Nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro của cây thâu lĩnh Alphonsea tonkinensis

Nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro của cây thâu lĩnh Alphonsea tonkinensis A. DC thuộc họ Annonaceae, khám phá tiềm năng dược liệu.

• Tác giả: Nguyễn Thị Oanh Thư
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Viết Khẩn
• Trường học: Trường Đại học Y Dược Huế
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên cứu hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Huế

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• 2. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 3. DANH MỤC CÁC HÌNH
• 4. MỤC LỤC
• 4.1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• 4.2. DANH MỤC CÁC BẢNG
• 4.3. DANH MỤC CÁC HÌNH
• 4.4. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 4.4.1. Tổng quan về chi Alphonsea
• 4.4.1.1. Vị trí phân loại và phân bố
• 4.4.1.2. Đặc điểm thực vật
• 4.4.1.3. Thành phần hóa học
• 4.4.1.4. Hoạt tính sinh học
• 4.4.2. Tổng quan về loài Thâu lĩnh (Alphonsea tonkinensis A.)
• 4.4.2.1. Phân loại
• 4.4.2.2. Đặc điểm thực vật
• 4.4.2.3. Thành phần hóa học
• 4.4.2.4. Hoạt tính sinh học
• 4.4.3. Tổng quan về nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) in vitro
• 4.4.3.1. Acetylcholine (ACh), enzyme AChE và giả thuyết về vai trò của hệ Cholinergic đối với bệnh Alzheimer (AD)
• 4.4.3.2. Phương pháp trong nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế enzyme AChE in vitro
• 4.5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 4.5.2. Hóa chất và dung môi
• 4.5.3. Trang thiết bị và dụng cụ
• 4.5.4. Phương pháp nghiên cứu
• 4.5.4.1. Phương pháp chiết xuất
• 4.5.4.2. Phương pháp phân lập
• 4.5.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc
• 4.5.4.4. Phương pháp xác định các hoạt tính sinh học in vitro
• 4.5.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro
• 4.5.4.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro
• 4.5.4.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro
• 4.5.4.8. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro
• 4.5.4.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 4.6. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.6.1. Kết quả quá trình chiết xuất và phân lập
• 4.6.1.1. Chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn
• 4.6.1.2. Quá trình phân lập phân đoạn
• 4.6.2. Xác định cấu trúc hợp chất đã phân lập
• 4.6.3. Kết quả hoạt tính sinh học
• 4.6.3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro
• 4.6.3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro
• 4.6.3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro
• 4.6.3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro
• 4.6.4. Về quá trình chiết xuất, phân lập hợp chất
• 4.6.4.1. Quá trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc
• 4.6.4.2. Hợp chất phân lập được
• 4.6.5. Về hoạt tính sinh học
• 4.6.5.1. Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase in vitro
• 4.6.5.2. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro
• 4.6.5.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro
• 4.6.5.4. Hoạt tính kháng viêm in vitro
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis

Nghiên cứu về Alphonsea tonkinensis đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực dược liệu. Loài cây này thuộc họ Na (Annonaceae) và có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất chiết xuất từ loài này có thể có hoạt tính sinh học đáng kể, bao gồm khả năng chống oxy hóa và kháng viêm.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của Alphonsea tonkinensis

Alphonsea tonkinensis là cây gỗ nhỏ, cao từ 7-8 m, với lá mỏng và hoa màu vàng. Loài này chủ yếu phân bố ở bán đảo Đông Dương, đặc biệt là tại Việt Nam.

1.2. Thành phần hóa học của Alphonsea tonkinensis

Thành phần hóa học của Alphonsea tonkinensis chủ yếu bao gồm các hợp chất alkaloid, terpenoid và steroid. Những hợp chất này có thể đóng góp vào hoạt tính sinh học của loài cây này.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis vẫn còn hạn chế. Thiếu thông tin về các hoạt chất cụ thể và cơ chế tác động của chúng là một thách thức lớn. Điều này cần được giải quyết để khai thác tối đa giá trị của loài cây này.

2.1. Thiếu hụt dữ liệu nghiên cứu

Hiện tại, chưa có nhiều nghiên cứu công bố về hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis, điều này gây khó khăn trong việc đánh giá tiềm năng của loài cây này.

2.2. Cần có phương pháp nghiên cứu hiệu quả

Việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại và hiệu quả là cần thiết để xác định hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis một cách chính xác.

III. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis

Để đánh giá hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis, nhiều phương pháp nghiên cứu đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất, phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro.

3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất

Chiết xuất từ lá và thân cây Alphonsea tonkinensis được thực hiện bằng các dung môi khác nhau để thu được các hợp chất có hoạt tính sinh học.

3.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme AChE

Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman để đánh giá hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE) là một trong những phương pháp quan trọng trong nghiên cứu này.

