Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ sâm mềm Brucea mollis

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ sâm mềm brucea mollis wall ex kurz, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn thiện trong

• Tác giả: Bùi Minh Nhuệ
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Mạnh Cường
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu)
• 1.1. Sơ lược về chi Brucea
• 1.2. Thành phần hóa học của chi Brucea
• 1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.2.3. Lớp chất quassinoit
• 1.2.4. Lớp chất ancaloit
• 1.2.5. Lớp chất tritecpenoit và steroit
• 1.2.6. Lớp chất flavonoit
• 1.2.7. Lớp chất axít béo và loại khác
• 1.3. Hoạt tính sinh học
• 1.3.1. Hoạt tính kháng u và ung thư
• 1.3.2. Hoạt tính chống sốt rét
• 1.3.3. Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus)
• 1.3.4. Hoạt tính chống đái đường
• 1.3.5. Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan
• 1.3.6. Hoạt tính kháng amíp
• 1.3.7. Các hoạt tính khác
• 1.4. Loài Brucea mollis (Khổ sâm mềm)
• 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
• 2.2. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
• 2.3. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
• 2.4. Các phương phương xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
• 2.5. Xác định điểm chảy và góc quay cực
• 2.6. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS)
• 2.7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
• 2.8. Phương pháp thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư in vitro
• 2.9. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
• 2.10. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay)
• 2.11. Xử lí mẫu thực vật và chiết tách
• 2.12. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định tên khoa học cây Brucea mollis
• 3.2. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào các cặn chiết từ lá cây Brucea mollis
• 3.3. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập
• 3.4. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm
• 3.5. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ sâm mềm

Cây khổ sâm mềm (Brucea mollis) là một trong những loài thực vật có giá trị dược liệu cao. Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc hóa học mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y học hiện đại. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây khổ sâm mềm chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các quassinoit và ancaloit. Những hợp chất này có khả năng kháng u, kháng sốt rét và nhiều tác dụng khác. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây khổ sâm mềm sẽ cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên.

1.1. Giới thiệu về cây khổ sâm mềm và chi Brucea

Cây khổ sâm mềm thuộc chi Brucea, họ Simaroubaceae, có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới. Tại Việt Nam, cây thường được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều bệnh lý như sốt rét, đau bụng và u nhọt. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây khổ sâm mềm có chứa nhiều hợp chất hóa học có giá trị, đặc biệt là các quassinoit, được biết đến với hoạt tính sinh học mạnh mẽ.

1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ sâm

Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây khổ sâm mềm tại Việt Nam còn hạn chế. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây này chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, như bruceoside và các quassinoit khác. Các nghiên cứu này cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều hợp chất mới và đánh giá tác dụng của chúng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu cây khổ sâm mềm

Mặc dù cây khổ sâm mềm có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ cây này gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là thiếu thông tin về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất trong cây. Ngoài ra, việc bảo tồn nguồn gen và môi trường sống của cây cũng là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

2.1. Thiếu thông tin về thành phần hóa học

Nhiều nghiên cứu hiện tại chỉ tập trung vào một số hợp chất nhất định mà chưa khai thác hết tiềm năng của cây khổ sâm mềm. Việc thiếu thông tin chi tiết về các hợp chất khác có thể dẫn đến việc bỏ lỡ những ứng dụng tiềm năng trong y học.

2.2. Vấn đề bảo tồn và phát triển bền vững

Cây khổ sâm mềm đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức và mất môi trường sống. Việc bảo tồn cây và phát triển bền vững là rất cần thiết để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất dược phẩm trong tương lai.

III. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học cây khổ sâm mềm

Để nghiên cứu thành phần hóa học của cây khổ sâm mềm, các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng, phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân được áp dụng. Những phương pháp này giúp phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất có trong cây, từ đó đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

3.1. Phương pháp phân lập hợp chất từ cây khổ sâm

Các hợp chất được phân lập từ cây khổ sâm mềm thông qua các phương pháp chiết xuất và sắc ký. Các dịch chiết từ lá và thân cây được sử dụng để tách biệt các hợp chất có hoạt tính sinh học, từ đó xác định cấu trúc hóa học của chúng.

3.2. Phân tích hoạt tính sinh học của các hợp chất

Sau khi phân lập, các hợp chất sẽ được thử nghiệm để đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Các thử nghiệm này bao gồm kiểm tra khả năng ức chế tế bào ung thư, kháng sốt rét và các hoạt tính sinh học khác. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển sản phẩm dược phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu cây khổ sâm mềm

Nghiên cứu về cây khổ sâm mềm đã chỉ ra rằng các hợp chất trong cây có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y học. Các hợp chất như bruceoside và quassinoit đã được chứng minh có hoạt tính kháng u và kháng sốt rét. Những kết quả này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên.

