI (Skehan, 1990), sử dụng đối chứng dương là Ellipticine và đối chứng âm là DMSO 1%, xác định giá trị IC50 qua phần mềm TableCurve 2Dv4.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đỗ Thị Trang là công trình nghiên cứu thực nghiệm chuyên sâu thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ, khảo sát toàn diện thành phần hóa học và hoạt tính độc tế bào của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos tại vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc của 21 hợp chất, trong đó phát hiện 7 hợp chất mới thuộc khung isomalabaricane và dẫn xuất, ứng dụng chuẩn mực các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều kết hợp hóa học lượng tử mô phỏng TD-DFT ECD và GIAO STS 13C-NMR để xác định cấu hình lập thể tuyệt đối. Các kết quả thử nghiệm sinh học trên 4 dòng tế bào ung thư người (LU-1, MCF-7, HepG2, SK-Mel-2) cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc nghiên cứu phát triển các hoạt chất sinh học tự nhiên từ nguồn tài nguyên sinh vật biển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ sinh vật biển ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới. Theo thống kê, trung bình mỗi năm có 10% hợp chất mới có nguồn gốc từ sinh vật biển được công bố, bao gồm rất nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý báu. Đa số các hợp chất mới được phát hiện từ các loài hải miên và động vật ruột khoang. Trong các hoạt tính được thử nghiệm, hoạt tính chống ung thư luôn chiếm tỷ lệ lớn.

Bên cạnh đó, những nỗ lực tìm kiếm thuốc giảm đau, kháng sinh, kháng viêm cũng đang đạt được nhiều thành quả. Với sự hỗ trợ của các kỹ thuật tiên tiến, các hoạt chất từ thiên nhiên có hàm lượng nhỏ đã dần dần được phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học. Rất nhiều thuốc có nguồn gốc từ sinh vật biển đã có mặt trên thị trường do các hãng dược lớn trên thế giới cung cấp, như là: Cytarabine, Halaven, Ziconotide, Vidarabine, Trabectedin… Việt Nam là quốc gia được thiên nhiên ưu đãi, có bờ biển dài 3260 km từ Bắc xuống Nam với hơn 3000 hòn đảo và khoảng 1 triệu km2 diện tích vùng biển chủ quyền (gấp 3 lần diện tích đất liền). Đồng thời, nước ta ở vào vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đã tạo nên hệ sinh vật biển vô cùng đa dạng cả về thành phần loài và trữ lượng với hơn 300.000 loài động thực vật biển như hải miên, san hô, rong biển, ruột khoang, rêu biển, thân mềm, các loài vi sinh vật biển… Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hóa học và các hợp chất có hoạt tính sinh học từ sinh vật biển nói chung và hải miên nói riêng mới được chỉ được nghiên cứu từ năm 2006 trở lại đây.

Vì thế, hướng nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hải miên nói riêng và sinh vật biển nói chung ở nước ta là rất quan trọng. Xuất phát từ điểm đó, tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos ở Việt Nam”. Mục tiêu của luận án: - Nghiên cứu để làm rõ được thành phần hóa học chủ yếu của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata (Carter, 1883) và Aaptos aaptos (Schmidt, 1864) thu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. 2 - Đánh giá được hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập trên 4 dòng tế bào ung thư ở người: ung thư phổi (LU1), ung thư vú (MCF7), ung thư gan (HepG2) và ung thư da (SKMel2).

Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất chính từ hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos thu ở vịnh Vân Phong, Khánh Hòa. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập.

Giới thiệu chung về hải miên Hải miên là tên gọi được sử dụng cho ngành động vật thân lỗ Porifera (pore bearer, động vật ăn lọc). Đây là nhóm động vật đa bào nguyên thủy nhất hiện còn sống [1]. Cơ thể của chúng bao gồm một lớp trung mô dạng thạch được kẹp giữa hai màng tế bào mỏng. Trong khi tất cả các loài động vật khác có các tế bào chưa biệt hóa có thể chuyển thành các dạng tế bào chuyên biệt khác nhau thì duy nhất các loài hải miên có một số tế bào đã được biệt hóa mà vẫn có thể chuyển thành các dạng tế bào khác; thông thường chúng di chuyển giữa các màng tế bào cơ bản và lớp trung mô.