IV. Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis

Kết quả nghiên cứu cho thấy Alphonsea tonkinensis có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý. Các hợp chất chiết xuất từ loài này đã cho thấy khả năng chống oxy hóa và kháng viêm hiệu quả.

4.1. Hoạt tính chống oxy hóa của Alphonsea tonkinensis

Nghiên cứu cho thấy các hợp chất từ Alphonsea tonkinensis có khả năng trung hòa gốc tự do, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển sản phẩm chống oxy hóa.

4.2. Hoạt tính kháng viêm của Alphonsea tonkinensis

Các dịch chiết từ Alphonsea tonkinensis đã cho thấy khả năng giảm sản xuất các cytokine gây viêm, mở ra hướng nghiên cứu mới trong điều trị các bệnh viêm.

V. Ứng dụng thực tiễn của Alphonsea tonkinensis trong y học

Alphonsea tonkinensis có thể được ứng dụng trong y học như một nguồn dược liệu quý giá. Các hoạt chất từ loài cây này có thể được phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh.

5.1. Phát triển sản phẩm từ Alphonsea tonkinensis

Các nghiên cứu cần được tiếp tục để phát triển các sản phẩm từ Alphonsea tonkinensis, nhằm khai thác tối đa tiềm năng của loài cây này trong y học.

5.2. Tương lai của nghiên cứu Alphonsea tonkinensis

Nghiên cứu về Alphonsea tonkinensis cần được mở rộng để khám phá thêm nhiều hoạt tính sinh học và ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh.

VI. Kết luận về nghiên cứu hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của Alphonsea tonkinensis cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ hơn về các hoạt chất và cơ chế tác động của chúng.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng Alphonsea tonkinensis có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý, mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu dược liệu.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về Alphonsea tonkinensis để khai thác tối đa tiềm năng của loài cây này trong y học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới, các bệnh lý mãn tính và thoái hóa thần kinh đang trở thành thách thức y tế hàng đầu với mức độ gia tăng nhanh chóng. Cụ thể, bệnh Alzheimer đã ảnh hưởng đến khoảng 47 triệu người vào năm 2015 và được dự báo sẽ tăng vọt lên 75 triệu người vào năm 2030, chạm ngưỡng 132 triệu người vào năm 2050. Cùng với đó, ung thư cướp đi sinh mạng của gần 10 triệu người mỗi năm trên toàn cầu. Các thuốc tân dược tổng hợp hiện nay dù mang lại hiệu quả điều trị nhanh nhưng thường tiềm ẩn nhiều tác dụng không mong muốn và độc tính tích lũy. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc sàng lọc và phát triển các hoạt chất sinh học tự nhiên an toàn từ nguồn dược liệu bản địa.

Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú với hơn 12.000 loài thực vật có mạch, trong đó có hơn 5.000 loài cây thuốc quý phân bố khắp cả nước. Chi Alphonsea thuộc họ Na (Annonaceae) gồm 38 loài trên thế giới, riêng tại Việt Nam ghi nhận 7 loài phân bố tại các vùng rừng nhiệt đới. Trong đó, loài Thâu lĩnh (Alphonsea tonkinensis A. DC.) mới chỉ được khảo sát sơ bộ về tinh dầu, hoàn toàn chưa có công bố chuyên sâu nào về thành phần hóa học alkaloid cũng như các hoạt tính dược lý thực nghiệm.

Luận văn tập trung giải quyết hai mục tiêu cốt lõi: chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất alkaloid từ cành và lá cây Thâu lĩnh; đồng thời đánh giá 4 hoạt tính sinh học in vitro gồm ức chế enzyme acetylcholinesterase, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư và kháng viêm. Mẫu nghiên cứu được thu hái chuẩn xác tại huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 07 năm 2017 và hoàn tất nghiệm thu thực nghiệm tại Trường Đại học Y Dược Huế cùng Viện Công nghệ Sinh học vào tháng 05 năm 2021. Công trình đã xử lý thành công 8,0 kg mẫu dược liệu thô, tìm ra hợp chất TB2 có hoạt tính kháng viêm vượt trội với nồng độ ức chế đạt 20,39 µM, khẳng định giá trị dược liệu to lớn của loài thực vật này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai cơ sở lý thuyết y sinh kinh điển. Thứ nhất là giả thuyết hệ Cholinergic trong cơ chế sinh bệnh Alzheimer do Whitehouse và cộng sự khởi xướng từ năm 1982. Giả thuyết này chứng minh sự thiếu hụt tới 90% chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine tại khe synape não bộ, khẳng định việc ức chế enzyme acetylcholinesterase là chìa khóa then chốt giúp kéo dài thời gian tồn tại của acetylcholine, từ đó phục hồi nhận thức. Thứ hai là lý thuyết về stress oxy hóa và chuỗi phản ứng viêm do các gốc tự do ROS, RNS và nitric oxide kích hoạt quá mức, gây tổn thương cấu trúc màng tế bào, đột biến acid nucleic và khởi phát quá trình sinh ung thư.

