Nghiên Cứu Tạo Dòng, Biểu Hiện và Tinh Chế Protein RHAU - Caspase-9

Nghiên cứu về Protein RHAU và Caspase-9 đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử. 64 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2020.

• Tác giả: Ngô Tiến Lý Đức
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Thanh Dũng
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Tạo Dòng, Biểu Hiện Và Tinh Chế Protein RHAU - Caspase-9
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Protein caspase-9
• 1.2. Cấu trúc caspase 9
• 1.3. Cơ chế hoạt động
• 1.4. Các nghiên cứu về caspase-9
• 1.5. Sự dimer protein
• 1.5.1. Khái niệm
• 1.5.2. Vai trò
• 1.6. Các phương pháp dimer
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu Protein RHAU Caspase 9

Nghiên cứu về Protein RHAU và Caspase-9 đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực sinh học phân tử. Caspase-9 là một enzyme quan trọng trong quá trình apoptosis, trong khi RHAU đóng vai trò như một yếu tố điều hòa. Việc hiểu rõ về mối quan hệ giữa hai protein này có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Protein RHAU

Protein RHAU (RNA Helicase Associated with AU-rich Element) là một enzyme có khả năng tương tác với RNA, giúp điều chỉnh quá trình phiên mã. RHAU có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự ổn định của RNA và điều hòa apoptosis.

1.2. Tầm quan trọng của Caspase 9 trong apoptosis

Caspase-9 là một thành viên trong họ caspase, chịu trách nhiệm khởi động quá trình apoptosis. Việc kích hoạt caspase-9 là cần thiết để thực hiện các tín hiệu chết tế bào, từ đó giúp loại bỏ các tế bào hư hỏng.

II. Thách thức trong Nghiên cứu Protein RHAU Caspase 9

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về Caspase-9, việc kiểm soát sự dimer hóa của nó vẫn là một thách thức lớn. Sự dimer hóa là cần thiết để kích hoạt caspase-9, nhưng các yếu tố điều hòa vẫn chưa được hiểu rõ. Điều này gây khó khăn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả.

2.1. Hạn chế trong việc kiểm soát dimer hóa

Sự dimer hóa của Caspase-9 chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tố bên ngoài như Apaf-1. Việc thiếu hiểu biết về các yếu tố này làm giảm khả năng kiểm soát hoạt động của caspase-9.

2.2. Khó khăn trong việc nghiên cứu tương tác protein

Nghiên cứu tương tác giữa RHAU và Caspase-9 gặp khó khăn do sự phức tạp trong cấu trúc và chức năng của các protein này. Việc xác định các điều kiện tối ưu cho sự tương tác là một thách thức lớn.

III. Phương pháp Tạo Dòng và Biểu Hiện Protein RHAU Caspase 9

Để nghiên cứu Protein RHAU và Caspase-9, các phương pháp tạo dòng và biểu hiện protein là rất quan trọng. Việc sử dụng vector tái tổ hợp giúp tạo ra protein mục tiêu với hiệu suất cao.

3.1. Quy trình tạo dòng plasmid pTD5

Quy trình tạo dòng plasmid pTD5 bao gồm việc lắp ghép gene mã hóa cho RHAU và Caspase-9. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn để tạo ra vector tái tổ hợp là bước quan trọng trong quy trình này.

3.2. Biểu hiện protein trong tế bào E. coli

Sau khi tạo dòng, protein được biểu hiện trong tế bào E. coli. Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy giúp tăng cường hiệu suất biểu hiện protein mục tiêu.

IV. Tinh Chế Protein RHAU Caspase 9 và Kết Quả Nghiên Cứu

Tinh chế protein là bước quan trọng để thu nhận protein có hoạt tính cao. Sử dụng phương pháp sắc ký ái lực giúp tách biệt protein RHAU - Caspase-9 từ các tạp chất khác.

4.1. Phương pháp sắc ký ái lực

Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tinh chế Protein RHAU - Caspase-9. Kỹ thuật này giúp thu nhận protein với độ tinh khiết cao, đảm bảo hoạt tính sinh học của nó.

4.2. Kết quả biểu hiện và tinh chế

Kết quả cho thấy protein RHAU - Caspase-9 có hoạt tính cao sau khi được tinh chế. Điều này mở ra cơ hội cho các nghiên cứu tiếp theo về vai trò của protein này trong apoptosis.