4.1. Tác dụng kháng u của cây khổ sâm mềm

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất trong cây khổ sâm mềm có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Các hợp chất như bruceoside C đã cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ đối với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau.

4.2. Khả năng kháng sốt rét của cây khổ sâm

Cây khổ sâm mềm cũng được biết đến với khả năng kháng sốt rét. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất trong cây có thể ức chế sự phát triển của ký sinh trùng Plasmodium falciparum, nguyên nhân gây bệnh sốt rét.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu cây khổ sâm mềm

Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây khổ sâm mềm đã mở ra nhiều cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác hết tiềm năng của cây và bảo tồn nguồn gen. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu cây khổ sâm mềm

Nghiên cứu cây khổ sâm mềm không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn góp phần vào việc phát triển các sản phẩm dược phẩm an toàn và hiệu quả từ thiên nhiên. Điều này rất quan trọng trong bối cảnh hiện nay khi mà nhu cầu về thuốc ngày càng tăng cao.

5.2. Hướng đi tương lai cho nghiên cứu

Cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để khám phá các hợp chất mới và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Đồng thời, việc bảo tồn và phát triển bền vững cây khổ sâm mềm cũng cần được chú trọng để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thế giới hiện nay đã vượt mốc bảy tỷ người, kéo theo áp lực to lớn đối với hệ thống y tế công cộng và nhu cầu cấp thiết về các nguồn dược liệu tự nhiên. Trong bối cảnh tình trạng kháng thuốc diễn biến phức tạp, thiên nhiên tiếp tục là kho tàng vô tận cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học quý giá. Việt Nam là quốc gia nhiệt đới gió mùa có tính đa dạng sinh học cao với khoảng 10.368 loài thực vật bậc cao, trong đó có tới 3.830 loài có tiềm năng ứng dụng làm thuốc chữa bệnh. Tuy nhiên, phần lớn các bài thuốc dân gian truyền thống mới chỉ dừng lại ở dạng kinh nghiệm điều trị mà chưa được nghiên cứu thấu đáo về thành phần hóa học cũng như cơ chế tác dụng sinh học theo chuẩn mực y học hiện đại.

Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) thuộc họ Thanh Thất (Simaroubaceae) từ lâu đã được nhân dân sử dụng làm vị thuốc trị sốt rét, đau bụng, amíp và u nhọt. Trong một chương trình hợp tác quốc tế sàng lọc hoạt tính sinh học từ thực vật năm 2002, dịch chiết metanol từ lá cây Khổ sâm mềm đã thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ lên đến 96% đối với dòng tế bào ung thư phổi người A549. Xuất phát từ cơ sở thực tiễn đó, luận văn thạc sĩ chuyên ngành Hóa hữu cơ đã thực hiện đề tài nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học của cây Khổ sâm mềm.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là phân lập các hợp chất tinh khiết từ mẫu lá cây thu hái tại Mai Châu, tỉnh Hòa Bình vào tháng 3 năm 2009, xác định chính xác cấu trúc hóa học của chúng và sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Luận văn hoàn thành năm 2012 với kết quả phân lập thành công năm hợp chất sạch từ 2,6 kg bột lá khô, đồng thời chứng minh phân đoạn n-hexan có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 với giá trị IC50 đạt 1,03 µg/ml, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm thuốc kháng u từ nguồn dược liệu bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên và mối quan hệ hóa phân loại học (Chemotaxonomy) của họ Thanh Thất (Simaroubaceae). Về mặt lý thuyết, chi Brucea là nguồn tài nguyên đặc trưng của lớp chất quassinoit - các tritecpen thoái biến đắng có từ 18 đến 25 nguyên tử cacbon được phân loại thành năm bộ khung cơ bản gồm C-18, C-19, C-20, C-22 và C-25. Con đường sinh tổng hợp quassinoit diễn ra thông qua sự thoái biến của khung triterpenoid bằng các phản ứng oxy hóa tương tự phản ứng Baeyer-Villiger, cắt đứt liên kết cacbon C-16/C-17 để tạo vòng lacton năm hoặc sáu cạnh.

