CHƯƠNG 1. Cấu trúc bông lúa 1.1 Cấu trúc bông và sự hình thành bông từ các mô phân sinh Cấu trúc bông lúa là một trong những tính trạng hình thái quan trọng quyết định tiềm năng năng suất, được chọn lọc qua quá trình thuần hóa. Bông lúa là một cấu trúc dạng nhánh, bao gồm một trục chính, các gié sơ cấp mọc ra từ trục chính, sau đó là các gié bậc cao hơn (gié thứ cấp, tam cấp, tứ cấp) và cuối cùng là hoa, mọc trực tiếp trên các gié (Hình 1A). Số lượng hoa quyết định số lượng hạt trên bông, trực tiếp ảnh hưởng đến năng suất cây trồng.
Quá trình phân nhánh bông phụ thuộc vào hoạt động của các tế bào gốc chồi nách trong suốt giai đoạn hình thành và phát triển sớm của bông. Cấu trúc bông lúa rất đa dạng, không chỉ trong cùng loài (giữa giống thuần và giống hoang dại) mà còn giữa các loài khác nhau (lúa châu á và lúa châu phi). Cấu trúc bông lúa ở các loài thuần chủng thay đổi từ dạng bông nhỏ, chỉ có một vài gié sơ cấp và gié thứ cấp, mang ít hạt đến dạng bông to, phân nhánh nhiều và mang nhiều hạt hơn so với các loài tổ tiên (Hình 1B) [46]. Cấu trúc bông lúa (A) và sự thay đổi qua quá trình thuần hóa (B) [46] n: Số hạt trên bông Bông lúa là kết quả quá trình hoạt động của các mô phân sinh, chúng được hình thành và biệt hóa liên tục trong quá trình phát triển của cây [24].
Sự hình thành bông lúa non được chia thành hai giai đoạn: Giai đoạn sớm là sự hình thành và kéo 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Thị Như – K26CH dài của mô phân sinh trục (Hình 2A), hình thành các mô phân sinh gié sơ cấp (Hình 2B), kéo dài các mô phân sinh gié sơ cấp, hình thành các mô phân sinh gié cấp cao hơn (Hình 2C). Giai đoạn muộn là sự hình thành mô phân sinh hoa (Hình 2D), sự biệt hóa tạo thành các bộ phận của hoa và sự phát triển của chúng cũng được quan sát ở giai đoạn này (Hình 2E). Các giai đoạn hình thành bông lúa non [40] A : Giai đoạn phát sinh mô phân sinh trục bông, B : Hình thành và kéo dài mô phân sinh gié sơ cấp, C : Kéo dài gié sơ cấp và hình thành gié thứ cấp, D : Hình thành hoa, E : Sự biệt hóa các cơ quan sinh sản của hoa. RM : mô phân sinh trục ; PBm : mô phân sinh gié sơ cấp ; AM : mô phân sinh gié thứ cấp ; PB : Gié sơ cấp ; Sp : spikelet (cụm hoa) ; Fl : hoa.2 Các nghiên cứu về cơ sở di truyền kiểm soát cấu trúc bông lúa Sự phát triển của bông lúa phụ thuộc vào hoạt động của cả mô phân sinh trục (rachis meristem) và mô phân sinh gié (branch meristem), chúng được kiểm soát bởi mạng lưới nhiều gen khác nhau.
Ngày nay, một số gen đã được mô tả tham gia vào việc kiểm soát quá trình phát triển của bông lúa (Hình 3). 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Thị Như – K26CH Hình 3. Tương tác di truyền kiểm soát sự phát triển bông lúa [17] Theo đó, các gen kiểm soát hoạt động của các mô phân sinh trong thời gian biệt hóa hình thành cơ quan sinh sản ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bông. Một số yếu tố tham gia vào quá trình chuyển đổi và hình thành các mô phân sinh của cụm hoa đã được nghiên cứu ở Arabidopsis, chức năng của một số gen tương đồng cũng được phát hiện khi tiến hành nghiên cứu so sánh trình tự ở lúa.