Mô hình nghiên cứu định hướng vào 4 khái niệm nền tảng:

• Nhóm hợp chất alkaloid khung protoberberine, chiếm khoảng 25% tổng số alkaloid tự nhiên, sở hữu khung phân tử 5,6-dihydrodibenzo quinolizinium có hoạt tính sinh học cao.
• Nồng độ ức chế 50% (IC50), chỉ số định lượng phản ánh hiệu lực của dịch chiết và chất tinh khiết.
• Hoạt tính gây độc chọn lọc trên hai dòng tế bào ung thư người gồm SK-LU-1 (ung thư phổi) và Hep G2 (ung thư gan).
• Hoạt tính kháng viêm thông qua cơ chế ức chế sản sinh nitric oxide trên đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi lipopolysaccharide.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu sử dụng tổng cộng 8,0 kg bột thô khô từ cành và lá cây Thâu lĩnh, qua ngâm chiết thu được 790 g cao toàn phần và 19,26 g cắn alkaloid toàn phần, phục vụ khảo sát 8 phân đoạn chiết và 8 hợp chất đơn lập. Phương pháp chọn mẫu là thu hái mẫu thực vật ngẫu nhiên có chủ đích tại quần thể tự nhiên huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị, được định danh thực vật học chính xác bởi chuyên gia phân loại.

Lý do lựa chọn hệ thống phương pháp phân tích:

• Phương pháp chiết lỏng - lỏng kết hợp chiết pha rắn: Cho phép phân tách chọn lọc alkaloid base ở pH 9 bằng amoniac sau khi đã tạo muối tan ở pH 1 bằng acid hydrochloric, tối ưu hóa độ tinh sạch của nhóm hoạt chất mục tiêu.
• Sắc ký cột pha thường và gel lọc Sephadex LH-20 kết hợp kết tinh phân đoạn: Lựa chọn tối ưu để tách các phân đoạn có độ phân cực gần nhau (hệ số Rf từ 0,2 đến 0,4), đảm bảo độ tinh khiết mẫu đo phổ đạt trên 95%.
• Xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (gồm 1H-NMR 500 MHz, 13C-NMR 125 MHz, HMBC, HSQC): Phương pháp tiêu chuẩn vàng giúp giải mã vị trí liên kết carbon, proton và nhóm chức một cách chuẩn xác tuyệt đối.
• Đánh giá hoạt tính in vitro: Áp dụng phương pháp đo quang Ellman ở bước sóng 405 nm xác định khả năng ức chế acetylcholinesterase, phương pháp DPPH ở bước sóng 517 nm đo khả năng trung hòa gốc tự do, phương pháp Sulforhodamine B ở bước sóng 515 nm đánh giá độc tế bào, và phản ứng Griess ở bước sóng 540 nm đo nồng độ nitrite. Hệ thống thử nghiệm này có độ nhạy cao, độ lặp lại 3 lần độc lập và tiêu tốn lượng mẫu thử rất nhỏ. Tiến trình thực nghiệm diễn ra liên tục từ tháng 07 năm 2017 đến tháng 05 năm 2021.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có đóng góp khoa học cao:

Thứ nhất, từ 1,34 g cắn phân đoạn chiết ethyl acetate - dichloromethane, nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc thành công 6,2 mg hợp chất alkaloid tinh khiết ký hiệu TB3 dạng bột màu vàng nhạt. Phân tích phổ NMR chứng minh TB3 là 8-oxopseudopalmatine (công thức danh pháp 2,3,10,11-tetramethoxy-5H-isoquinolino[3,2-a]isoquinolin-8(6H)-one), thuộc nhóm alkaloid protoberberine quý hiếm.

Thứ hai, về hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase, phân đoạn cắn alkaloid methanol thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 đạt 14,58 ± 0,33 µg/mL, cao toàn phần đạt 22,72 ± 0,57 µg/mL. Trong số các chất phân lập, pseudopalmatine (TB5) và pseudocolumbamine (TB6) ức chế mạnh enzyme này với IC50 lần lượt là 8,63 ± 0,13 µM và 18,87 ± 0,27 µM, tiếp cận chất chuẩn galantamine (IC50 là 1,01 ± 0,07 µM).

Thứ ba, phát hiện hoạt tính kháng viêm vượt trội của hợp chất TB2 (3-Hydroxy-7,8-dehydro-β-ionone) với giá trị IC50 ức chế sản sinh nitric oxide đạt 20,39 ± 0,44 µM trên tế bào RAW 264.7. Hoạt tính của TB2 mạnh hơn chất đối chứng dương tiêu chuẩn L-NMMA (IC50 là 24,97 ± 0,81 µM), tương đương mức hiệu quả cải thiện khoảng 18,34% so với chất chuẩn.

