CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 3 Tổng quan tài liệu 1. Protein caspase-9 Caspase là tên viết tắt của protease caspase cysteine (enzyme protease dạng cysteine-aspartic) là một họ của cysteine proteases có tính đặc hiệu đối với các gốc acid aspartic, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chết rụng tế bào, hoại tử và sưng viêm.
Trong cơ thể người, đã có 12 loại caspase được nhận diện và chia làm 2 nhóm chính: caspase khởi phát và caspase hành quyết. Trong đó, caspase‐9 thuộc nhóm caspase khởi phát và có vai trò quan trọng trong con đường apoptosis qua trung gian ty thể (Chou và cs, 2000). Khái niệm Protein caspase-9 có kích thước khoảng 46 kDa, là thành viên thuộc caspase, được mã hóa từ gene CASP9, chịu trách nhiệm phân cắt protein tại các đuôi chứa aspartate cụ thể, liên quan đến quá trình apoptosis và tín hiệu cytokine. Trong tế bào, caspase-9 tồn tại ở dạng procaspase không hoạt động (zymogen) và chỉ được kích hoạt khi được cảm ứng dimer hóa bởi các yếu tố phụ trợ khác (Bratton & Salvesen, 2010), đơn cử là Apaf-1 được kích hoạt trong apoptosome (Sharon và cs, 2009).
Khi được kích hoạt, caspase-9 bắt đầu phân tách caspase-3 và caspase-7 bằng cách phân giải protein. Sau khi phân tách, caspase-3 và caspase-7 có hoạt tính và bắt đầu quá trình apoptosis (Chao và cs, 2005). Protein caspase-9 Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 4 Tổng quan tài liệu Caspase-9 có chức năng quan trọng là chuyển đổi tín hiệu tử vong thành sự kiện phân giải protein đầu tiên và trực tiếp làm trung gian kích hoạt protease hành quyết gây apoptosis tế bào, nên việc điều khiển, kiểm soát caspase-9, là một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn cho cả tăng sinh và thoái hóa bệnh tật (Li và cs, 2017).
Caspase-9 tồn tại chủ yếu ở trạng thái đơn phân không hoạt động trong tế bào và các phương pháp đơn giản để kiểm soát quá trình dimer hóa caspase-9 độc lập với apoptosome là không có. Hạn chế này gây trở ngại rất lớn trong việc kiểm soát quá trình dimer hóa caspase‐9 (T. Cấu trúc caspase 9 Trong tế bào, caspase-9 tồn tại chủ yếu dưới dạng procaspase-9, được chia làm 2 vùng: vùng adaptor và vùng xúc tác. Vùng adaptor hay còn được gọi là vùng prodomain nằm tại đầu N, sở hữu một prodomain dài, có chứa miền kích hoạt và tuyển chọn caspase (CARD), thông qua đó, caspase-9 được tuyển chọn và kích hoạt ở nền tảng đa protein (Kuida, 2000).
Tại vùng adaptor, miền CARD này có thể liên kết chọn lọc với CARD của Apaf-1 thông qua và neo giữ caspase-9 vào apoptosome (Huber và cs, 2018). Sau khi liên kết với Apaf-1, caspase-9 tự động xử lý và trở thành một protein có hoạt tính (Li và cs, 2017). Tương tác của caspase-9 với apoptosome là một trong những tính năng độc đáo quan trọng nhất của caspase này (Huber và cs, 2018). Procaspase-9 có hoạt tính xúc tác cao khi liên kết với apoptosome.
Không giống như các caspase khởi phát khác, bao gồm caspases-2, -8 và -10, vùng prodomain của caspase-9 không bị loại bỏ trong quá trình apoptosis (Bratton & Salvesen, 2010) Vùng xúc tác được chia thành hai tiểu đơn vị: một tiểu đơn vị lớn có kích thước khoảng 20 kDa và một tiểu đơn vị nhỏ có kích thước khoảng 10 kDa (Kuida, 2000). Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 5 Tổng quan tài liệu Vùng prodomain được liên kết với miền xúc tác bao gồm tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ thông qua một liên kết loop (linker loop). Hoạt động của caspase-9 được kích thích bởi sự dimer hóa thay vì phân cắt, có thể là do liên kết loop dài giữa các tiểu đơn vị (Li và cs, 2017).