Trong lịch sử nghiên cứu quốc tế từ năm 1900 đến nay, hơn 100 hợp chất tự nhiên đã được phân lập từ chi Brucea, trong đó quassinoit chiếm hơn 50% tổng số chất và nổi bật với khả năng kháng u bạch cầu, chống sốt rét kháng chloroquine, kháng virus TMV và hạ đường huyết. Bên cạnh quassinoit, khung lý thuyết phân loại thực vật hóa học còn chỉ ra sự tồn tại của 25 ancaloit khung canthin-6-one, các dẫn xuất triterpenoid, steroit và polyprenoid. Khái niệm độc tính tế bào (cytotoxicity) và chỉ số nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư (IC50) được áp dụng làm thước đo định lượng chủ đạo để đánh giá hiệu lực dược lý của từng phân đoạn dịch chiết.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu là mẫu lá cây Khổ sâm mềm được thu hái có chủ đích tại vùng đồi núi cao 1200 đến 1700 mét thuộc xã Pà Cò, huyện Mai Châu, tỉnh Hòa Bình vào tháng 3 năm 2009. Cỡ mẫu nghiên cứu ban đầu gồm 2,6 kg lá cây phơi khô, nghiền nhỏ. Tiêu bản thực vật được giám định tên khoa học chính xác và lưu trữ tại Phòng Tiêu bản Thực vật Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật với ký hiệu VK 2211 (HN). Phương pháp chọn mẫu dựa trên định hướng hoạt tính sinh học từ các khảo sát dược lý sơ bộ trước đó.

Quy trình chiết tách sử dụng phương pháp ngâm chiết kiệt hồi lưu với dung môi metanol (12 lít chia làm 3 lần) ở nhiệt độ phòng, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được 191 gam cặn cô tổng số. Cặn tổng được phân bố lỏng - lỏng lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan (thu được 80 gam cặn), diclorometan (21 gam), etyl axetat (8 gam) và phần nước còn lại. Quá trình phân lập các chất sạch sử dụng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường (kích thước hạt 40-63 µm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan : axeton theo gradient từ 100% n-hexan đến 100% axeton, kết hợp sắc ký bản mỏng và kết tinh phân đoạn.

Cấu trúc phân tử được giải đoán toàn diện thông qua các phương pháp vật lý hiện đại: đo điểm nóng chảy trên máy Boetius, đo góc quay cực trên máy Polartronic-D, ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR tại 500 MHz, 13C-NMR tại 125 MHz) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) trên máy Bruker Avance 500 MHz, cùng phổ khối lượng ESI-MS và HR-ESI-MS trên thiết bị Agilent 6510 Q-TOF. Hoạt tính gây độc tế bào được thử nghiệm in vitro theo phương pháp nhuộm sulforhodamine B (SRB) trên phiến vi lượng 96 giếng ở dải nồng độ từ 0,8 đến 100 µg/ml đối với các dòng tế bào ung thư người (LU-1, Hep-G2, MCF-7), đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 515 nm, sử dụng chất chuẩn đối chứng dương là Ellipticine và đối chứng âm là dung dịch DMSO 10%.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai đề tài đã đem lại bốn phát hiện khoa học mang tính đột phá và đóng góp dữ liệu quan trọng cho ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên Việt Nam:

Thứ nhất, nghiên cứu đã đính chính thành công định danh thực vật học của loài cây nghiên cứu. Mẫu cây thu thập tại Hòa Bình trước đây từng bị phân loại nhầm thành Meliosma pinnata thuộc họ Sabiaceae. Qua phân tích chi tiết hình thái thực vật kết hợp với việc phát hiện các hợp chất hóa thực vật đặc trưng như quassinoit và ancaloit khung canthin-6-one, luận văn đã khẳng định chắc chắn tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Brucea mollis Wall. ex Kurz thuộc họ Simaroubaceae.

Thứ hai, kết quả thử nghiệm sinh học in vitro cho thấy phân đoạn dịch chiết n-hexan có hoạt tính gây độc tế bào vượt trội trên cả ba dòng tế bào ung thư khảo sát. Cụ thể, phân đoạn n-hexan ức chế tế bào ung thư gan người Hep-G2 với chỉ số IC50 đạt 1,03 µg/ml (mạnh hơn 14 lần so với cặn tổng metanol ban đầu là 14,49 µg/ml), ức chế dòng ung thư phổi LU-1 với IC50 đạt 3,5 µg/ml (mạnh hơn 8 lần so với cặn metanol là 28,4 µg/ml), và ức chế dòng ung thư vú MCF-7 với IC50 đạt 5,8 µg/ml (mạnh hơn 10 lần so với cặn metanol là 61,6 µg/ml). Trong khi đó, phân đoạn cloroform thể hiện hoạt tính yếu với IC50 từ 58,43 đến 61,21 µg/ml và phân đoạn nước hầu như không có hoạt tính với IC50 vượt quá 128 µg/ml.