Các nhà khoa học đã mô tả hai trong số bốn gen RICE CENTRORADIALIS ở lúa (RCN1, RCN2) liên quan đến sự biệt hóa từ mô phân sinh ghé sơ cấp thành mô phân sinh gié thứ cấp (Hình 3). Trong đó, khi tăng cường biểu hiện RCN1, RCN2 sẽ thúc đẩy sự hình thành các mô phân sinh gié thứ cấp, kéo theo sự tăng cường số lượng gié thứ cấp ở bông [33]. Thông qua phân tích các đột biến, gen LAX PANICLE 1( LAX1) đã được chứng minh là cần thiết cho sự hình thành và duy trì các mô phân sinh gié, việc giảm biểu hiện LAX1 sẽ làm giảm số lượng gié sơ cấp của bông. Đồng thời, gen LAX1 cũng hoạt động như một gen nhận dạng mô phân sinh hoa [21].
TAWAWA1 (TAW1) được mô tả tham gia vào quá trình điều chỉnh cấu trúc bông bằng cách ức chế sự chuyển đổi từ mô phân sinh gié sang mô phân sinh hoa. TAW1 được đánh giá có thể hoạt động như một yếu tố phiên mã trong việc thúc đẩy các hoạt động của mô phân sinh gié và hạn chế sự chuyển đổi sang mô phân sinh hoa từ đó làm tăng số lượng hoa trên bông [45]. APO1 và APO2 (ABERRANT PANICLE ORGANIZATION) là các yếu tố điều hòa chính ở bông lúa, các cây đột biến mất chức năng các gen này có cụm hoa nhỏ, ít nhánh do mô phân sinh gié sớm chuyển thành mô phân sinh hoa [18]. LONELY GUY (LOG) mã hóa một loại enzyme liên 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Thị Như – K26CH quan đến cân bằng cytokinin nội sinh, đóng vai trò quan trọng quyết định số lượng gié trên bông, tăng cường biểu hiện LOG có thể làm tăng số lượng gié sơ cấp [23].
Gen LEAFY HULL STERILE1 (LHS1) mã hóa một yếu tố phiên mã họ MADS liên quan đến sự phát triển của các bộ phận của hoa cũng như kiểm soát thời kỳ ra hoa, ức chế biểu hiện của gen này có thể làm tăng số lượng hoa trên bông [20]. Các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng số lượng gié sơ cấp và thứ cấp của bông được kiểm soát tích cực bởi một alen của DEP1 (DENSE AND ERECT PANICLE 1) [16].2 Phương pháp phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS), công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cơ sở di truyền của các tính trạng nông học Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, sự ra đời của các thế hệ giải trình tự mới đã tạo điều kiện cho hàng loạt dự án giải trình tự các giống lúa khác nhau trên thế giới (như dự án giải trình tự 3000 giống lúa (3K RGP, 2014), dự án đánh giá di truyền của tập đoàn 1568 giống lúa bản địa với 700000 SNPs (HDRA SNP) [29], cung cấp cơ hội tuyệt vời cho các phân tích liên kết trên toàn hệ gen (GWAS). GWAS trở thành công cụ mạnh mẽ trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền, đặc biệt là ở những tính trạng nông học phức tạp như cấu trúc bông, do nó so sánh đồng thời ảnh hưởng của nhiều alen lên tính trạng quan tâm trên một số lượng lớn các giống trong tập đoàn. Nguyên tắc cơ bản của GWAS liên quan đến việc xác định alen liên kết với nhiều SNP khác nhau trong mỗi một nghiên cứu, và thống kê so sánh để xác định SNP hoặc gen liên kết với một đặc điểm cụ thể.