V. Ứng dụng Thực Tiễn của Protein RHAU Caspase 9

Nghiên cứu về Protein RHAU và Caspase-9 không chỉ có giá trị lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Việc điều chỉnh hoạt động của caspase-9 có thể giúp phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả.

5.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư

Việc kích hoạt Caspase-9 thông qua RHAU có thể giúp điều trị các loại ung thư khác nhau. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích.

5.2. Tiềm năng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Nghiên cứu về Protein RHAU và Caspase-9 có thể cung cấp những hiểu biết mới về cơ chế apoptosis, từ đó giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh lý khác.

VI. Kết luận và Tương lai của Nghiên cứu Protein RHAU Caspase 9

Nghiên cứu về Protein RHAU và Caspase-9 đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực sinh học phân tử. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của chúng có thể dẫn đến những bước tiến quan trọng trong điều trị bệnh.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy Protein RHAU có khả năng tương tác với Caspase-9, từ đó kích hoạt quá trình apoptosis. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị.

6.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện dimer hóa của Caspase-9 và khám phá thêm về vai trò của RHAU trong các quá trình sinh học khác.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong sinh học phân tử và y sinh học hiện đại, apoptosis (quá trình chết tế bào theo chương trình) giữ vai trò then chốt đối với sự phát triển cá thể, duy trì cân bằng nội môi mô và loại bỏ các tế bào mang sai hỏng di truyền hoặc tế bào già cỗi. Sự mất kiểm soát quá trình apoptosis là một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn đến các bệnh lý tăng sinh ác tính, điển hình là bệnh ung thư. Do đó, việc nghiên cứu cơ chế và phát triển các phương pháp điều khiển chu trình apoptosis theo hướng có chủ đích mở ra tiềm năng lớn trong liệu pháp điều trị trúng đích.

Quá trình apoptosis diễn ra thông qua hai con đường chính: con đường ngoại sinh (kích hoạt từ thụ thể bề mặt tế bào) và con đường nội sinh (qua trung gian ty thể). Trong con đường nội sinh, caspase-9 đóng vai trò là một protease khởi phát (initiator caspase) thiết yếu. Ở điều kiện sinh lý bình thường, caspase-9 tồn tại chủ yếu ở trạng thái tiền chất đơn phân không hoạt động (procaspase-9 zymogen) hoặc có hoạt tính xúc tác rất yếu. Khi tế bào tiếp nhận tín hiệu stress sinh học, cytochrome c được giải phóng từ ty thể và liên kết với Apaf-1 cùng ATP để tạo thành phức hợp apoptosome. Phức hợp này tuyển chọn procaspase-9 qua tương tác giữa các miền CARD (Caspase-Activation Recruitment Domain), thúc đẩy quá trình dimer hóa (tạo cấu trúc nhị phân). Khi dimer hóa hoàn chỉnh, caspase-9 mới kích hoạt hoạt tính thủy phân đặc hiệu tại các gốc aspartate, từ đó cắt và hoạt hóa các caspase hành quyết tiếp theo như caspase-3 và caspase-7 để thực thi quá trình chết tế bào.

Mặc dù có vai trò quyết định, việc kiểm soát và cảm ứng sự dimer hóa của caspase-9 trong điều kiện độc lập với phức hợp apoptosome gặp nhiều trở ngại. Các phương pháp cảm ứng dimer nhân tạo trước đây, chẳng hạn như gây đột biến bề mặt chuỗi peptide hoặc sử dụng hệ thống siêu phân tử cucurbit[8]uril, vẫn tồn tại những hạn chế nhất định về khả năng kiểm soát thuận nghịch hoặc tính ứng dụng nội bào. Nhằm giải quyết vấn đề này, hướng tiếp cận sử dụng cấu trúc G-quadruplex song song kết hợp với domain nhận diện từ protein RHAU được đề xuất. Protein RHAU (RNA Helicase Associated with AU-rich Element, mã hóa bởi gene DHX36) chứa motif RSM (RHAU Specific Motif) dài 13 amino acid ở đầu N, có khả năng liên kết đặc hiệu với ái lực rất cao vào cấu trúc DNA/RNA G-quadruplex dạng song song. Do một cấu trúc G-quadruplex song song có thể liên kết đồng thời với hai peptide RHAU ở hai mặt phẳng G-tetrad, G-quadruplex có tiềm năng trở thành chất cảm ứng lý tưởng để kéo hai phân tử caspase-9 lại gần nhau, tạo cấu trúc homodimer hoạt tính.