Thứ ba, từ 101 gam cặn gộp phân đoạn n-hexan và diclorometan, nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc của năm hợp chất tinh khiết gồm:

• BM.01 (22 mg): octatriacontan-1-ol, một ancol no mạch thẳng có công thức phân tử C38H78O, khối lượng phân tử 550 g/mol.
• BM.02 (24 mg): tetratriacontan-1-ol, một ancol no đơn chức có công thức phân tử C33H68O, khối lượng phân tử 479 g/mol.
• BM.03 (500 mg): stigmast-5,22-dien-3-ol (stigmasterol), tinh thể hình kim không màu có công thức phân tử C29H58O, nhiệt độ nóng chảy 155-157 độ C.
• BM.04 (70 mg): bombiprenone, một polyprenoid ketone gồm tám đơn vị isopren liên kết mạch dài có công thức phân tử C43H70O, khối lượng phân tử 602 g/mol.
• BM.05 (75 mg): alpha-tocopherol (vitamin E), hợp chất chứa nhân croman có công thức phân tử C29H50O2, khối lượng phân tử 430 g/mol.

Thứ tư, bốn trong tổng số năm hợp chất phân lập được (gồm BM.01, BM.02, BM.04 và BM.05) lần đầu tiên được phát hiện và công bố xuất hiện trong toàn bộ chi Brucea trên thế giới.

Thảo luận kết quả

Hiệu lực ức chế tế bào ung thư mạnh mẽ của phân đoạn n-hexan được giải thích bởi sự tích tụ của các hợp chất thân dầu có cấu trúc polyprenoid, steroit và dẫn xuất lipid. Các phân tử không phân cực này có khả năng thâm nhập thuận lợi qua màng kép phospholipid của tế bào khối u, gây xáo trộn tính toàn vẹn màng tế bào và khởi động các chuỗi tín hiệu apoptosis làm ngừng chu kỳ phân chia tế bào. Sự hiện diện với hàm lượng cao của stigmasterol (500 mg) và alpha-tocopherol (75 mg) trong lá cây mang lại cơ chế chống oxy hóa hiệp đồng, giúp trung hòa các gốc tự do gây tổn thương DNA.

Khi đối chiếu với các công bố quốc tế về chi Brucea, phần lớn các nghiên cứu trước đây tại Trung Quốc hay Hoa Kỳ tập trung chủ yếu vào nhóm quassinoit phân cực từ hạt cây Brucea javanica (như bruceantin hay bruceoside). Nghiên cứu này mở ra một hướng tiếp cận mới khi chứng minh rằng các hợp chất mạch dài và polyprenoid trong phần lá của loài Brucea mollis tại Việt Nam cũng đóng góp vai trò dược lý vô cùng quan trọng.

Toàn bộ dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính sinh học có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua biểu đồ cột so sánh tương quan giá trị IC50 giữa bốn phân đoạn chiết xuất đối với ba dòng ung thư, thể hiện rõ sự vượt trội của phân đoạn n-hexan. Đồng thời, bảng đối chiếu 29 tín hiệu độ dịch chuyển hóa học cacbon 13C-NMR của hợp chất BM.05 với chất chuẩn alpha-tocopherol cho thấy độ sai lệch cực nhỏ (chỉ từ 0,1 đến 0,4 ppm), khẳng định tính chính xác tuyệt đối trong việc xác định cấu trúc phân tử bằng kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra bốn nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể nhằm thúc đẩy việc khai thác ứng dụng thực tiễn của cây Khổ sâm mềm:

1. Hoàn thiện và tối ưu hóa quy trình chiết tách quy mô bán công nghiệp: Viện Hóa học chủ trì nâng cấp quy trình chiết xuất sử dụng công nghệ vi sóng hoặc sóng siêu âm kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC), đặt mục tiêu nâng cao hiệu suất thu hồi các hợp chất bombiprenone và stigmasterol lên trên 85% trong khung thời gian 12 tháng tới.
2. Triển khai thử nghiệm dược lý chuyên sâu trên mô hình in vivo: Nhóm nghiên cứu phối hợp với các cơ sở y dược thực hiện đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và khả năng ức chế kích thước khối u trên chuột mang khối u thực nghiệm, hướng tới mục tiêu giảm thể tích khối u tối thiểu 50% sau 28 ngày điều trị trong lộ trình nghiên cứu 24 tháng.
3. Mở rộng thăm dò các phân đoạn có độ phân cực cao: Tiếp tục phân lập sâu nhóm hợp chất quassinoit và ancaloit khung canthin-6-one từ cặn chiết etyl axetat và dịch nước, hướng đến mục tiêu tìm kiếm các cấu trúc mới có hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng virus với giá trị IC50 dưới 0,1 µg/ml trong giai đoạn 18 tháng.
4. Xây dựng vùng trồng bảo tồn dược liệu chuẩn hóa: Chính quyền địa phương tại Hòa Bình và Lào Cai phối hợp cùng các doanh nghiệp dược phẩm quy hoạch vùng trồng bảo tồn nguồn gen cây Khổ sâm mềm đạt tiêu chuẩn GACP-WHO với diện tích ban đầu từ 2 đến 5 hecta trong thời gian 3 năm, bảo đảm cung ứng bền vững nguyên liệu cho công nghiệp dược phẩm tự nhiên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn thạc sĩ này là nguồn tư liệu học thuật và thực tiễn giá trị cao cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