Cấu tạo cơ thể của hải miên rất đơn giản, không có hệ thần kinh, hệ tiêu hóa hoặc hệ tuần hoàn. Hải miên thường có hình cốc, chứa nhiều lỗ để thích nghi tối đa với việc duy trì hiệu quả của dòng nước chảy qua cơ thể từ đó lấy thức ăn (ăn lọc) và oxy để nuôi sống cơ thể cũng như để loại bỏ các chất thải. Phần lớn hải miên sinh sống ở biển, sống bám đáy và phân bố rộng khắp từ các vùng thủy triều cho tới tận độ sâu hơn 8800m, một số ít các loài hải miên còn được tìm thấy sống ở vùng nước ngọt và nước lợ.450 loài hải miên được ghi nhận trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thế giới, World Porifera Database [2]. Hải miên được chia thành bốn lớp chính, trong đó lớp Demospongiae (được Sollas phân loại năm 1885) chiếm 83% tổng số loài, lớp Calcarea và Hexactinellida cùng chiếm 8%, còn lại 1% thuộc về lớp Homoscleromorpha [1].

Bên cạnh yếu tố gen, sự khác biệt về cấu trúc xương và kích thước gai là các đặc điểm hình thái quan trọng để phân loại hải miên. Ngoài ra, các đặc điểm về thành phần hóa học cũng là một dẫn chứng được sử dụng trong phân loại hải miên. Chẳng hạn, về đặc điểm hình thái các lớp hải miên có thể phân biệt như sau: - Lớp Demospongiae hầu hết có các nhánh silicat hoặc sợi xốp hoặc hỗn hợp cả hai trong các mô mềm của chúng. Tuy nhiên, một số loài có chứa cơ quan ngoài được tạo nên bởi aragnoit, một dạng canxi carbonat khác.

Tất cả các tế bào có một nhân và màng. - Lớp Hexactinellida (hải miên thủy tinh – glass sponges) có các nhánh silicat, nhánh lớn nhất có sáu cánh có thể tách rời hoặc đính với nhau. Thành phần 4 cơ thể chính của chúng là hợp bào (syncytia) trong đó phần lớn các tế bào có chung một màng ngoài đơn. - Lớp Calcarea (hải miên đá vôi) có bộ khung cơ thể tạo bởi canxi, một dạng canxi carbonat, có thể tạo thành các nhánh riêng biệt hoặc thành mạng lưới lớn.

Tất cả các tế bào có một nhân và màng. - Lớp Homoscleromorpha là đại diện không có gai nhưng có sợi collagen. Từ các đặc điểm về sinh thái học của hải miên cho thấy các chất chuyển hóa thứ cấp từ hải miên được hình thành với mục tiêu phòng vệ, bảo vệ khỏi sự tấn công của động vật ăn thịt, các ảnh hưởng của vi khuẩn, ăn mòn sinh học và sự phát triển vượt mức của các tổ chức có khả năng xâm lấn khác. Chính vì thế, hải miên là nguồn cung cấp các hoạt chất khổng lồ và được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu.

Các nghiên cứu về hóa học của hải miên được đánh dấu khởi đầu từ những năm 1950 bởi các công bố của Bergmann and Feeney về loài hải miên Tethya crypta [3]. Trong thập kỷ gần đây thì số lượng hợp chất mới phát hiện từ sinh vật biển đã lên tới trên 1000 hợp chất mỗi năm. Hơn nữa, theo thống kê trong số các hợp chất mới phát hiện từ sinh vật biển, có tới 30% số lượng hợp chất được tìm thấy từ hải miên, trung bình mỗi năm có khoảng 300 hợp chất mới được tìm thấy từ hải miên. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ hải miên cũng rất đa dạng có thể chia thành các nhóm chất chính alkaloid, lipid, terpenoid… Các hợp chất có nguồn gốc từ hải miên cũng thể hiện rất nhiều hoạt tính quan trọng như: hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng u, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, ức chế enzyme…Cho đến nay, một số loại thuốc có nguồn gốc từ hải miên đã được lưu hành sử dụng trên thị trường như: Cytarabine (có nguồn gốc từ hải miên Tethya crypta, trị ung thư bạch cầu), vidarabine (có nguồn gốc từ hải miên Tethya crypta, chỉ định để điều trị các bệnh herpes đơn giản và viêm não do virut) và Halaven (nguồn gốc từ hải miên Halichondria okaida, sử dụng trong điều trị ung thư vú).