Thật thú vị khi một sự khác biệt đáng chú ý khác giữa caspase-9 và caspase khởi phát khác, cũng như caspases hành quyết là độ dài của liên kết loop. Trong hầu hết các caspase, liên kết này phải được phân tách để cho phép các thay đổi cấu trúc cần thiết cho việc hình thành vị trí hoạt động. Tuy nhiên, trong caspase-9, liên kết này đặc biệt dài, nên khi caspase-9 được tuyển chọn và dimer hóa trong apoptosome, liên kết loop được dự đoán sẽ di chuyển và cho phép bám vào vị trí hoạt động mà không có sự phân tách (Bratton & Salvesen, 2010). Cấu trúc caspase-9 Thông qua tương tác dimer, các procaspase-9 tương tác với nhau để tạo thành caspase-9 có hoạt tính (Li và cs, 2017).
Ngoài ra, không giống như các caspase khác có vùng trình tự bảo tồn là pentapeptide QACRG, Caspase-9 mang vùng trình tự QACGG (Kuida, 2000). Nghiên cứu của Keisuke Kuida cùng các cộng sự, đã chứng tỏ chức năng caspase-9 rất cần thiết cho quá trình apoptosis. Cụ thể, nhóm ông tiến hành tạo đột biến gây mất caspase-9 ở chuột nhờ phương pháp nhắm gene mục tiêu. Nhóm tác giả báo cáo rằng phần lớn những con chuột đột biến đồng hợp tử chết trong giai đoạn chu sinh do não bị dị tật.
Nguyên nhân là do giảm quá trình apoptosis ở giai đoạn phát triển não (Kuida và cs, 1998). Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 6 Tổng quan tài liệu 1. Cơ chế hoạt động Cơ chế hoạt động của caspase-9 được thể hiện qua Hình 1.
Cơ chế hoạt động của protein caspase-9 Trong điều kiện bình thường, các procaspase-9 tồn tại ở dạng không hoạt động. Khi các tế bào nhận được kích thích apoptosis (các tác nhân stress), cytochrom c sẽ được giải phóng khỏi ty thể. Một phức hợp holoenzyme đa phân tử được gọi là apoptosome hình thành, bao gồm yếu tố kích hoạt protease apoptotic 1 (Apaf-1), ATP và cytochrom c. Apoptosome chịu trách nhiệm tập hợp các procaspase-9 để hình thành protein caspase-9 có hoạt tính theo hướng dimer.
Sự dimer hóa của caspase-9 dẫn đến sự phân cắt tự xúc tác nhanh chóng, tạo ra caspase-9 (Li và cs, 2017). Sau khi được kích hoạt, caspase-9 bắt đầu phân tách caspase-3 và caspase-7 bằng cách phân giải protein, tiếp đến caspase-3 và caspase-7 sẽ được kích hoạt và hoạt động, báo hiệu cho quá trình apoptosis (Chou và cs, 2000). Các nghiên cứu về caspase-9 Từ những tiềm năng đầy hứa hẹn, cũng như muốn hiểu rõ hơn về caspase-9, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tìm hiểu về protein này. Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.
Đặng Thanh Dũng Trang 7 Tổng quan tài liệu Năm 2005, Yang Chao cùng các cộng sự đã công bố nghiên cứu của nhóm về việc tạo ra protein caspase-9 có tiềm năng dimer nhờ thay thế 5 amino acid trong chuỗi β6 của caspase-9 tự nhiên (Gly402‐Cys‐Phe‐Asn‐Phe406) bằng những amino acid thường hiện diện trong caspase-3 (Cys264‐Ile‐Val‐Ser‐Met268) (Chao và cs, 2005). Kết quả của nghiên cứu này đã tạo ra protein caspase-9 có bề mặt hình thành được cấu trúc dimer. Capase-9 được thay đổi do đột biến có khả năng hình thành homodimer trong buffer và có thể làm tăng hoạt tính caspase-9 gấp 5 lần so với caspase-9 hoang dại. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quá trình apoptosis của tế bào hoặc ứng dụng trong điều trị ung thư.