• Các nhà nghiên cứu và học viên sau đại học chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược và Hóa thực vật: Luận văn cung cấp bản hướng dẫn chi tiết về kỹ thuật phân tách sắc ký cột silica gel từ 2,6 kg mẫu thô, cùng phương pháp luận giải mã phổ 1D và 2D-NMR 500 MHz cho các cấu trúc chuỗi aliphatic và polyprenoid phức tạp.
• Chuyên gia nghiên cứu và phát triển thuốc (R&D) tại các viện nghiên cứu và công ty dược: Khai thác trực tiếp dữ liệu sàng lọc độc tính tế bào với giá trị IC50 đạt 1,03 µg/ml trên dòng ung thư gan Hep-G2 để định hướng phát triển các hoạt chất dẫn đường (lead compounds) trong điều trị ung bướu.
• Nhà thực vật học và chuyên gia phân loại sinh học: Tham khảo các tiêu chí mô tả hình thái và bằng chứng hóa phân loại học thực tế để phân biệt rõ ràng giữa cây Khổ sâm mềm họ Simaroubaceae và cây Meliosma pinnata họ Sabiaceae, tránh nhầm lẫn trong quá trình thu thập mẫu tự nhiên.
• Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe và mỹ phẩm thiên nhiên: Ứng dụng nguồn dồi dào alpha-tocopherol (75 mg) và phytosterol (500 mg) phân lập từ lá Khổ sâm mềm để nghiên cứu công thức sản phẩm chống lão hóa, bảo vệ tế bào và hỗ trợ tăng cường miễn dịch.

Câu hỏi thường gặp

Cây Khổ sâm mềm có đặc điểm gì để phân biệt với loài dễ nhầm lẫn trong tự nhiên?

Khổ sâm mềm (Brucea mollis) có cành to màu đỏ-nâu với nhiều bì khổng trắng, lá kép lông chim lẻ 5-15 lá chét phủ lông vàng khi non. Cây dễ bị nhầm với Meliosma pinnata (họ Sabiaceae), nhưng về mặt hóa học Khổ sâm mềm chứa quassinoit vị đắng đặc trưng và ancaloit canthin-6-one, giúp định danh chính xác thông qua kiểm nghiệm hóa thực vật.

Vì sao phân đoạn n-hexan từ lá cây Khổ sâm mềm lại thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao nhất?

Phân đoạn n-hexan thể hiện hoạt tính mạnh nhất với IC50 đạt 1,03 µg/ml trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 nhờ tập trung các hợp chất thân dầu như bombiprenone (70 mg), stigmasterol (500 mg) và lipid mạch dài. Các chất này dễ dàng tương tác và làm biến đổi tính thấm màng tế bào ung thư, gây ức chế sinh trưởng tế bào.

Luận văn đã có những đóng góp mới nào về mặt thành phần hóa học cho chi Brucea?

Luận văn đã phân lập thành công năm hợp chất tinh khiết từ lá cây, trong đó có bốn hợp chất lần đầu tiên được ghi nhận xuất hiện trong toàn bộ chi Brucea trên thế giới gồm hai ancol mạch dài octatriacontan-1-ol (22 mg), tetratriacontan-1-ol (24 mg), hợp chất polyprenoid bombiprenone (70 mg) và chất chống oxy hóa alpha-tocopherol (75 mg).

Phương pháp phân tích nào đóng vai trò quyết định trong việc giải đoán cấu trúc hóa học?

Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 1D và 2D-NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) đo ở tần số 500 MHz kết hợp với phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS là công cụ quyết định, cho phép xác định chính xác vị trí liên kết cacbon, các nhóm chức và cấu hình không gian của từng hợp chất.

