Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase xanthine oxidase của loài vernonia amygdalina và vernonia

Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase, xanthine oxidase của vernonia amygdalina và vernonia.

• Tác giả: Phạm Văn Công
• Người hướng dẫn: PGS. Hoàng Lê Tuấn Anh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hóa Học Và Hoạt Tính Ức Chế Enzyme Của Vernonia Amygdalina
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ KỸ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Giới thiệu chung về họ Cúc (Asteraceae)
• 1.2. Tổng quan về chi Vernonia
• 1.2.1. Vài nét về chi Vernonia
• 1.2.2. Giới thiệu về thực vật loài V
• 1.2.3. Giới thiệu về loài Vernonia gratiosa
• 1.3. Tác dụng của chi Vernonia trong y học cổ truyền
• 1.4. Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Vernonia
• 1.4.1. Các hợp chất sesquiterpene
• 1.4.2. Các hợp chất sesquiterpene lactone khác
• 1.4.3. Các hợp chất stigmastane steroid
• 1.4.4. Các hợp chất triterpenoid
• 1.4.5. Các hợp chất flavonoid và phenolic
• 1.5. Tình hình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Vernonia
• 1.5.1. Tác dụng kháng viêm
• 1.5.2. Tác dụng chống tiểu đường
• 1.5.3. Tác dụng gây độc tế bào ung thư
• 1.5.4. Tác dụng chống sốt rét
• 1.5.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật
• 1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước về loài V
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của loài V
• 1.7. Đối tượng nghiên cứu
• 1.7.1. Loài Vernonia amygdalina
• 1.7.2. Loài Vernonia gratiosa
• 1.8. Dung môi, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 1.8.1. Dung môi và hóa chất
• 1.9. Phương pháp nghiên cứu
• 1.9.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất
• 1.9.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 1.9.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất sạch
• 1.9.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 1.9.4.1. Đánh giá hoạt tính sinh học ức chế enzyme α-glucosidase
• 1.9.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase
• 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. Phân lập các hợp chất
• 2.1.1. Phân lập các hợp chất từ loài V
• 2.1.2. Phân lập các hợp chất từ loài V
• 2.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được
• 2.2.1. Thông số vật lý của các hợp chất phân lập từ loài V
• 2.2.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài Vernonia gratiosa
• 2.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài V
• 2.3.1. Cấu trúc của các hợp chất mới đã phân lập từ loài V
• 2.3.1.1. Hợp chất LD1: Vernonioside K
• 2.3.1.2. Hợp chất LD2: Vernonioside L
• 2.3.1.3. Hợp chất LD3 Vernonioside M
• 2.3.1.4. Hợp chất LD4: Vernonioside O
• 2.3.1.5. Hợp chất LD5; Vernonioside N
• 2.3.1.6. Hợp chất LD6; Vernonioside P
• 2.3.1.7. Hợp chất LD7; Vernonioside Q
• 2.3.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã biết từ loài V
• 2.3.2.1. Hợp chất LD8; (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy- 7,8,9,11 tetradehydro-3β- 16α,21,24 tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α- stigmastane
• 2.3.2.2. Hợp chất LD9; Vernoamyoside E
• 2.3.2.3. Hợp chất LD10; Vernonioside B2
• 2.3.2.4. Hợp chất LD11; Vernoniacum B
• 2.3.2.5. Hợp chất LD12; (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11-tetradehydro- 24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone
• 2.3.2.6. Hợp chất LD13; Vernonioside B1
• 2.3.2.7. Hợp chất LD14; Veramyoside H
• 2.3.2.8. Hợp chất LD15; Veramyoside J
• 2.3.2.9. Hợp chất LD16; Vernoamyoside A
• 2.3.2.10. Hợp chất LD17; α-spinasterol
• 2.3.3. Đặc trưng phổ 13C-NMR của các hợp chất stigmastane steroid phân lập được từ loài V
• 2.4. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài V
• 2.4.1. Cấu trúc của các hợp chất mới đã phân lập từ loài V
• 2.4.1.1. Hợp chất VG1; Vernoniagratioside C
• 2.4.1.2. Hợp chất VG2; Vernogratioside D
• 2.4.1.3. Hợp chất VG3; Vernogratioside E
• 2.4.1.4. Hợp chất VG4; Vernogratioside K
• 2.4.1.5. Hợp chất VG5; vernogratioside S
• 2.4.1.6. Hợp chất VG6; Vernogratioside A
• 2.4.1.7. Hợp chất VG7; Vernogratioside F
• 2.4.2. Cấu trúc của các hợp chất đã biết được phân lập từ loài V
• 2.4.2.1. Hợp chất VG8; VE1
• 2.4.2.2. Hợp chất VG9; Vernoniacum B
• 2.4.2.3. Hợp chất VG 10; Kaempferol
• 2.4.2.4. Hợp chất VG11; Quecertin 3-O-methyl ether
• 2.4.2.5. Hợp chất VG12; Quercetin
• 2.4.2.6. Hợp chất VG13; Hợp chất Apigenin
• 2.4.2.7. Hợp chất VG15; Threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-sinapylete-7-O-β-ᴅ- glucopyranoside
• 2.4.2.8. Hợp chất VG16: 11β,13-dihydrovernolide
• 2.4.2.9. Hợp chất VG17: 5-(methoxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde
• 2.4.3. Đặc trưng phổ 13C-NMR của một số hợp chất stigmastane steroid phân lập từ loài V
• 2.5. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài V
• 2.5.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất LD1 – LD17
• 2.5.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất (VG1 – VG17)
• 2.5.3. Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase của các hợp chất (LD1 – LD17)
• 2.5.4. Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase của các hợp chất sạch phân lập được từ loài V
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu

Nghiên cứu hóa học và hoạt tính ức chế enzyme của vernonia amygdalina là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Vernonia amygdalina, thuộc họ Cúc (Asteraceae), đã được biết đến với nhiều tác dụng sinh học, đặc biệt là khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase. Các nghiên cứu trước đây cho thấy dịch chiết từ loài này có khả năng làm giảm hàm lượng đường trong máu, điều này rất có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh tiểu đường. Hơn nữa, việc nghiên cứu thành phần hóa học của vernonia amygdalina giúp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học, từ đó mở ra hướng đi mới cho việc phát triển thuốc từ thiên nhiên.

1.1. Giới thiệu về loài Vernonia

Chi Vernonia là một trong những chi lớn thuộc họ Cúc, với khoảng 1000 loài. Các loài trong chi này thường được sử dụng trong y học cổ truyền và có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Vernonia amygdalina và Vernonia gratiosa là hai loài tiêu biểu, được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Nghiên cứu cho thấy các hợp chất như flavonoid, terpenoid và polyphenol có trong các loài này có khả năng kháng viêm, chống tiểu đường và kháng vi sinh vật. Điều này khẳng định giá trị của vernonia amygdalina trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm tự nhiên.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ vernonia amygdalina. Các phương pháp sắc ký, như sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), được áp dụng để tách biệt các hợp chất. Sau đó, các hợp chất này được xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ như NMR và MS. Đặc biệt, hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase được đánh giá qua các mô hình in vitro, giúp xác định hiệu quả của các hợp chất trong việc kiểm soát đường huyết và điều trị bệnh gút.

2.1. Phân lập các hợp chất

Quá trình phân lập các hợp chất từ vernonia amygdalina bao gồm việc chiết xuất bằng dung môi và sau đó sử dụng các phương pháp sắc ký để tách biệt các hợp chất. Các hợp chất được phân lập sẽ được kiểm tra hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng ức chế enzyme. Việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất này là rất quan trọng để hiểu rõ cơ chế tác động của chúng. Các hợp chất đã được phân lập sẽ được đánh giá về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase, từ đó xác định tiềm năng ứng dụng trong y học.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất phân lập từ vernonia amygdalina có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase đáng kể. Các hợp chất như vernonioside K, L, M, và O đã thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường và bệnh gút. Việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác động mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển thuốc từ thiên nhiên. Nghiên cứu này khẳng định giá trị của vernonia amygdalina trong y học hiện đại và cần được tiếp tục khai thác.

3.1. Đánh giá hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của các hợp chất từ vernonia amygdalina được đánh giá thông qua các thử nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy rằng các hợp chất này không chỉ có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase mà còn có tác dụng ức chế enzyme xanthine oxidase. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị bệnh tiểu đường và bệnh gút. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định cơ chế tác động của các hợp chất này để có thể ứng dụng hiệu quả trong y học.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đái tháo đường type 2 và bệnh gút là hai bệnh lý rối loạn chuyển hóa phổ biến trên thế giới và tại Việt Nam. Kiểm soát đường huyết sau ăn thông qua việc ức chế enzyme α-glucosidase là liệu pháp hỗ trợ điều trị đái tháo đường type 2. Bên cạnh đó, enzyme xanthine oxidase (XO) xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và chuyển hóa xanthine thành acid uric; sự tích tụ quá mức tinh thể mononatri urate tại các khớp là nguyên nhân dẫn đến bệnh gút. Các thuốc ức chế tổng hợp như allopurinol có thể gây ra các phản ứng bất lợi như hội chứng Stevens-Johnson, hoại tử biểu bì nhiễm độc, suy giảm chức năng gan và thận. Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase là một hướng nghiên cứu cần thiết.