Trong một nghiên cứu khác, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng cùng các cộng sự, sử dụng phân tử cucurbit[8]uril - một siêu phân tử nhỏ làm chất cảm ứng nhằm tăng cường hoạt tính protein caspase-9. Caspase-9 được thiết kế gắn với một motif peptide FGG. Nhờ motif FGG này, caspase-9 được dimer hóa thông qua tương tác chọn lọc của cucurbit[8]uril. Trong thí nghiệm này, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng đã tiến hành dòng hóa plasmid pTWIN1 mang gene mã hóa cho protein FGG – Caspase-9, sau đó biểu hiện plasmid này trong tế bào E.
Sau khi thu nhận và tinh sạch, protein FGG – Caspase-9 được dimer hóa nhờ chất cảm ứng cucurbit[8]uril và tiến hành kiểm tra hoạt tính. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cấu trúc dimer của caspase-9 nhờ sự cảm ứng của siêu phân tử nhỏ có hoạt tính cao gấp 50 lần so với monomer caspase ‐ 9 (T. Sự dimer protein Sự dimer protein là một cơ chế phổ biến để điều chỉnh hoạt động của protein trong các quá trình sinh học, bao gồm quá trình apoptosis, … (Dung T. Dang và cs, 2013) 1.
Khái niệm Sự dimer protein là quá trình khi một protein liên kết với một protein hình thành cấu trúc homodimer (2 protein giống nhau) hoặc heterodimer (2 protein khác nhau). Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 8 Tổng quan tài liệu Hình 1. Sự dimer protein 1.
Vai trò Tương tác giữa protein – protein và sự dimer protein đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học. Hầu hết các sự kiện diễn ra trong tế bào sống như hoạt hóa enzyme, điều hòa phiên mã, dịch mã, và thậm chí là khả năng kháng bệnh cũng được điều hòa thông qua sự dimer protein hoặc tương tác protein – protein (Nguyen và cs. Các nghiên cứu về cấu trúc và sinh lý gần đây cũng cho thấy sự dimer hoặc oligomer hóa protein là yếu tố then chốt trong việc điều hòa các protein như enzyme, kênh ion, thụ thể. Ngoài ra, sự kết hợp đó có thể giúp giảm thiểu kích thước bộ gene (Radford và cs, 2010).
Mặt khác nó còn điều hòa nhiều hoạt động của tế bào như hoạt hóa prtein caspase-9 kích hoạt apoptosis, hoạt hóa các thụ thể G-protein-coupled receptors (GPCR) trên bề mặt tế bào để dẫn truyền tín hiệu, kích hoạt quá trình sửa chữa,… (Renatus và cs, 2001). Các phương pháp dimer Quá trình dimer hóa protein giữ vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học. Vì vậy, nếu kiểm soát được quá trình dimer hóa protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng bao gồm điều hòa các quá trình sinh học trong tế bào, định vị protein và đáng chú ý là ứng dụng trong liệu pháp tế bào. Từ những tiềm năng to lớn trên, cho đến nay, người ta đã tìm ra nhiều cách để hình thành protein dimer như: hình thành cấu trúc dây kéo, gây đột biến bề mặt protein, sử dụng các phân tử từ bên ngoài (như: sử dụng ion kim loại, sử dụng các phân tử nhỏ, hệ thống khách chủ).
Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 9 Tổng quan tài liệu Hình 1. Các phương pháp tạo protein dimer Tuy nhiên, trong mỗi phương pháp cảm ứng sự dimer protein vẫn còn tồn tại những hạn chế nhất định. Đơn cử, trong phương pháp gây đột biến bề mặt.
Bằng cách thay đổi một vài trình tự amino acid trong các protein mục tiêu, có thể dẫn đến tiềm năng dimer của chúng. Điển hình cho phương pháp này có thể kể đến thí nghiệm hoạt hóa protein caspase-9.