Thứ tư, về hoạt tính gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa, hợp chất TB3 thể hiện tác dụng gây độc trên dòng ung thư gan Hep G2 với IC50 đạt 42,47 ± 1,51 µM và ung thư phổi SK-LU-1 với IC50 đạt 58,26 ± 1,35 µM. Phân đoạn alkaloid tại pH 9 cho khả năng trung hòa gốc tự do DPPH tốt nhất với IC50 là 24,49 ± 0,98 µg/mL, và hợp chất TB4 (N-trans-feruloyltyramine) đạt IC50 là 61,25 ± 3,24 µM.

Thảo luận kết quả

Hiệu lực sinh học vượt trội của các phân đoạn và hợp chất từ cây Thâu lĩnh bắt nguồn từ đặc thù cấu trúc hóa học. Khung protoberberine chứa 4 nhóm thế methoxy tại các vị trí C-2, C-3, C-10, C-11 cùng cầu nối dị vòng chứa nitơ đóng vai trò quyết định trong việc liên kết với trung tâm hoạt động của enzyme acetylcholinesterase. Điều này lý giải tại sao phân đoạn cắn alkaloid methanol chứa hàm lượng cao các dẫn xuất này lại đạt hiệu lực ức chế cao gấp nhiều lần các phân đoạn kém phân cực. Đối với hợp chất TB2, cấu trúc chuỗi ionone gắn nhóm hydroxyl và liên kết đôi liên hợp mang lại khả năng ức chế tín hiệu kích hoạt nitric oxide synthase mạnh mẽ.

Khi đối chiếu với các công bố khoa học trong nước, nghiên cứu sàng lọc trên 30 cây thuốc miền Trung trước đây chỉ ghi nhận khoảng 10% số loài có dịch chiết đạt IC50 dưới 50 µg/mL đối với acetylcholinesterase. Với IC50 đạt 22,72 µg/mL ở dịch chiết toàn phần, Thâu lĩnh nằm trong nhóm thiểu số các dược liệu có tiềm năng ức chế enzyme cao nhất. Hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất N-trans-feruloyltyramine trong nghiên cứu này (IC50 quy đổi đạt 19,19 ± 1,02 µg/mL) cũng tương đồng chặt chẽ với các nghiên cứu quốc tế trên loài Liriope muscari (IC50 đạt 28,7 µg/mL).

Toàn bộ dữ liệu thực nghiệm được xử lý qua mô hình hồi quy tuyến tính trên phần mềm TableCurve 2Dv4. Kết quả nghiên cứu có thể được trực quan hóa rất hiệu quả thông qua biểu đồ đường cong ức chế Log C - %I biểu diễn tương quan liều lượng - đáp ứng, kết hợp biểu đồ cột so sánh giá trị IC50 đa biến giữa 8 phân đoạn chiết và bảng đối chiếu dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR, giúp làm nổi bật mối quan hệ mật thiết giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển hóa các kết quả nghiên cứu thành ứng dụng thực tiễn, tác giả đề xuất 4 nhóm giải pháp cụ thể:

Thứ nhất, chuẩn hóa và nâng cấp quy trình công nghệ chiết xuất alkaloid quy mô bán công nghiệp. Các viện nghiên cứu hóa dược cần chủ trì tối ưu hóa quá trình kiềm hóa bằng amoniac ở pH 9 kết hợp chiết hồi lưu dung môi xanh, đặt mục tiêu nâng hiệu suất thu hồi cắn alkaloid toàn phần từ 0,24% (19,26 g từ 8,0 kg nguyên liệu thô) lên tối thiểu 0,45% trong giai đoạn 2026 - 2027.

Thứ hai, mở rộng nghiên cứu đánh giá dược lý in vivo và độc tính bán trường diễn. Cần giao các cơ sở nghiên cứu dược lực học tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase và bảo vệ neuron thần kinh của hai hoạt chất TB5 (pseudopalmatine) và TB6 trên mô hình động vật thí nghiệm gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamine. Mục tiêu là xác lập thông số dược động học và chứng minh khả năng cải thiện 30% đến 40% chỉ số hành vi nhận thức trong khung thời gian 18 tháng.

Thứ ba, đẩy mạnh nghiên cứu bán tổng hợp và biến đổi cấu trúc dẫn xuất từ hợp chất TB2 (3-Hydroxy-7,8-dehydro-β-ionone). Nhóm nghiên cứu hóa dược cần thực hiện gắn thêm các nhóm chức ưa dầu để gia tăng hoạt tính kháng viêm hướng đích, phấn đấu hạ ngưỡng IC50 ức chế sản sinh nitric oxide xuống dưới 10 µM, hoàn thành giai đoạn sàng lọc tiền lâm sàng trước năm 2029.