Hợp chất bombiprenone (BM.04) phân lập được có đặc điểm cấu tạo hóa học như thế nào?

Bombiprenone (BM.04) là một polyprenoid ketone mạch dài có công thức phân tử C43H70O, phân tử lượng 602 g/mol. Phân tử gồm tám đơn vị isopren nối tiếp nhau tạo nên khung mạch 43 cacbon với bảy nhóm metyl, bảy nhóm metin olefinic và một nhóm carbonyl đặc trưng tại độ dịch chuyển hóa học 208,8 ppm trên phổ 13C-NMR.

Kết luận

Nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra với những đóng góp thực tiễn nổi bật:

• Khẳng định và đính chính chính xác tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Brucea mollis thuộc họ Simaroubaceae dựa trên dữ liệu hình thái và bằng chứng hóa thực vật học.
• Chiết xuất thành công 191 gam cao tổng từ 2,6 kg lá khô và phân lập được năm hợp chất tinh khiết có cấu trúc xác định rõ ràng.
• Đóng góp bốn hợp chất mới lần đầu tiên được phát hiện trong chi Brucea gồm octatriacontan-1-ol, tetratriacontan-1-ol, bombiprenone và alpha-tocopherol.
• Chứng minh phân đoạn n-hexan có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 rất mạnh với giá trị IC50 đạt 1,03 µg/ml và ung thư phổi LU-1 với IC50 đạt 3,5 µg/ml.
• Thiết lập cơ sở dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz chuẩn mực cho các dẫn xuất lipid và polyprenoid từ nguồn thực vật Việt Nam.

Trong lộ trình từ 12 đến 36 tháng tới, các nhóm nghiên cứu cần đẩy mạnh thử nghiệm in vivo và tối ưu hóa quy trình chiết xuất nhằm sớm ứng dụng các hoạt chất từ Khổ sâm mềm vào sản xuất dược phẩm. Hãy kết nối và hợp tác nghiên cứu để khai phá toàn diện tiềm năng y dược phong phú từ nguồn tài nguyên bản địa Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay dân số thế giới đã đạt đến con số bảy tỷ ngƣời, một con số khổng lồ. Nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo. Trong khi đó tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hƣớng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nƣớc đang phát triển, đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới. Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ mà đến nay thế giới vẫn chƣa khám phá hết.

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật đa dạng phong phú với 10.368 loài thực vật, trong đó có tới 3.830 loài có khả năng dùng làm thuốc (Viện dược liệu, 2001). Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta cần phải tận dụng. Tuy nhiên tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hƣớng khắc nghiệt hơn đã và đang làm cho một số lƣợng lớn các loài suy thoái dần. Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài ngƣời.

Hiện nay, hầu hết các bài thuốc gia truyền đều sử dụng theo kinh nghiệm, phần lớn chƣa đƣợc chứng minh theo y học hiện đại. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng ở dạng sắc lấy nƣớc uống hoặc ở dạng cao, viên. Đó là một hỗn hợp bao gồm nhiều thành phần khác nhau, có những thành phần có khả năng làm tăng hoặc giảm hoạt tính hoặc độc tính của thuốc. Vì vậy, xu hƣớng chữa bệnh hiện nay là kết hợp Đông – Tây y với phƣơng châm vừa áp dụng kinh nghiệm chữa bệnh của cha ông ta bằng thuốc Nam, vừa nghiên cứu tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại, từ đó tạo cơ sở cho sử dụng tốt hơn cây thuốc và bài thuốc dân tộc.

Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) đƣợc sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở. Ngoài ra, trong chƣơng trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc, 2002, nhằm tìm kiếm các loài thực vật có hoạt tính kháng lại dòng ung thƣ phổi ngƣời A549, các tác giả đã phát hiện ra cây B. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] mollis có hoạt tính rất mạnh, dịch chiết MeOH từ lá cây Khổ sâm mềm ức chế tới 96% tế bào ung thƣ phổi ngƣời A549 [14].

Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: " Nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây 2. Xác định các hợp chất có hoạt tính kháng ung thƣ 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1.

Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) 1. Sơ lƣợc về chi Brucea Brucea (Sầu đâu) là một chi thuộc họ Simaroubaceae (Thanh Thất) với sáu loài chính (Brucea javanica, Brucea mollis var. tonkinensis, Brucea guineensis, Brucea sumatrana, Brucea antidysenterica và Brucea amarissima) đƣợc phân bố ở các vùng nhiệt đới phía đông bán cầu [4], [5]. Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, chi Brucea có ba loài gồm Brucea javanica, Brucea mollis và Brucea mollis var.Trong đó, có hai loài đƣợc sử dụng trong dân gian để làm thuốc là Sầu đâu cứt chuột (Brucea javanica) và Khổ sâm mềm (Brucea mollis) trị sốt rét, đau bụng, u nhọt., thƣờng mọc ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1].