Các phân tích GWAS trên tính trạng cấu trúc bông được tiến hành hàng loạt trong một vài năm gần đây. Nhiều QTL liên quan đến các tính trạng năng suất như số gié sơ cấp trên bông, số gié thứ cấp trên bông, chiều dài trục bông, số hạt/bông đã được tìm thấy, trong đó một số locus chứa các gen đã được biết ảnh hưởng tới cấu trúc bông [1, 7, 27, 39, 44]. Năm 2018, Tạ Kim Nhung và cộng sự xác định được một QTL (quantitative trait locus) hoàn toàn mới (QTL9) thông qua phân tích GWAS các tính trạng năng suất của một tập đoàn 159 giống lúa bản địa Việt Nam [41]. QTL9 liên kết với 2 tính trạng quan trọng quyết định trực tiếp đến năng suất: số gié thứ cấp/bông và số hoa/bông.
Vùng QTL9 có kích thước 780 kb, 137 gen được tìm thấy nhưng chưa có 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Thị Như – K26CH gen nào được nghiên cứu chức năng. Bằng phân tích tin sinh các cơ sử dữ liệu sẵn có trên internet, 11 gen ứng cử viên đã được sàng lọc để đánh giá biểu hiện ở 2 nhóm lúa (haplotype) có cấu trúc bông tương phản (bông to: 47 gié thứ cấp, 240 hoa/ bông và bông nhỏ: 30 gié thứ cấp, 150 hoa/ bông). Trong đó, 2 gen mã hóa protein chứa miền ankyrin (đặt tên là ANK1 và ANK2) có biểu hiện trái ngược nhau ở 2 haplotype. Gen ANK1 biểu hiện mạnh hơn ở nhóm lúa bông to trong khi biểu hiện của gen ANK2 cao hơn ở nhóm lúa bông nhỏ (dữ liệu chưa công bố) (Hình 4).
Bên cạnh đó, phân tích trình tự các gen này đã tìm thấy các SNPs, InDels ở 2 haplotype. Những kết quả thu được cho thấy tiềm năng của 2 gen ANK1 và ANK2 liên quan đến cấu trúc bông lúa, trong đó gen ANK1 đóng vai trò như một yếu tố làm tăng cường khả năng phân nhánh của bông, còn gen ANK2 có tác động ngược lại gây ức chế quá trình này. Phân tích chức năng của gen ANK1, ANK2 sẽ giúp làm sáng tỏ vai trò của chúng liên quan đến cấu trúc bông lúa (Hình 4). Biểu hiện của ANK1, ANK2 ở hai nhóm lúa có cấu trúc bông tương phản Màu xám: Biểu hiện gen giai đoạn sớm, Màu đỏ: Biểu hiện gen giai đoạn muộn.
a, b, c, d thể hiệ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%.3 Tổng quan về motif ankyrin (ANK), cấu trúc gen ANK1, ANK2 ở lúa 1.1 Motif ankyrin Motif ankyrin (ANK) là một trong những motif protein được bảo tồn và phân bố đa dạng nhất trong các loài sinh vật, từ virus đến người [37]. Mỗi motif ANK bao gồm từ 30-33 axit amin tạo thành hai vòng xoắn alpha song song và được nối 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lê Thị Như – K26CH với nhau bởi các vòng cầu hoặc cấu trúc kẹp tóc. Hầu hết protein ANK chứa hai đến sáu motif ANK lặp lại, số lần lặp lại lớn nhất được biết đến là 34 được dự đoán cho một protein từ Giardia lamblia [10]. Các protein tín hiệu Swi6/Cdc10 và Notch là các protein ANK đầu tiên được phát hiện từ nấm men và Drosophila [2].
ANK giữ vai trò trung gian trong tương tác protein-protein của tế bào nhưng chúng thường không nhận ra bất kỳ chuỗi axit amin hoặc cấu trúc cụ thể nào, thay vào đó, chúng tạo thành một bề mặt dài, kích thước khác nhau tùy thuộc vào số lần lặp lại, do đó tính đặc hiệu phụ thuộc vào số lượng motif ankyrin trong protein [31]. Ở người và động vật, protein ANK có ý nghĩa quan trọng và vai trò sinh học đa dạng. Chúng tham gia vào kiểm soát con đường sống sót của tế bào [30], điều hòa phiên mã [5].