Chi Vernonia thuộc họ Cúc (Asteraceae) bao gồm khoảng 1000 loài phân bố tại nhiều vùng sinh thái. Tại Việt Nam, loài Vernonia amygdalina Del. (cây lá đắng) được di thực và trồng tại nhiều địa phương, thường được dùng trong dân gian để hỗ trợ điều trị đái tháo đường. Trong khi đó, loài Vernonia gratiosa Del. (cây bạch đầu thuôn) mọc tự nhiên nhưng chưa từng có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học được công bố. Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Văn Công thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 20–30 hợp chất từ loài Vernonia amygdalina và Vernonia gratiosa thu thập tại Việt Nam.
2. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase của các hợp chất phân lập được trên mô hình in vitro.

Nội dung nghiên cứu

1. Phân lập các hợp chất từ hai loài Vernonia amygdalina và Vernonia gratiosa thu thập tại Việt Nam sử dụng các phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập được từ hai loài bằng các phương pháp vật lý và hóa học hiện đại.
3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase bằng mô hình in vitro của các hợp chất phân lập được.
4. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase bằng mô hình in vitro của các hợp chất sạch thu được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thực vật loài Vernonia amygdalina Del. thu hái tại Hà Nội và loài Vernonia gratiosa Del. thu hái tại tỉnh Quảng Trị, được giám định tên khoa học bởi TS. Lê Tuấn Anh (Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, VAST).
• Phạm vi nghiên cứu: Chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên (mã số: 9.17); tập trung vào việc chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất thứ cấp và khảo sát hoạt tính ức chế in vitro đối với hai enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Họ Cúc (Asteraceae) là một trong những họ thực vật lớn nhất của ngành thực vật hạt kín, với khoảng 1.620 chi và hơn 23.600 loài trên toàn cầu. Tại Việt Nam, theo Lê Kim Biên (2007), họ Cúc có khoảng 126 chi với 374 loài. Chi Vernonia là một chi lớn trong họ Cúc với khoảng 1.000 loài. Theo danh mục Cây thuốc Việt Nam, có 16 loài thuộc chi Vernonia được ghi nhận sử dụng làm thuốc, bao gồm V. squarrosa, V. saligna, V. volkameriaefolia, V. parishii, V. aspera, V. paluta, V. cinerea, V. esculenta, V. anthelmintica, V. spirei, V. aborea, V. macrachaenia, V. cumingiana, V. elliptica, V. amygdalina và V. gratiosa.

Từ năm 1982 đến nay, hơn 350 hợp chất đã được phân lập từ chi Vernonia, tập trung vào các nhóm sesquiterpene lactone, stigmastane steroid, triterpenoid, flavonoid và hợp chất phenolic:

• Sesquiterpene lactone: Bohlmann (1982) phân lập vernostipulal A và B từ V. stipulacea. Kimani (2017) phân lập vernodalin và 11β,13-dihydrovernodalin từ V. amygdalina. Aliyu công bố các blumeoidolide A–D từ V. blumeoides. Watson, Beth Wu, Williams (2005) và Campos xác định các glaucolide A, B, D, E, K–M từ V. glauca, V. pachyclada, V. liatroides. Zang (2018), Xin Chen (2020), Bardon và Catalan phân lập các dẫn xuất hirsutinolide (vercinolide A–H, vernchinilide A–E, piptocarphol, piptocarphin A–F). Nhóm tác giả Nhật Bản và Turak (2015) công bố các dimer sesquiterpene elemanolide như vernodalidimer A–E từ V. anthelmintica. Liu (2022) phân lập các amygdanoid A–G từ V. amygdalina.
• Stigmastane steroid: Jisaka (1992) phân lập vernonioside A1–A4 và B1–B3 từ V. amygdalina. Liu (2019, 2022) phân lập các veramyoside A–J và vernonin M–T. Nhóm tác giả Trung Quốc công bố các vernoramyoside A–F và vernoanthelcin A–I. Tchinda, Donfack phân lập các stigmastane steroid từ V. guineensis và V. colorata. Liu công bố các vernocuminoside A–G và vernoniacum A–B từ V. cumingiana.
• Flavonoid và Phenolic: Narain (1977), Alabi và Adeyemi (2021), Ugbogu (2021) phân lập genkwanin, fasciculatin, luteolin, luteolin 7-O-glucoside, apigenin, quercetin, kaempferol glycoside, cùng nhiều dẫn xuất dicaffeoylquinic acid và chlorogenic acid.
• Tác dụng sinh học đã công bố: Nghiên cứu của Asante (2019), Abeysekera (1994) và Zeng (2019) chứng minh hoạt tính kháng viêm của dịch chiết và các hợp chất steroid, flavonoid. Tekou (2018), Erukainure (2019), Wu (2018) và Fatima chứng minh tác dụng hạ đường huyết và ức chế α-glucosidase của V. amygdalina và V. anthelmintica. Koul (2003), Williams (2005), Jisaka ghi nhận hoạt tính gây độc tế bào ung thư (HT-29, Hela, A2780, MDA-MB-231). Abosi & Raseroka (2003), Bihonegn (2019), Challand & Willcox (2009) khảo sát tác dụng chống sốt rét trên Plasmodium berghei. Nadine (2023) và Donfack khảo sát hoạt tính kháng khuẩn.
• Tình hình nghiên cứu trong nước: Lê Thị Mi Chi (2016) và Hồ Thị Dung (2018) nghiên cứu đặc điểm thực vật học của V. amygdalina. Nguyễn Thị Hồng Hạnh khảo sát tác dụng hạ đường huyết của cao chiết. Hoàng Lê Tuấn Anh và cộng sự (2018, 2019, 2021, 2022) phân lập một số stigmastane steroid (vernoamyoside E, vernoniacum B, vernonioside B1, B2) và flavonoid (luteolin, kaempferol) từ lá V. amygdalina.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Thành phần stigmastane steroid và tiềm năng ức chế đồng thời enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase của loài V. amygdalina trồng tại Việt Nam chưa được nghiên cứu toàn diện. Đặc biệt, loài Vernonia gratiosa hoàn toàn chưa có bất kỳ công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học trên phạm vi quốc tế và trong nước.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Khung stigmastane steroid là nhóm hợp chất steroid 29 carbon có cấu trúc 4 vòng ngưng tụ 6/6/6/5, mang hệ liên kết đôi liên hợp đặc trưng tại vị trí Δ7,9(11) hoặc Δ8,14, kết hợp với các cầu nối epoxy (vòng oxirane, tetrahydrofuran) và vòng lactone (γ-lactone hoặc carbolactone) ở mạch nhánh. Cấu trúc hóa học và cấu hình lập thể được phân tích thông qua tương tác dịch chuyển hóa học, hằng số ghép cặp $J$, tương tác qua liên kết và tương tác không gian.
• Cơ sở sinh học: Enzyme α-glucosidase xúc tác thủy phân liên kết α-glucosidic giải phóng D-glucose ở ruột non. Enzyme xanthine oxidase xúc tác hai bước oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric. Sự ức chế hai enzyme này được định lượng qua nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzyme (giá trị $\text{IC}_{50}$).