Ở Trung Quốc, hai loài Brucea mollis và Brucea javanica cũng đƣợc sử dụng nhƣ là thuốc thảo dƣợc truyền thống bởi vì hoạt tính chống ung thƣ và chống sốt rét của chúng [6]. Gần đây, các cây thuộc chi Brucea đã thu hút nhiều sự quan tâm và đầu tƣ nghiên cứu thành phần hóa học, bởi vì hoạt tính đa dạng và phong phú của chúng. Các nghiên cứu hóa học về chi Brucea đã phát hiện ra nhiều hợp chất thuộc các lớp chất chính là quassinoit, ancaloit, tritecpenoit và flavonoit. Thành phần hóa học của chi Brucea 1.

Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Ở trong nƣớc, cho đến nay chỉ có ba công bố các nghiên cứu về hai loài trong chi Brucea là B. Một công bố của Ngô Văn Thu, 1979, nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của các dịch chiết từ cây B. Trần Văn Sung và cộng sự đã phân lập đƣợc một glycoside mới từ lá cây B. Và mới đây, 2009, GS.

Douglas Kinghorn, Ohio Mỹ, nghiên cứu phân tách theo định hƣớng thử hoạt tính sinh học các thành phần có hoạt tính gây độc tế bào từ cây B. javanica thu hái tại Việt Nam [9]. Từ cây này đã tách ra đƣợc năm tritecpenoit, hai quassinoit và một flavonolignan. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Cho đến nay, đã có năm loài trong sáu loài chính của chi Brucea đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới gồm: B.

Kể từ năm 1900, đã có hơn 100 hợp chất hóa học đƣợc tách ra từ chi Brucea, bao gồm các lớp chất: quassinoit, ancaloit, tritecpenoit, flavonoit và các axít béo [6- 74]. Trong đó lớp chất, quassinoit là lớp chất chính, chiếm hơn 50% trên tổng số các hợp chất đƣợc tách ra từ chi này. Cấu trúc các hợp chất đƣợc chỉ ra ở phần sau; tên của hợp chất và nguồn gốc cây tƣơng ứng đƣợc liệt kê ở Bảng 1. Lớp chất quassinoit Lớp chất quassinoit là thành phần chính của chi Brucea.

Cho đến nay, có khoảng 75 quassinoit 1-75, đƣợc phân lập từ chi Brucea [10-45]. Các quassinoit chủ yếu đƣợc tách từ quả và hạt của cây, một số quassinoit có hoạt tính sinh học lý thú. Bruceantinol A 12, bruceene 16, bruceine H-J 24-26, bruceoside A-G 27-33, dehydrobruceine A và B 37, 38, javanicolide A-D 41-44, javanicoside A-H 45-52, yadanzigan 57, yadanziolide B, C, và S 58-60, và yadanzioside A-O 61-75 đƣợc phân lập từ cây B. Yadanzigan 57 và yadanzioside B 62, C 63, E 65, I 69 và K 71 cũng đƣợc phân lập từ B.

amarissima, và yadanzioside M 73 cũng đƣợc tìm thấy từ B. Các bruceine A-G 17-23 và javanicoside I-L 53-56 đƣợc phân lập từ B. Trong số chúng bruceines A-G 17-23 cũng đƣợc tìm thấy ở B. Chỉ có duy nhất một chất brusatol 34 là đƣợc phân lập từ cây B.

Hợp chất 34 cũng đƣợc báo cáo ở cây B. Các quassinoit còn lại đƣợc phân lập từ B. Bruceantarin 9, bruceantin 10, bruceantinol 11, bruceantinoside A và B 13 và 14 đƣợc tách từ cây B. Lớp chất ancaloit Cho đến nay có 25 ancaloit 76-100 đƣợc phân lập từ chi Brucea [6], [46-53], [58].

Các hợp chất này phân bố chủ yếu ở hai cây B. Lớp chất tritecpenoit và steroit 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Có tám tritecpenoit, bruceajavanin A, B 101, 102, dihydrobruceajavanin A 103, bruceajavanone A, B, C, bruceajavanone A 7-axetat và bruceajavaninone A; một steroit, daucosterol 104, đƣợc phân lập từ cây B. Lớp chất flavonoit Có hai flavonoit, luteolin-7-O--D-glucoside 105 và quercetin-3-O--D- galactoside 106 đƣợc phân lập từ cây B. Lớp chất axít béo và loại khác Có chín axít béo 107-115 và axít vanillic 116 đƣợc phân lập từ B.