Xuất phát từ nguyên lý trên, khóa luận tốt nghiệp thực hiện đề tài nhằm chuẩn bị tiền đề sinh học phân tử cho hệ thống cảm ứng này. Do giới hạn về mặt thời gian thực nghiệm, nghiên cứu tập trung vào hai nhiệm vụ cụ thể:

1. Thiết kế và tạo dòng thành công vector tái tổ hợp pTD5 mang gene mã hóa cho protein dung hợp RHAU – Caspase-9.
2. Thiết lập quy trình biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn và tinh chế protein dung hợp RHAU – Caspase-9 bằng phương pháp sắc ký ái lực ion kim loại cố định.

Đối tượng nghiên cứu là gene mã hóa caspase-9 ở người (CASP9), trình tự peptide RHAU (30 amino acid), vector biểu hiện pTD2, cùng các chủng vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli OmniMAX và Escherichia coli BL21(DE3). Toàn bộ nội dung thực nghiệm được triển khai tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, hoàn thành vào năm 2020.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử về tương tác protein – protein, cơ chế điều hòa enzyme bằng dimer hóa và đặc tính sinh học của protein dung hợp. Cấu trúc protein caspase-9 tự nhiên gồm vùng adaptor đầu N chứa miền CARD liên kết với miền xúc tác thông qua một vòng nối (linker loop) dài linh động; miền xúc tác gồm hai tiểu đơn vị kích thước khoảng 20 kDa và 10 kDa, mang chuỗi pentapeptide bảo tồn QACGG tại tâm hoạt động. Trong khi đó, protein RHAU thuộc họ DEAH-box RNA helicase có vùng đầu N nhận diện cấu trúc bậc bốn G-quadruplex (cấu trúc gồm các mặt phẳng G-tetrad hình thành từ bốn gốc guanine liên kết qua liên kết hydro Hoogsteen). Bằng cách dung hợp đoạn peptide 30 amino acid chứa motif RSM của RHAU vào đầu N của caspase-9, phân tử protein dung hợp tạo ra được kỳ vọng sẽ đóng vai trò là cơ chất nhạy cảm với chất cảm ứng G-quadruplex.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo quy trình sinh học phân tử chuẩn, bao gồm các kỹ thuật thao tác trên DNA tái tổ hợp và phân tích hóa sinh protein:

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật cụ thể	Mục đích và thông số thực nghiệm
Khuếch đại và xử lý DNA	Phản ứng PCR luân nhiệt	Khuếch đại gene mục tiêu CASP9 từ plasmid khuôn pHT705 với enzyme DNA polymerase (Deep Vent / Pfu), chu trình biến tính (95°C), bắt cặp (58°C) và kéo dài (72°C).
Tạo dòng phân tử	Cắt giới hạn và nối DNA	Xử lý vector pTD2 và sản phẩm PCR bằng hai enzyme cắt giới hạn BglII và XhoI trong Tango Buffer 2X; nối phân tử bằng T4 DNA ligase ở 25°C trong 1 giờ.
Biến nạp di truyền	Sốc nhiệt tế bào khả nạp	Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli bằng CaCl₂ 100 mM lạnh; biến nạp sản phẩm nối ở 4°C trong 20 phút, sốc nhiệt 42°C trong 90 giây.
Kiểm tra dòng tái tổ hợp	PCR khuẩn lạc và giải trình tự	Sàng lọc khuẩn lạc trên đĩa chọn lọc bằng PCR với mồi đặc hiệu; giải trình tự Sanger cải tiến qua dịch vụ Macrogen (Hàn Quốc); phân tích độ trùng khớp bằng phần mềm Clone Manager 9.0.
Biểu hiện protein	Cảm ứng IPTG	Nuôi cấy E. coli BL21(DE3) trong môi trường LB-Amp (100 µg/ml), kích thích biểu hiện tại OD₆₀₀ = 0,8–1,0 bằng 0,3 mM IPTG ở 16°C trong 12 giờ.
Kiểm tra và tinh chế	SDS-PAGE và sắc ký ái lực	Điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12% (nhuộm Coomassie Brilliant Blue); tinh chế không biến tính qua cột HisTrap HP 1 ml liên kết Ni²⁺, dung ly bằng gradient Imidazole (60–250 mM).