Phương pháp nghiên cứu

• Xử lý mẫu và chiết xuất: Mẫu thực vật khô được xay nhỏ, chiết ngấm kiệt bằng dung môi hữu cơ thích hợp, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để tạo cao chiết tổng, sau đó phân bố lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần để thu các phân đoạn cao.
• Phương pháp phân lập: Kết hợp nhiều kỹ thuật sắc ký:
  • Sắc ký cột pha thường (Silica gel 60, 40–63 $\mu\text{m}$).
  • Sắc ký cột pha đảo (Octadecylsilane - C18, YMC Gel ODS-A).
  • Sắc ký rây phân tử và hấp phụ (MCI gel CHP20P, Sephadex LH-20).
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC) pha thường và pha đảo để kiểm tra độ tinh khiết.
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR: $^{1}\text{H-NMR}$ ($500,\text{MHz}$), $^{13}\text{C-NMR}$ ($125,\text{MHz}$), phổ DEPT, $^{1}\text{H-}^{1}\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY và ROESY, sử dụng dung môi đo như $\text{CDCl}_3$, $\text{CD}_3\text{OD}$ hoặc $\text{DMSO-}d_6$, chất chuẩn nội Tetramethylsilane (TMS).
  • Phổ khối lượng phân giải cao: High Resolution Electrospray Ionization Mass Spectrometry (HR-ESI-MS) xác định khối lượng phân tử chính xác và công thức phân tử.
  • Phổ quang phổ lưỡng sắc tròn: Circular Dichroism (CD / ECD) xác định cấu hình tuyệt đối của các trung tâm bất đối.
  • Quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
  • Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase: Thử nghiệm sử dụng enzyme α-glucosidase từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae), cơ chất $p$-nitrophenyl glucopyranoside ($\text{pNG}$). Phản ứng thủy phân giải phóng $p$-nitrophenol màu vàng, đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng $405,\text{nm}$.
  • Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase: Đo sự hình thành acid uric từ cơ chất xanthine dưới tác dụng của enzyme XO thông qua đo độ hấp thụ quang học OD ở bước sóng $295,\text{nm}$.
  • Tính toán tỷ lệ phần trăm ức chế (%) và xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ bằng phần mềm chuyên dụng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan nghiên cứu

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về đặc điểm thực vật học của họ Cúc (Asteraceae) và chi Vernonia. Trình bày chi tiết hình thái thực vật của loài Vernonia amygdalina Del. (thân gỗ nhỏ cao 1–3 m, lá so le hình trứng/bầu dục có răng cưa nhỏ, hoa chùm màu trắng ngà) và loài Vernonia gratiosa Del. (cây bụi thưa cao 1,5–2,5 m, lá thuôn dài mũi mác có lông tơ màu nâu xám, hoa hình chùy màu tím).