Thứ tư, quy hoạch vùng trồng và bảo tồn nguồn gen dược liệu Thâu lĩnh bền vững. Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Quảng Trị phối hợp cùng các đơn vị lâm nghiệp địa phương triển khai đề án khoanh vùng bảo tồn tự nhiên và di thực nhân giống cây Thâu lĩnh theo tiêu chuẩn GACP-WHO với quy mô ban đầu 5 hecta tại huyện Đakrông vào năm 2027, đảm bảo chủ động nguồn cung nguyên liệu sạch cho công nghiệp chiết xuất.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình luận văn là nguồn tài liệu học thuật giá trị cao cho 4 nhóm đối tượng sau:

Nhóm thứ nhất là các nhà khoa học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược học và Hóa thực vật. Tài liệu cung cấp quy trình chiết tách chi tiết, dữ liệu giải phổ 1D và 2D NMR hoàn chỉnh của hợp chất 8-oxopseudopalmatine và phương pháp tiếp cận sàng lọc 4 hoạt tính sinh học in vitro, hỗ trợ đắc lực cho các đề tài phân lập hợp chất tự nhiên mới.

Nhóm thứ hai là bộ phận nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Doanh nghiệp có thể ứng dụng trực tiếp các số liệu về hoạt tính kháng viêm vượt trội của TB2 (mạnh hơn L-NMMA khoảng 18,34%) và hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của TB5, TB6 để thiết kế công thức các sản phẩm hỗ trợ điều trị viêm mãn tính và cải thiện trí nhớ.

Nhóm thứ ba là giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Dược, Y học cổ truyền và Công nghệ Sinh học. Luận văn đóng vai trò là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, kỹ thuật sắc ký cột lọc gel Sephadex LH-20, quy trình đo quang ELISA 96 giếng và kỹ thuật xử lý số liệu IC50 qua phần mềm TableCurve 2Dv4.

Nhóm thứ tư là các cơ quan quản lý y tế, trung tâm kiểm nghiệm và tổ chức bảo tồn tài nguyên sinh vật. Các cấp quản lý có cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy để thẩm định giá trị nguồn gen cây thuốc chi Alphonsea, phục vụ chính sách bảo tồn đa dạng sinh học trong tổng thể hơn 5.000 loài cây thuốc tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Cây Thâu lĩnh có đặc điểm hình thái và phân bố tự nhiên như thế nào? Thâu lĩnh là loài cây gỗ nhỏ, chiều cao trung bình từ 7 đến 8 m, thân cành mảnh nhẵn. Phiến lá thon dài 10 đến 13 cm với 10 đến 11 đôi gân bên. Hoa màu vàng nhạt mọc đối diện lá, nở vào tháng 3 đến tháng 4 và cho quả từ tháng 5 đến tháng 7. Mẫu nghiên cứu được thu thập chuẩn xác tại huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 07 năm 2017.

Hợp chất nào trong cây Thâu lĩnh có tác dụng kháng viêm mạnh nhất? Hợp chất 3-Hydroxy-7,8-dehydro-β-ionone (ký hiệu TB2) thể hiện hoạt tính kháng viêm xuất sắc nhất thông qua ức chế sản sinh nitric oxide trên đại thực bào RAW 264.7 với giá trị IC50 đạt 20,39 ± 0,44 µM. Mức ức chế này vượt trội hơn cả chất đối chứng dương L-NMMA đạt IC50 là 24,97 ± 0,81 µM, cho thấy tiềm năng ứng dụng rất cao.

Ý nghĩa của hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase từ cây Thâu lĩnh là gì? Bệnh Alzheimer gắn liền với sự thiếu hụt tới 90% nồng độ chất dẫn truyền acetylcholine tại não bộ. Hoạt chất pseudopalmatine (IC50 là 8,63 µM) và pseudocolumbamine (IC50 là 18,87 µM) từ phân đoạn alkaloid methanol của Thâu lĩnh có khả năng ức chế mạnh enzyme acetylcholinesterase, mở ra hướng phát triển các liệu pháp tự nhiên giúp ngăn chặn suy giảm nhận thức.

Cấu trúc của hợp chất 8-oxopseudopalmatine được xác định dựa trên những phương pháp nào? Cấu trúc của 8-oxopseudopalmatine (TB3, khối lượng 6,2 mg) được chứng minh chính xác nhờ hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân gồm 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và các phổ tương tác 2 chiều HMBC, HSQC. Dữ liệu phổ chỉ rõ sự hiện diện của khung protoberberine mang 4 nhóm methoxy và một liên kết carbonyl đặc trưng tại carbon C-8 ở độ dịch chuyển 163,5 ppm.

Ưu điểm nổi bật của các phương pháp thử nghiệm in vitro trong luận văn là gì? Các phương pháp đo quang Ellman ở bước sóng 405 nm và thử nghiệm DPPH ở 517 nm cho phép đo đạc đồng thời trên phiến 96 giếng với thể tích phản ứng chỉ từ 200 đến 400 µL. Kỹ thuật này có độ nhạy vượt trội, đảm bảo độ lặp lại chính xác qua 3 lần thử nghiệm và tiết kiệm chi phí tối đa so với các thử nghiệm trên động vật.