Tổng quan về hải miên thuộc giống Rhabdastrella 1. Giới thiệu chung Hải miên giống Rhabdastrella thuộc họ Ancorinidae, bộ Astrophorida, lớp Demospongia. Cho đến nay có khoảng 19 loài thuộc giống Rhabdastrella được các 5 nhà khoa học công bố, trong đó phổ biến nhất là loài R. Giống hải miên Rhabdastrella có phân bố rộng rãi ở các vùng biển nhiệt đới Nam Thái Bình Dương như: vùng biển Đông-Việt Nam, New Caledonia và Philippines.

Tra cứu cơ sở dữ liệu Scifinder về giống hải miên này cho thấy: 52 công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, đối tượng nghiên cứu của giống này mới chỉ tập trung vào ba loài Rhabdastrella globostellata, Rhabdastrella aff. distincta và Rhabdastrella providentiae. Thành phần hóa học chính của các loài hải miên giống Rhabdastrella là các hợp chất isomalabaricane. Từ năm 1997 đến nay, các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của hơn 90 hợp chất isomalabaricane từ giống Rhabdastrella.

Hợp chất isomalabaricane được xếp vào nhóm triterpene với bộ khung 30 carbon. Tuy nhiên các hợp chất isomalabaricane phân lập từ hải miên giống Rhabdastrella, ngoài những hợp chất thuộc loại isomalabaricane triterpenoid khung đầy đủ 30C còn có những chất có bộ khung giảm dần số carbon ở mạnh nhánh như bớt đi một carbon còn 29C (gọi chung là isomalabaricane nortriterpenoid), hay là các hợp chất có số carbon ít hơn nữa ở mạch nhánh do quá trình sinh tổng hợp xảy ra sự đứt gãy của mạnh nhánh. Có những hợp chất mạch nhánh bị đứt gãy hoàn toàn chỉ giữ lại bộ khung 3 vòng của isomalabaricane. Các hợp chất này đã được chứng minh có hoạt tính gây độc tế bào và nhiều hoạt tính khác [5].

Hình ảnh loài hải miên R. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Thành phần hóa học của các loài thuộc giống Rhabdastrella chủ yếu là các hợp chất thuộc khung isomalabaricane. Các hợp chất isomalabaricane này mới chỉ được tìm thấy từ các giống hải miên thuộc bốn giống trong bộ Astrophorida là Rhabdastrella, Geodia [7], Stelletta [8] và Jaspis [9]. providentiae, các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của 95 hợp chất isomalabaricane.

Chúng được xếp vào nhóm hợp chất triterpenoid, cấu trúc hóa học bao gồm phần khung tricyclic (với 2 vòng 6 cạnh, 1 vòng 5 cạnh và một mạch nhánh. Hệ ba vòng liên kết ngưng tụ với nhau theo kiểu trans-syn- trans. Cấu trúc hóa học và cách đánh số thứ tự carbon của isomalabaricane Với cấu trúc ba vòng ngưng tụ trans-syn-trans (Hình 1.2), isomalabaricane được đánh giá là nhóm chất rất hiếm gặp, chỉ mới được phân lập từ sinh vật biển, và có thể được coi là các dấu hiệu hóa học để định loại các loài hải miên. Các hợp chất isomalabaricane phân lập từ giống hải miên Rhabdastrella có cấu trúc hóa học giống nhau ở 3 vòng ngưng tụ 6,6,5-tricyclic và khác nhau chủ yếu ở chuỗi mạch nhánh polyene liên hợp.