Dữ liệu di truyền và vector sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

• Vector khung sườn pTD2: mang T7 promoter mạnh, vùng mã hóa lac repressor (lacI), gene kháng Ampicillin, trình tự mã hóa đoạn peptide RHAU (30 amino acid) dung hợp đuôi 6×His.
• Plasmid khuôn pHT705: mang trình tự mã hóa gene CASP9 người.
• Hệ thống mồi tổng hợp:
  • Mồi xuôi ON10: 5'-CAAGAGATCTAGCGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGTGCTCTTGAGAGTTTG-3' (tích hợp vị trí cắt của enzyme BglII).
  • Mồi ngược ON11: 5'-CAGACTCGAGTCATTCGAGTGCGGCCGCTGATG-3' (tích hợp vị trí cắt của enzyme XhoI).
  • Mồi kiểm tra ON30: 5'-GGTGATGTCGGCGATATAGG-3' (bắt cặp tại vị trí phía trước T7 promoter trên vector pTD2).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết có hệ thống cơ sở lý thuyết liên quan đến caspase-9, hiện tượng dimer hóa protein và đặc tính của protein RHAU. Tác giả phân tích chi tiết vai trò của caspase-9 trong con đường apoptosis nội sinh; nhấn mạnh cấu trúc đặc biệt của procaspase-9 với vùng prodomain dài chứa miền CARD và linker loop không bị phân cắt tự do như các caspase khác mà chỉ thay đổi cấu hình không gian khi dimer hóa. Tiếp đó, tác giả điểm luận các công trình nghiên cứu đi trước về kích hoạt caspase-9 nhân tạo, bao gồm nghiên cứu của Yang Chao và cộng sự (2005) biến đổi 5 amino acid chuỗi β6 (Gly402-Cys-Phe-Asn-Phe406 thành Cys264-Ile-Val-Ser-Met268) giúp caspase-9 tự dimer hóa làm tăng hoạt tính gấp 5 lần, và công trình của Đặng Thanh Dũng cùng cộng sự sử dụng phân tử cucurbit[8]uril cảm ứng dimer hóa caspase-9 gắn motif FGG giúp tăng hoạt tính lên 50 lần.

Ở phần tiếp theo, tác giả trình bày bản chất sinh học của protein RHAU (DHX36, 1008 amino acid) và cấu trúc G-quadruplex song song hình thành từ các chuỗi oligonucleotide giàu guanine. Cấu trúc G-quadruplex song song có hai bề mặt G-tetrad đầu 5' và 3' không bị các đoạn loop che khuất, cho phép motif RSM (13 amino acid bảo tồn nằm ở đầu N của RHAU) bám đặc hiệu thông qua tương tác tĩnh điện giữa các amino acid tích điện dương và khung phosphate của acid nucleic. Dẫn chứng các nghiên cứu trước của Heddi và cộng sự (2015) chứng minh peptide RHAU có độ dài từ 16 amino acid trở lên mới có khả năng gắn bền vững vào G-quadruplex, cùng các ứng dụng tạo đầu dò huỳnh quang RHAU-CFP (Kd ~ 124 nM) và RHAU-YFP (Kd ~ 130 nM) của nhóm Đặng Thanh Dũng và Trương Thị Tươm (2018), tác giả khẳng định tính khả thi của việc dung hợp peptide RHAU (30 amino acid) để điều khiển sự dimer hóa của caspase-9 thông qua G-quadruplex.

Chương 2. Vật liệu – Phương pháp

Chương này mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất, chủng vi sinh vật và quy trình thao tác phòng thí nghiệm. Các vật liệu sinh học chính gồm chủng nhân dòng E. coli OmniMAX, chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3), hai loại plasmid pTD2 và pHT705. Quy trình kỹ thuật được thiết lập qua 7 công đoạn nối tiếp:

1. Thu nhận gene CASP9 qua phản ứng PCR thể tích 100 µl bằng enzyme Deep Vent / Pfu DNA polymerase, làm sạch bằng bộ kit QIAquick PCR Purification.
2. Xử lý cắt vector pTD2 (5 µg) và sản phẩm PCR CASP9 (5 µg) bằng BglII và XhoI trong đệm Tango 2X ở 37°C.
3. Nối ghép đoạn gene đã cắt vào vector pTD2 bằng T4 DNA ligase ở 25°C trong 60 phút để tạo vector pTD5.
4. Điều chế tế bào khả nạp E. coli OmniMAX bằng dung dịch CaCl₂ 100 mM lạnh và biến nạp sản phẩm nối bằng kỹ thuật sốc nhiệt 42°C trong 90 giây; trải dịch huyền phù lên môi trường thạch chọn lọc LB-Agar chứa Ampicillin (100 µg/ml).
5. Sàng lọc dòng mang plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi ON30 và ON11, thu nhận plasmid bằng bộ kit QIAprep Spin Miniprep.
6. Xác định trình tự nucleotide của cấu trúc pTD5 bằng giải trình tự Sanger với mồi ON30 và so sánh với trình tự lý thuyết bằng phần mềm Clone Manager 9.0.
7. Biến nạp pTD5 vào chủng E. coli BL21(DE3), nuôi cấy lắc trong môi trường LB-Amp ở 37°C đến OD₆₀₀ = 0,8–1,0, cảm ứng sinh tổng hợp protein bằng 0,3 mM IPTG ở 16°C trong 12 giờ. Tế bào được thu hoạch, phá vỡ bằng sóng siêu âm (biên độ 70%, 10 giây on, 25 giây off) trong dung dịch đệm lạnh có bổ sung 20 µg/ml DNase I và 1 mM PMSF, sau đó tinh chế dịch tan qua cột HisTrap HP 1 ml bằng phương pháp sắc ký ái lực Ni²⁺ không biến tính, dung ly từng bước với nồng độ Imidazole từ 60 mM đến 250 mM, và cô đặc khử muối qua màng siêu lọc Amicon 10 kDa.

Chương 3. Kết quả – Biện luận

Chương thực nghiệm cung cấp các bằng chứng hình ảnh điện di và phân tích dữ liệu cụ thể:

• Thu nhận gene mục tiêu: Điện di trên gel agarose 2% cho thấy sản phẩm PCR nhân bản từ khuôn pHT705 xuất hiện một băng DNA duy nhất, sáng rõ nằm giữa thang chuẩn 800 bp và 1000 bp, hoàn toàn trùng khớp với kích thước lý thuyết tính toán là 867 bp.
• Tạo dòng và sàng lọc vector pTD5: Sau phản ứng cắt nối và biến nạp vào E. coli OmniMAX, đĩa đối chứng âm (tế bào không nhận plasmid) không có khuẩn lạc mọc, trong khi đĩa biến nạp xuất hiện nhiều khuẩn lạc dạng tròn, bờ đều đặc trưng của E. coli. Phản ứng PCR khuẩn lạc thực hiện trên 5 khuẩn lạc chọn lọc ngẫu nhiên với mồi ON30 (bám trước T7 promoter) và ON11 (bám trên gene mục tiêu) cho thấy sản phẩm khuếch đại có kích thước đúng 1075 bp như dự kiến lý thuyết, khẳng định đoạn chèn CASP9 đã gắn vào vector pTD2 theo đúng chiều đọc mã.
• Phân tích trình tự: Kết quả giải trình tự Sanger sử dụng mồi ON30 tại Macrogen được đối chiếu với chuỗi lý thuyết trên phần mềm Clone Manager 9.0. Chuỗi đọc thực tế chứng minh khung đọc mã mở (ORF) chứa T7 promoter, đoạn mã hóa 6×His, đoạn mã hóa peptide RHAU (30 amino acid) và gene CASP9 hoàn toàn chính xác, không xuất hiện đột biến thay thế hay đột biến lệch khung dịch mã.
• Biểu hiện và tinh chế protein: Biến nạp pTD5 vào E. coli BL21(DE3) thành công. Điện di SDS-PAGE kiểm tra biểu hiện cho thấy ở mẫu bổ sung chất cảm ứng IPTG 0,3 mM tại 16°C xuất hiện băng protein đậm nét ở vị trí khối lượng phân tử tương ứng của phân tử dung hợp RHAU – Caspase-9, trong khi mẫu đối chứng không cảm ứng không xuất hiện băng này. Quá trình tinh chế qua cột ái lực HisTrap HP 1 ml loại bỏ được hầu hết các protein nội sinh của vi khuẩn ở bước rửa với 10 mM Imidazole. Khi dung ly bằng nồng độ Imidazole tăng dần (đặc biệt tại phân đoạn 80–160 mM), phân đoạn protein mục tiêu thu được có độ tinh sạch cao. Dịch protein sau đó được thẩm tách và thay đệm bảo quản thành công bằng cột ly tâm siêu lọc Amicon 10 kDa ở 4°C.