Kết luận

• Luận văn đã chiết xuất thành công 790 g cao toàn phần và 19,26 g cắn alkaloid từ 8,0 kg cành lá cây Thâu lĩnh thu hái tại tỉnh Quảng Trị.
• Phân lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh hợp chất alkaloid protoberberine quý 8-oxopseudopalmatine (TB3) cùng 7 hợp chất liên quan.
• Chứng minh phân đoạn cắn alkaloid methanol (IC50 đạt 14,58 µg/mL) và hợp chất pseudopalmatine (IC50 đạt 8,63 µM) có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase vượt trội.
• Phát hiện hợp chất TB2 sở hữu hoạt tính kháng viêm mạnh mẽ với IC50 đạt 20,39 µM, vượt qua chất chuẩn đối chứng dương L-NMMA.
• Khẳng định hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan Hep G2 của TB3 (IC50 đạt 42,47 µM) và hoạt tính chống oxy hóa mạnh của phân đoạn alkaloid pH 9 (IC50 đạt 24,49 µg/mL).

Công trình là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới công bố toàn diện về thành phần hóa học alkaloid và 4 tác dụng dược lý in vitro của loài Thâu lĩnh, làm phong phú thêm kho tàng tri thức về chi Alphonsea. Kế hoạch tiếp theo trong giai đoạn 2026 - 2028 sẽ tập trung tối ưu hóa công nghệ chiết xuất, thử nghiệm dược lý in vivo và đánh giá độc tính bán trường diễn. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm vui lòng liên hệ Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế để khai thác toàn văn công trình và hợp tác phát triển nguồn dược liệu tiềm năng này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, y học có nhiều tiến bộ vượt bậc, nhưng bên cạnh đó, tỷ lệ người mắc các bệnh mãn tính như ung thư, tim mạch, Alzheimer, tiểu đường,… ngày càng gia tăng và có xu hướng trẻ hóa. Các thuốc tân dược sản xuất từ các hóa chất thông qua tổng hợp hoặc bán tổng hợp sử dụng trong điều trị cho tác dụng nhanh, hiệu quả điều trị cao nhưng kèm theo đó là các tác dụng phụ và gây độc đối với cơ thể. Từ xưa, nguồn thực vật đã đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người. Các hợp chất tự nhiên là nguồn thành công nhất trong việc khám phá ra các loại thuốc mới [35].

Liên hệ thực tiễn, Việt Nam có hệ thực vật phát triển phong phú và đa dạng với hơn 12000 loài thực vật có mạch, trong đó có hơn 5000 loài thực vật dùng làm thuốc được phân bố rộng khắp cả nước [7]. Đây chính là nguồn tài nguyên tiềm năng và cũng là động lực thúc đẩy việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt từ dược liệu. Mặc dù có nhiều hướng tiếp cận vấn đề nghiên cứu khác nhau nhưng quá trình nghiên cứu thường bắt đầu bằng việc đánh giá một số lượng lớn các mẫu dược liệu hoặc hoạt chất. Giai đoạn này gọi là giai đoạn nghiên cứu sàng lọc.

Một thuốc mới ra đời phải trải qua nhiều giai đoạn, gian nan, tốn nhiều thời gian và chi phí. Quá trình nghiên cứu sàng lọc sẽ loại bỏ các mẫu không có giá trị thực sự, tuyển chọn các mẫu tiềm năng, giúp tiết kiệm thời gian và tiền bạc trong các quá trình nghiên cứu tiếp theo. Chi Alphonsea là một chi nhỏ thuộc họ Na (Annonaceae), phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, khu vực Indo-Malay, Việt Nam, Lào và một số nước khác. Các hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc của chi này chủ yếu là alkaloid, ngoài ra còn có các nhóm chất như steroid, lignan, terpenoid [15].

Một số nghiên cứu cho thấy một số dịch chiết hay những hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Alphonsea có hoạt tính sinh học tốt như chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và kháng kí sinh trùng [25], [36], [42], [44]. Như vậy, có thể thấy 2 chi Alphonsea có tiềm năng cho những nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất mới có tác dụng sinh học nhằm định hướng phát triển các sản phẩm góp phần chăm sóc sức khỏe con người sau này. Loài Thâu lĩnh Alphonsea toninensis A., cho đến nay chỉ mới được nghiên cứu về thành phần tinh dầu của lá, thân và một số thành phần hóa học. Ngoài ra chưa tìm được các nghiên cứu nào về hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam cũng như trên thế giới.

Nhận thấy tiềm năng cũng như muốn đóng góp vào nền tri thức tự nhiên, chúng tôi đề xuất nghiên cứu đề tài với mục tiêu: 1. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất alkaloid từ cây Thâu lĩnh (Alphonsea toninensis A. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của cây Thâu lĩnh: tác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng gây độc tế bào ung thư và tác dụng kháng viêm. Tổng quan về chi Alphonsea 1.