Chương này tổng kết 350 hợp chất thuộc 5 nhóm cấu trúc chính (sesquiterpene lactone, stigmastane steroid, triterpenoid, flavonoid, phenolic) và các hoạt tính sinh học tiêu biểu của chi Vernonia (kháng viêm, chống đái tháo đường, gây độc tế bào, chống sốt rét, kháng vi sinh vật). Đồng thời, chương 1 phân tích tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, chỉ rõ V. amygdalina mới chỉ được khảo sát sơ bộ tại Việt Nam và V. gratiosa chưa từng được nghiên cứu hóa học.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu thực vật thu hái tại Hà Nội (V. amygdalina) và Quảng Trị (V. gratiosa). Trình bày thông số kỹ thuật của các thiết bị đo phổ NMR, HR-ESI-MS, CD, UV-Vis, hệ thống dung môi (n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol, nước), hóa chất sắc ký và hóa chất sinh học (enzyme α-glucosidase, enzyme xanthine oxidase, cơ chất pNG, xanthine, chất đối chứng dương acarbose và allopurinol).

Chương 2 đưa ra quy trình chiết xuất phân đoạn, sơ đồ phân lập từng nhóm chất trên các hệ cột sắc ký khác nhau, quy trình đo độ hấp thụ quang học OD và công thức tính toán phần trăm ức chế enzyme, cùng danh mục các bảng dữ kiện phổ và thông số vật lý của toàn bộ các hợp chất phân lập được.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày việc phân lập, xác định cấu trúc hóa học của 34 hợp chất sạch và kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro:

1. Thành phần hóa học từ loài Vernonia amygdalina (17 hợp chất, ký hiệu LD1 – LD17)

• 7 hợp chất mới khung stigmastane steroid:
  • LD1 (Vernonioside K): Cấu trúc xác định qua tương tác HMBC, COSY, ROESY và phổ HR-ESI-MS.
  • LD2 (Vernonioside L): Hợp chất steroid glycoside mới.
  • LD3 (Vernonioside M): Dẫn xuất stigmastane mới, so sánh dữ liệu phổ $^{1}\text{H}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ với LD2.
  • LD4 (Vernonioside O): Hợp chất steroid mới, cấu trúc làm sáng tỏ qua ROESY, HMBC.
  • LD5 (Vernonioside N): Khung stigmastane steroid mới, phân tích phổ HR-ESI-MS, COSY, HMBC.
  • LD6 (Vernonioside P): Hợp chất steroid glycoside mới, xác định đầy đủ phổ 1D và 2D NMR.
  • LD7 (Vernonioside Q): So sánh dữ liệu phổ $^{1}\text{H}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ với LD6.
• 10 hợp chất đã biết:
  • LD8: $(22R,23S,24R,28S)\text{-}28\text{-methoxy-}7,8,9,11\text{-tetradehydro-}3\beta,16\alpha,21,24\text{-tetrahydroxy-}21,23:22,28\text{-diepoxy-}5\alpha\text{-stigmastane}$.
  • LD9: Vernoamyoside E.
  • LD10: Vernonioside B2.
  • LD11: Vernoniacum B.
  • LD12: $(23S,24R,28S)\text{-}3\beta,22\alpha\text{-dihydroxy-}7,8,9,11\text{-tetradehydro-}24,28\text{-epoxy-}5\alpha\text{-stigmastane-}21,23\text{-carbolactone}$.
  • LD13: Vernonioside B1.
  • LD14: Veramyoside H.
  • LD15: Veramyoside J.
  • LD16: Vernoamyoside A.
  • LD17: $\alpha\text{-spinasterol}$.

2. Thành phần hóa học từ loài Vernonia gratiosa (17 hợp chất, ký hiệu VG1 – VG17)

• 7 hợp chất mới:
  • VG1 (Vernoniagratioside C): Xác định cấu trúc qua phổ HMBC, COSY, NOESY, phổ CD thực nghiệm và HR-ESI-MS.
  • VG2 (Vernogratioside D): Khẳng định cấu trúc và cấu hình tuyệt đối qua phổ CD so sánh với verocuminoside H.
  • VG3 (Vernogratioside E): Phân tích phổ ECD, HR-ESI-MS, 2D NMR.
  • VG4 (Vernogratioside K): Xác định qua phổ CD và so sánh chuỗi phổ ECD VG1–VG4.
  • VG5 (Vernogratioside S): Khung stigmastane steroid mới.
  • VG6 (Vernogratioside A): Phân tích tương tác COSY, HMBC, NOESY so sánh với VE1.
  • VG7 (Vernogratioside F): Khung stigmastane steroid mới, phổ NOESY, COSY, HMBC.
• 10 hợp chất đã biết:
  • VG8: VE1.
  • VG9: Vernoniacum B.
  • VG10: Kaempferol.
  • VG11: Quercetin 3-O-methyl ether.
  • VG12: Quercetin.
  • VG13: Apigenin.
  • VG14: Hợp chất phenol/steroid đối chiếu.
  • VG15: Threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-sinapylether-7-O-$\beta$-D-glucopyranoside.
  • VG16: $11\beta,13\text{-dihydrovernolide}$ (sesquiterpene lactone).
  • VG17: $5\text{-(methoxymethyl)-}1H\text{-pyrrole-}2\text{-carbaldehyde}$.

Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập được từ hai loài nghiên cứu

Ký hiệu	Tên hợp chất	Loại cấu trúc	Tình trạng công bố	Nguồn loài
LD1	Vernonioside K	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD2	Vernonioside L	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD3	Vernonioside M	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD4	Vernonioside O	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD5	Vernonioside N	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD6	Vernonioside P	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD7	Vernonioside Q	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. amygdalina
LD8	Dẫn xuất stigmastane diepoxy	Stigmastane steroid aglycone	Đã biết	V. amygdalina
LD9	Vernoamyoside E	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD10	Vernonioside B2	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD11	Vernoniacum B	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD12	Dẫn xuất stigmastane carbolactone	Stigmastane steroid aglycone	Đã biết	V. amygdalina
LD13	Vernonioside B1	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD14	Veramyoside H	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD15	Veramyoside J	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD16	Vernoamyoside A	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. amygdalina
LD17	$\alpha$-Spinasterol	Phytosterol	Đã biết	V. amygdalina
VG1	Vernoniagratioside C	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG2	Vernogratioside D	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG3	Vernogratioside E	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG4	Vernogratioside K	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG5	Vernogratioside S	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG6	Vernogratioside A	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG7	Vernogratioside F	Stigmastane steroid glycoside	Mới	V. gratiosa
VG8	VE1	Stigmastane steroid	Đã biết	V. gratiosa
VG9	Vernoniacum B	Stigmastane steroid glycoside	Đã biết	V. gratiosa
VG10	Kaempferol	Flavonoid	Đã biết	V. gratiosa
VG11	Quercetin 3-O-methyl ether	Flavonoid	Đã biết	V. gratiosa
VG12	Quercetin	Flavonoid	Đã biết	V. gratiosa
VG13	Apigenin	Flavonoid	Đã biết	V. gratiosa
VG14	Hợp chất đối chiếu VG14	Hợp chất thiên nhiên	Đã biết	V. gratiosa
VG15	Threo-guaiacylglycerol glycoside	Neolignan/Phenolic glycoside	Đã biết	V. gratiosa
VG16	$11\beta,13$-Dihydrovernolide	Sesquiterpene lactone	Đã biết	V. gratiosa
VG17	$5$-(methoxymethyl)-$1H$-pyrrole-$2$-carbaldehyde	Hợp chất dị vòng chứa nitơ	Đã biết	V. gratiosa

3. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

• Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase:
  • Đánh giá trên dãy hợp chất LD1–LD17 từ V. amygdalina và VG1–VG17 từ V. gratiosa. Các hợp chất stigmastane steroid và flavonoid (kaempferol VG10, quercetin VG12, apigenin VG13) thể hiện mức độ ức chế enzyme α-glucosidase ở các dải nồng độ thử nghiệm khác nhau, làm giảm tốc độ thủy phân cơ chất pNG so với mẫu đối chứng.
• Hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase:
  • Đánh giá tác dụng ức chế enzyme XO của các hợp chất LD1–LD17 và VG1–VG17. Kết quả ghi nhận một số hợp chất steroid và flavonoid có khả năng làm giảm quá trình oxy hóa xanthine thành acid uric so với đối chứng allopurinol.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Phát hiện các hợp chất mới: Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 14 hợp chất stigmastane steroid mới chưa từng được công bố trong các tài liệu khoa học:
   • 7 hợp chất mới từ loài Vernonia amygdalina: Vernonioside K (LD1), Vernonioside L (LD2), Vernonioside M (LD3), Vernonioside O (LD4), Vernonioside N (LD5), Vernonioside P (LD6), Vernonioside Q (LD7).
   • 7 hợp chất mới từ loài Vernonia gratiosa: Vernoniagratioside C (VG1), Vernogratioside D (VG2), Vernogratioside E (VG3), Vernogratioside K (VG4), Vernogratioside S (VG5), Vernogratioside A (VG6), Vernogratioside F (VG7).
2. Khảo sát toàn diện loài Vernonia gratiosa: Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Vernonia gratiosa Del. trên thế giới và tại Việt Nam, phân lập được 17 hợp chất thuộc các nhóm stigmastane steroid, flavonoid, sesquiterpene lactone, lignan và dẫn xuất pyrrole.
3. Cung cấp hệ thống dữ liệu phổ chi tiết: Luận án bổ sung dữ liệu phổ $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, HR-ESI-MS và phổ phân tán sắc tròn điện tử (ECD/CD) của các stigmastane steroid có cấu trúc mạch nhánh phức tạp (mang vòng epoxy, tetrahydrofuran và lactone) vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật học.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Minh chứng khoa học cho kinh nghiệm dân gian: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase của các hợp chất sạch từ V. amygdalina và V. gratiosa, hỗ trợ cơ sở khoa học cho việc sử dụng các loài này trong các bài thuốc dân gian điều trị đái tháo đường và bệnh gút.
2. Định hướng ứng dụng dược liệu: Cung cấp cơ sở khoa học cho công tác quy hoạch, khai thác, tiêu chuẩn hóa và phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị rối loạn chuyển hóa từ nguồn thực vật thuộc chi Vernonia tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới chỉ dừng lại ở quy mô in vitro trên hai enzyme tinh khiết (α-glucosidase và xanthine oxidase); chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình tế bào và mô hình động vật (in vivo) đối với toàn bộ các hợp chất mới phân lập do hạn chế về khối lượng mẫu tinh khiết thu được.
• Luận án chưa khảo sát sâu cơ chế động học ức chế enzyme (như xác định hằng số ức chế $K_i$, kiểu ức chế cạnh tranh, phi cạnh tranh hay hỗn hợp) cũng như mô phỏng gắn kết phân tử (molecular docking) cho từng hợp chất mới.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô chiết xuất để thu nhận lượng lớn hơn các hợp chất mới tiềm năng (nhóm vernonioside và vernogratioside) nhằm phục vụ các thử nghiệm dược lý chuyên sâu.
• Đánh giá hoạt tính hạ đường huyết và hạ acid uric máu trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo), khảo sát độc tính cấp và bán trường diễn của các phân đoạn giàu hoạt chất.
• Khảo sát các bộ phận khác của cây (thân, rễ, hoa) và xây dựng quy trình định lượng hoạt chất phục vụ tiêu chuẩn hóa dược liệu Vernonia amygdalina và Vernonia gratiosa.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học: Tham khảo quy trình phân lập các hợp chất steroid phân cực cao, phương pháp kết hợp phổ 2D-NMR và phổ CD/ECD để giải mã cấu trúc lập thể của các khung stigmastane steroid chứa nhiều tâm bất đối và vòng dị nguyên tố.
• Các nhà nghiên cứu thực vật học và hóa thực vật: Tham khảo dữ liệu chuyên sâu và toàn diện đầu tiên về thành phần hóa học của loài Vernonia gratiosa Del. thu hái tại Việt Nam.
• Các nhà khoa học dược lý và các đơn vị nghiên cứu phát triển sản phẩm: Sử dụng dữ liệu về hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase làm căn cứ khoa học để định hướng nghiên cứu phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường và bệnh gút từ thảo dược.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Đối tượng nghiên cứu của luận án là những loài thực vật nào và được thu thập tại địa phương nào?

Luận án nghiên cứu hai loài thực vật thuộc chi Vernonia, họ Cúc (Asteraceae):

• Loài Vernonia amygdalina Del. (cây lá đắng) được thu hái tại Hà Nội.
• Loài Vernonia gratiosa Del. (cây bạch đầu thuôn) được thu hái tại tỉnh Quảng Trị. Mẫu thực vật được giám định khoa học bởi TS. Lê Tuấn Anh thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung (VAST).

2. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất và có bao nhiêu hợp chất mới?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của tổng cộng 34 hợp chất sạch (17 hợp chất từ loài V. amygdalina ký hiệu LD1–LD17 và 17 hợp chất từ loài V. gratiosa ký hiệu VG1–VG17). Trong đó, có 14 hợp chất có cấu trúc mới lần đầu tiên được công bố:

• 7 hợp chất mới từ V. amygdalina: Vernonioside K (LD1), Vernonioside L (LD2), Vernonioside M (LD3), Vernonioside O (LD4), Vernonioside N (LD5), Vernonioside P (LD6), Vernonioside Q (LD7).
• 7 hợp chất mới từ V. gratiosa: Vernoniagratioside C (VG1), Vernogratioside D (VG2), Vernogratioside E (VG3), Vernogratioside K (VG4), Vernogratioside S (VG5), Vernogratioside A (VG6), Vernogratioside F (VG7).

3. Những phương pháp hóa lý nào được sử dụng để xác định cấu trúc và cấu hình tuyệt đối của các hợp chất?

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được làm sáng tỏ bằng sự kết hợp của:

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR: $^{1}\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, $^{1}\text{H-}^{1}\text{H}$ COSY, HSQC, HMBC, NOESY và ROESY.
• Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS để xác định công thức phân tử.
• Phổ quang phổ lưỡng sắc tròn điện tử (CD / ECD) để xác định cấu hình tuyệt đối của các trung tâm lập thể trên khung steroid.

4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được đánh giá trên những mô hình nào?

Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính sinh học in vitro trên hai mô hình enzyme đích:

• Mô hình ức chế enzyme α-glucosidase (sử dụng cơ chất $p$-nitrophenyl glucopyranoside - pNG, đo OD ở bước sóng $405,\text{nm}$).
• Mô hình ức chế enzyme xanthine oxidase (sử dụng cơ chất xanthine, đo sự biến đổi OD ở bước sóng $295,\text{nm}$).