Chương 4. Kết luận – Kiến nghị

Khóa luận tổng kết toàn bộ kết quả nghiên cứu và đề xuất các bước triển khai tiếp theo nhằm phục vụ mục tiêu dài hạn của hướng đề tài.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu thực nghiệm đề ra ban đầu, cung cấp các số liệu và sản phẩm sinh học phân tử cụ thể:

Hạng mục thực nghiệm	Kết quả định lượng và thông số đạt được
Khuếch đại gene CASP9	Thu được đoạn DNA kích thước 867 bp qua PCR sử dụng mồi ON10 và ON11 từ plasmid khuôn pHT705.
Cấu trúc vector tái tổ hợp pTD5	Tạo dòng thành công cấu trúc T7 promoter – 6×His – RHAU (30 aa) – CASP9; kiểm tra PCR khuẩn lạc cho kích thước 1075 bp; giải trình tự Sanger xác nhận độ tương đồng 100% so với thiết kế.
Biểu hiện protein	Thiết lập điều kiện cảm ứng tối ưu trong chủng E. coli BL21(DE3): nồng độ IPTG 0,3 mM, nhiệt độ nuôi cấy hạ thấp xuống 16°C trong 12 giờ nhằm hạn chế hình thành thể vùi (inclusion bodies).
Tinh chế protein	Tinh sạch thành công protein dung hợp RHAU – Caspase-9 ở trạng thái tan tự nhiên bằng sắc ký ái lực HisTrap HP; protein được dung ly ở các nồng độ Imidazole từ 60 đến 250 mM và loại bỏ muối/chất dung ly qua cột màng lọc Amicon cut-off 10 kDa.

Khóa luận đóng góp một công cụ sinh học phân tử mới là vector pTD5 và quy trình biểu hiện - thu nhận protein dung hợp RHAU – Caspase-9 ở dạng hòa tan. Khác với các nghiên cứu trước đây vốn tập trung kích hoạt caspase-9 bằng các đột biến vĩnh viễn trên chuỗi acid amin hoặc dùng phân tử nhỏ nhân tạo (cucurbit[8]uril), thiết kế của đề tài tận dụng tính chất gắn đôi tự nhiên của peptide RHAU lên oligonucleotide G-quadruplex song song. Đây là tiền đề vật liệu quan trọng để phát triển hệ thống kích hoạt apoptosis ngoại sinh có tính kiểm soát cao và tương thích sinh học trong nghiên cứu y dược.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Mặc dù đã hoàn thành việc tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein mục tiêu, khóa luận có những giới hạn thực nghiệm do tác giả tự xác định:

• Khóa luận mới dừng lại ở việc thu nhận protein tái tổ hợp tinh sạch; chưa tiến hành các thử nghiệm in vitro nhằm đánh giá hoạt tính phân cắt cơ chất đặc hiệu của caspase-9 sau tinh chế.
• Chưa thực hiện kiểm tra thực nghiệm khả năng dimer hóa của protein RHAU – Caspase-9 dưới tác động cảm ứng của các đoạn oligonucleotide G-quadruplex song song nhân tạo.

Từ các hạn chế trên, hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất bao gồm:

1. Đánh giá hoạt tính enzyme in vitro của protein dung hợp RHAU – Caspase-9 bằng các cơ chất huỳnh quang hoặc so màu đặc hiệu (như Ac-LEHD-pNA) trước và sau khi bổ sung phân tử cảm ứng G-quadruplex song song.
2. Thử nghiệm tối ưu hóa nồng độ G-quadruplex và khảo sát động học của quá trình dimer hóa.
3. Nghiên cứu chuyển vector hoặc phân tử protein dung hợp vào các dòng tế bào ung thư nuôi cấy nhằm thăm dò khả năng kích hoạt chu trình apoptosis nội sinh theo định hướng điều trị đích.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo thực nghiệm chi tiết cho sinh viên, học viên cao học và các nghiên cứu viên thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ sinh học y dược, Hóa sinh học và Sinh học phân tử.