Vị trí phân loại và phân bố Chi Alphonsea là chi nhỏ thuộc họ Na (Annonaceae), bộ Ngọc Lan (Magnoliales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [4]. Được phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và khu vực Indo-Malay, một số khác phân bố ở Ấn Độ, Sri Lanka, Myanmar, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia,… [15]. Theo The Plant List, WCSP (World Checklist Of Selected Plant Families) đã công bố chi Alphonsea có 38 loài [53]. Trong đó, có 7 loài phân bố ở Việt Nam là A.

Các loài này phân bố chủ yếu ở một số tỉnh như Lào Cai, Ninh Bình, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum,… [1]. Đặc điểm thực vật Các cây trong chi Alphonsea thường là những cây bụi hoặc cây nhỏ, có chiều cao trung bình với lá xen kẽ, không có lá kèm. Lá thường nhẵn, đôi khi có lông. Hoa lưỡng tính, đơn độc hoặc mọc thành cụm hoa, cuống lá ngắn.

Lá đài 3, mở bằng mảnh vỏ (xếp van) khi ở trong nụ. Cánh hoa 6, mọc thành 2 vòng. Nhị hoa nhiều số lượng thay đổi từ 15-60. Bao phấn hướng ngoài, hạt phấn gần hình cầu.

Noãn xếp thành 2 hàng, hình dạng có thể là hình trứng, hình cầu, hoặc hình trụ. Lá noãn rời; trên mỗi lá noãn, mọc thành 2 loạt; vòi nhụy hình trụ, ngắn; đầu nhụy hình đầu khó thấy, với một khe nứt xuống phía dưới ở mặt trong [1], [28]. Thành phần hóa học Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Alphonsea. Thành phần hóa học phân lập được từ chi này chủ yếu là alkaloid, ngoài ra còn có steroid, lignan, terpenoid [15].

Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Alphonsea Nhóm Loài Hoạt chất TLTK hợp chất Liriodenine; oxostephanine; [15], [50] A. mollis mollisine; 2,6-dimethoxy-5- hydroxy onychine Liriodenine; cyathocaline; [15], [51] A. monogyma isooncodine; darienine; 6,7- dimethoxy-5-hydroxy onychine A. ventricosa Glaucine; nor-glaucine [15], [32] Liriodenine; anonaine; isoboldine; [15], [43] ushinsunine; norushinsunine; stepharine; stepholidine; A.

sclerocarpa candicine; magnoflorine; Alkaloid laurotetanine; phenethyltrimethylammonium; crotsparine. cylindrica King N-methylouregidione; lysicamine; isoursuline; cyathocaline; O- methylmoschatoline; isooncodine. elliptica cepharadione A; kinabaline; N-methylouregidione. stigmasta-4, 6, 22-trien-3-one; [15] A.

curtisii stigmast-22-ene-3,6-dione; Steroid stigmast-22-ene-3-one A. cylindrica King stigmasterol [16] Conocarpan; (2R,3R)-2,3-dihydro- [15] Lignan A. mollis 2-(4-hydroxy methoxyphenyl)-3- methyl-5-(E)-propenylbenzofuran Bicyclogermacrene; β-pinene [15], [45] bicycloelemene; β-caryophyllen; A. philastreana (E)-β-ocimene, γ-eudesmol; guaiol; α-humulene; (E)- Terpenoid bocimene.

gaudichaudiana viridiflorol; bicyclogermacrene; γ-eudesmol; guaiol; (E)-β-ocimene 5 R1 = OCH3, R2 = OH, R3 = H: 2,6- dimethoxy-5-hydroxy onychine R1 = H, R2 = OH, R3 = OCH3: 6,7- R1= OCH3, R2= OCH3, R3= R1= H, R2= H: Liriodenine dimethoxy-5-hydroxy onychine OCH3: O-methylmoschatoline R1= OCH3, R2= H: R1 = H, R2 = OH, R3 = OH: R1= OCH3, R2= OCH3, R3=H: Oxostephanine Cyathocaline Lysicamine R1= OCH3, R2= OCH3: R1 = H, R2 = H, R3 = OH: Issoncodine R1R2= -OCH2O-, R3= OCH3: R1 = H, R2 = OCH3, R3 = OH: Mollisine Darienine Atherospermidine Kareemine Crebanine R1= H, R2= H, R3= H, R4= H: Sarsiflorine R= CH3: Glaucine Magnoforine R1= H, R2= OH, R3= CH3, R4= CH3: R= H: Norglaucine Laurotetanine R1= CH3, R2= OH, R3= CH3, R4= H: Isoboldine Hình 1. Công thức hóa học của một số alkaloid được phân lập từ chi Alphonsea Stigmasta-4,6,22-trien-3-one Stigmast-22-en-3,6-dione Stigmast-22-en-3-dione Hình 1. Công thức hóa học một số steroid phân lập từ chi Alphonsea 6 (2R,3R)-2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-3-methyl-5-(E)-propenylbenzofuran Conocarpan Hình 1. Công thức hóa học hai neolignan được phân lập từ chi Alphonsea Bicyclogermacren Guaiol γ-eudesmol α-humulen (E)-β-ocimen β-pinen Bicycloelemen Hình 1.