5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 76 77 80 85 87 95 96 97 98 99 1 R MeO MeO MeO H OH MeO H H H H R2 H H OH H H H H H H H R3 H H H MeO H H H H MeO H R4 MeO OH MeO MeO MeO H OH H H MeO 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Thành phần hóa học các cây thuộc chi Brucea STT Phân loại và tên chất Tách ra từ cây TLTK Quassinoit 1 Bruceanol A B. javanica [22] 14 BruceantinosideB, yadanzioside P B. amarissima [28] 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 24 Bruceine H, yadanziolide A B.

antidysenterica [45] 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. javanica [44] Ancaloit 76 1,11-dimethoxycanthin-6-one B. antidysenterica [46] 77 11-hydroxy-1-methoxycanthin-6-one B. tonkinenis [48] 85 5,11-dimethoxycanthin-6-one B.

tonkinenis [48] 86 11-hydroxycanthin-6-one N-oxide B. tonkinenis [49] 87 1-hydroxy-11-methoxycanthin-6-one B. tonkinenis [48] 92 1-ethyl-b-carboline B. tonkinenis [48] 93 9H-pyrido[3,4-]indole-1-ethanol B.

tonkinenis [48] 94 -carboline-1-propionic acid B. tonkinenis [48] 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 95 1-methoxycanthin-6-one B. antidysenterica [47] 96 11-hydroxycanthin-6-one B. tonkinenis [48] 97 Canthin-6-one B.

javanica [52] 98 5-methoxycanthin-6-one B. javanica [52] 99 11-methoxycanthin-6-one B. javanica [52] 100 Canthin-6-one N-oxide B. javanica [52] Tritecpenoit and steroit 101 Bruceajavanin A B.

javanica [58] Flavonoit 105 Luteolin-7-O--D-glucoside B.javanica [58] 106 Quercetin-3-O--D-galactoside B. javanica [58] Axít béo và các hợp chất khác 107 Axít cerotic B. sumatrana [58] 108 Axít crotonic B. javanica [58] 109 Axít cis-oleic B.

javanica [58] 110 Axít palmitic B. sumatrana [58] 111 Axít stearic B. sumatrana [58] 112 Axít linoleic B. sumatrana [58] 113 Axít behenic B.

sumatrana [7] 114 Axít 8-hydroxyhexadecanoic B. javanica [41] 115 Axít azelaic B. javanica [41] 116 Axít vanillic B. Hoạt tính sinh học Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Brucea cho thấy nhiều hợp chất có phổ hoạt tính rộng và mạnh nhƣ: kháng u, ung thƣ, sốt rét, virus.

Hoạt tính kháng u và ung thƣ Hiện nay có một số công bố về hoạt tính của các hợp chất nhƣ: bruceoside C 29 có hoạt tính gây độc tế bào mạnh kháng lại các tế bào ung thƣ KB (ung thƣ biểu mô), A549 (ung thƣ phổi), RPMI (u ác tính), và TE-671 (u nguyên tủy bào) [30]. Bruceoside D, E, và F 30–32 gây độc tế bào chọn lọc kháng lại các dòng tế bào ung 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thƣ bạch cầu, ung thƣ phổi, ung thƣ đại tràng, u ác tính, và ung thƣ buồng trứng với giá trị log|GI50| nằm trong khoảng -4,14 đến -5,72 [31]. Các bằng chứng thực nghiệm thuốc đã cung cấp một giải thích khoa học về việc dân gian đã sử dụng cây B. javanica để điều trị một số bệnh liên quan đến ung thƣ.

Ngoài ra, bruceatin 10 và bruceantinol 11 cũng có hoạt tính kháng ung thƣ bạch cầu [10], [17]. Hoạt tính chống sốt rét Năm 1987, trong một thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng ký sinh trùng sốt rét các hợp chất bruceantin 10, bruceantinol 11, bruceine A-D 17-20, yadanziolide A 24, brusatol 34, và dehydrobruceine A 37, cho giá trị IC50 in vitro trong khoảng 0,0460,0008 µg/ml, điều đó chứng tỏ các chất này kháng rất mạnh chủng ký sinh trùng Plasmodium falciparum gây bệnh sốt rét - chủng ký sinh trùng này kháng thuốc chloroquine dùng cho điều trị sốt rét. Trong cuộc thử nghiệm in vivo, có bốn quassinoit bruceine A 17, B 18, bruceine D 20, và brusatol 34, đã thể hiện hoạt tính chống lại sự nhiễm trùng P.