5. Điểm mới nổi bật nhất của luận án đối với loài Vernonia gratiosa là gì?

Luận án là công trình đầu tiên trên thế giới và tại Việt Nam nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Vernonia gratiosa Del., công bố cấu trúc của 17 hợp chất sạch (trong đó có 7 hợp chất stigmastane steroid hoàn toàn mới) và bước đầu xác định khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase của các hợp chất này.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phạm Văn Công đã hoàn thành việc khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài thực vật Vernonia amygdalina và Vernonia gratiosa thu thập tại Việt Nam. Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 34 hợp chất sạch, trong đó phát hiện 14 hợp chất stigmastane steroid có cấu trúc mới. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học in vitro đã chứng minh khả năng ức chế enzyme α-glucosidase và xanthine oxidase của các hợp chất phân lập được. Công trình là nghiên cứu đầu tiên làm sáng tỏ thành phần hóa thực vật của loài Vernonia gratiosa, cung cấp dữ liệu khoa học tin cậy cho việc định hướng khai thác nguồn dược liệu thiên nhiên tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong lịch sử phát triển từ ngàn xưa con người đã biết đến việc sử dụng cây cỏ trong việc phòng và điều trị bệnh. Cùng với sự phát triển của Y học hiện đại, ngày nay, các nhà khoa học đã xác định được chính xác nguồn gốc của các hoạt chất trong các bài thuốc dân gian thông qua quá trình chiết xuất, phân tách và xác định cấu trúc cũng như chứng minh các hoạt tính sinh học của chúng. Bên cạnh đó, Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa với địa hình đa dạng, rất phù hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các loài thực vật. Điều đó được thể hiện qua sự phong phú về hệ thực vật với nhiều loại dược liệu quý, nhiều loài đặc hữu chỉ có ở Việt Nam.

Tuy nhiên hiện nay phần lớn các loài dược liệu quý của Việt Nam chưa được nghiên cứu toàn diện, bài bản và có hệ thống, mà chủ yếu xuất phát từ những kinh nghiệm cũng như những bài thuốc dân gian. Bên cạnh đó, xu hướng sử dụng dược liệu và các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt từ tự nhiên cho việc chăm sóc sức khỏe và chữa trị các bệnh hiểm nghèo ngày càng phổ biến ở cả Việt Nam và thế giới. Do đó, việc nghiên cứu nhằm phát hiện các hoạt chất từ thảo dược để chăm sóc sức khỏe cho xã hội là nhu cầu cần thiết và cấp bách đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm. Chi Vernonia là một chi lớn thuộc họ Cúc (Asteraceae) với xấp xỉ 1000 loài, chúng có mặt chủ yếu ở các nước thuộc Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Châu Phi và Đông Nam Á.

Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Vernonia có chứa nhiều khung chất thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học tốt như steroid, flavonoid, terpenoid, polyphenol,. amygdalina là một trong số các loài được tập trung nghiên cứu, các nghiên cứu bước đầu chỉ ra dịch chiết và một số hợp chất tinh khiết của loài này có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase trên mô hình in vitro và có khả năng làm giảm hàm lượng đường trong máu ở mô hình in vivo. Bên cạnh đó, theo y học cổ truyền, V. amygdalina cũng dùng để điều trị bệnh gút.

Mặt khác, loài V. gratiosa chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học. Đái tháo đường type 2 là tình trạng rối loạn chuyển hóa đa nguyên nhân, không kiểm soát được, gây ra những biến chứng nguy hiểm. Kiểm soát bệnh đái tháo đường type 2 bằng việc ức chế enzyme α-glucosidase là một trong những liệu pháp đang được sử dụng góp phần ổn định đường huyết sau bữa ăn.

Trong thập niên trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm kiếm các hoạt chất ức chế α-glucosidase hiệu quả từ các nguồn tự nhiên mục đích phát triển các thuốc mới để điều trị bệnh tiểu đường. Bên cạnh tiểu đường, bệnh gút cũng là một bệnh lý chuyển hóa có liên quan đến tăng nồng độ acid uric trong máu. Theo thống kê năm 2020, ước tính có khoảng 55,8 2 triệu người mắc bệnh gút trên toàn thế giới, tăng 22,5% so với năm 1990. Tổng số trường hợp mắc bệnh gút được dự đoán sẽ đạt 95,8 triệu người vào năm 2050.

Căn bệnh này là đặc trưng bởi các giai đoạn viêm khớp cấp tính hoặc mãn tính do lắng đọng tinh thể mononatri urate trong khớp và mô liên kết. Xanthine oxyase (XO) xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric. Acid uric đã được xác định là dấu hiệu của bệnh gút và một số bất thường về chuyển hóa.