Công thức hóa học của một số terpenoid được phân lập từ chi Alphonsea 1. Hoạt tính sinh học Một số nghiên cứu đã chỉ ra các hoạt tính sinh học có giá trị của các loài thuộc chi Alphonsea như: gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng kí sinh trùng [25], [36], [42], [44]. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hợp chất crebanine chiết xuất từ A. sclerocarpa có hoạt tính gây độc tế bào nguyên tủy ở người K562 [42].

Một nghiên cứu khác cho thấy rằng, các chất được phân lập từ các dịch chiết của vỏ của A. Hoạt tính chống oxy hóa Hợp chất crebanine được phân lập từ loài A. sclerocarpa được thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH và phương pháp khử ion sắt III (FRAP). Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của crebanine mạnh hơn so với đối chứng dương là ascorbic acid [42].

7 Nghiên cứu khác về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ dịch chiết của vỏ A. cylindrica bằng phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH, kết quả cho thấy các hợp chất: iraqiine, kareemine, muniranine, kinabaline, O- methylmoschatoline và N-methylouregidione có tác dụng chống oxi hóa, giá trị IC50 lần lượt là 48,8  1,0; 101,7  1,5; 44,5  1,1; 64,3  0,9; 144,2  1,2; 94,3  0,8 μg/mL [11]. Hoạt tính kháng viêm Nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm của dịch chiết MeOH loài A. javanica trên dòng tế bào RAW 264.7 bằng phương pháp NF-κB và MTT cho thấy, dịch chiết có khả năng kháng viêm bằng cách giảm sản xuất NO do LPS, giảm phosphoryl hóa IκB, giảm biểu hiện của iNOS và COX-2.

Ngoài ra, khi sử dụng kĩ thuật qPCR cho thấy sự giảm đáng kể của 8 cytokin/enzyme gây viêm gồm COX-2, iNOS, IP-10, IL- 1, MCP-1, GCS-F, IL-6, IFN- [25]. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm Hai chất lysicamine và O-methylmoschatoline phân lập từ vỏ cây A. cylindrica King đã cho kết quả kháng lại ba loài vi khuẩn là Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus cereus [44]. Dịch chiết từ lá của A.

sclerocarpa Thaw cho tác dụng kháng khuẩn trên 4 chủng vi khuẩn gram dương là Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans và 4 chủng gram âm là Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris. Kết quả cho thấy giá trị đường kính vùng ức chế của các dịch chiết đều nhỏ hơn đối chứng dương là streptomycin. Ngoài ra, các dịch chiết ấy còn cho hoạt tính kháng nấm trên năm chủng nấm Aspergillus brasiliensis, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus solani và Candida albicans. Kết quả là các dịch chiết có khả năng ức chế nấm mạnh hơn so với đối chứng dương sử dụng là fluconazol [19].

Hoạt tính kháng kí sinh trùng Trong thử nghiệm in vitro dịch chiết MeOH của lá và thân cây A. maingayii đã được chứng minh hoạt tính kháng Trypanosoma brucei cruzi gây bệnh Chagas với IC50 > 12,5 ppm [36]. Nhìn chung, nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Alphonsea vẫn còn hạn chế. Tổng quan về loài Thâu lĩnh (Alphonsea tonkinensis A.

Phân loại Alphonsea tonkinensis A. có tên Việt Nam là Thâu lĩnh hay còn gọi khác là an phong Bắc Bộ, thuộc chi Alphonsea, họ Na (Annonaceae). Phân bố chủ yếu ở bán đảo Đông Dương. Loài này có 2 phân loài là Alphonsea tonkinensis var.

tonkinensis và Alphonsea tonkinensis var. Đặc điểm thực vật Thâu lĩnh là cây gỗ nhỏ, cao 7-8 m, nhánh mảnh, không lông. Lá mỏng, nhẵn có phiến thon, dài 10-13 cm, gân bên 10-11 đôi, mờ nhưng hơi nổi ở cả hai mặt, cách mép chừng 3 mm, cuống lá dài 3-4 mm. Hoa màu vàng, mọc đơn độc hoặc thành từng cặp, đối diện với lá, cụm hoa dài 3-5 mm mang lá bắc nhỏ, cuống hoa dài 3-7 mm, gần như nhẵn, lá đài hình tam giác, nhỏ, mặt ngoài có lông, cánh hoa hơi nhọn, có túi ở đáy, noãn 11-12, hơi có eo, hạt nhiều, xếp thành hai hàng có vảy, lông màu nâu đỏ.

Cây ra hoa tháng 3-4, có quả vào tháng 5-7 [28]. Thành phần hóa học Cho đến nay, có rất ít nghiên cứu về thành phần của cây A. Chỉ mới có nghiên cứu về thành phần tinh dầu của nhóm tác giả Nguyễn Viết Hùng.