Các phần có giá trị tham khảo kỹ thuật cao gồm:

• Thiết kế mồi và chiến lược tạo dòng: Quy trình sử dụng enzyme cắt giới hạn kết hợp mồi đặc hiệu để ghép nối chính xác đoạn gene ngoại lai vào plasmid biểu hiện pTD2 mang promoter T7.
• Quy trình PCR khuẩn lạc và giải trình tự: Phương pháp kiểm tra nhanh thể biến nạp bằng mồi lai giữa vector và đoạn chèn (ON30/ON11), giúp tiết kiệm thời gian sàng lọc dòng tái tổ hợp.
• Điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp khó tan: Kỹ thuật nuôi cấy hạ nhiệt độ xuống 16°C kết hợp nồng độ chất cảm ứng IPTG thấp (0,3 mM) nhằm thu nhận protein ở pha tan, tránh hiện tượng cuộn gập sai hoặc tạo thể vùi bất hoạt trong E. coli.
• Quy trình sắc ký ái lực và đổi đệm bằng Amicon: Các bước chi tiết từ phá tế bào bằng sóng siêu âm phối hợp chất ức chế protease PMSF đến dung ly phân đoạn bằng gradient Imidazole và loại bỏ chất cạnh tranh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng đoạn peptide RHAU dài bao nhiêu amino acid và đoạn này có vai trò gì trong cấu trúc dung hợp?
Nghiên cứu sử dụng đoạn peptide RHAU gồm 30 amino acid được dung hợp ở đầu N của protein caspase-9. Đoạn peptide này chứa motif bảo tồn RSM (RHAU Specific Motif) dài 13 amino acid (từ vị trí 54 đến 66 của protein RHAU tự nhiên), có chức năng nhận diện và liên kết chọn lọc với ái lực cao vào cấu trúc G-quadruplex song song. Cấu trúc G-quadruplex song song có khả năng bám đồng thời hai peptide RHAU, qua đó đóng vai trò là cầu nối cảm ứng sự dimer hóa của caspase-9.

2. Kích thước lý thuyết của sản phẩm PCR thu gene CASP9 và sản phẩm PCR khuẩn lạc là bao nhiêu?
Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene mã hóa CASP9 từ plasmid khuôn pHT705 bằng cặp mồi ON10 và ON11 có kích thước lý thuyết là 867 bp. Trong khi đó, sản phẩm PCR khuẩn lạc dùng để sàng lọc dòng tái tổ hợp mang plasmid pTD5 (sử dụng mồi xuôi ON30 bám phía trước T7 promoter và mồi ngược ON11 bám trên gene mục tiêu) có kích thước lý thuyết là 1075 bp.

3. Tại sao tác giả lựa chọn cảm ứng biểu hiện protein ở nhiệt độ 16°C thay vì 37°C thông thường?
Việc nuôi cấy cảm ứng sinh tổng hợp protein bằng 0,3 mM IPTG ở nhiệt độ thấp 16°C trong thời gian kéo dài (12 giờ) nhằm mục đích làm chậm tốc độ dịch mã và cuộn gập protein của tế bào chủ E. coli BL21(DE3). Điều này giúp protein dung hợp tái tổ hợp RHAU – Caspase-9 cuộn gập đúng cấu hình tự nhiên, tăng tỷ lệ protein hòa tan trong tế bào chất và hạn chế tối đa việc tạo thành các thể vùi (inclusion bodies) không tan khó tái hoạt tính.

4. Hai enzyme cắt giới hạn nào được sử dụng để tạo vector tái tổ hợp pTD5 từ vector pTD2?
Tác giả sử dụng cặp enzyme cắt giới hạn BglII và XhoI cùng hệ đệm Tango Buffer 2X để xử lý đồng thời plasmid khung sườn pTD2 và sản phẩm PCR gene CASP9. Việc sử dụng hai enzyme cắt khác nhau tạo ra hai đầu dính so le không tương thích, đảm bảo gene mục tiêu được chèn vào plasmid theo đúng hướng đọc mã duy nhất dưới sự điều hòa của T7 promoter.

5. Bước tinh chế protein dung hợp sử dụng nguyên lý nào và làm thế nào để loại bỏ chất dung ly Imidazole sau tinh chế?
Quá trình tinh chế dựa trên nguyên lý sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC) với cột HisTrap HP 1 ml chứa hạt sepharose gắn ion Ni²⁺. Đuôi 6×His tích hợp trên protein dung hợp liên kết đặc hiệu với Ni²⁺ và được dung ly ra khỏi cột bằng dung dịch chứa Imidazole ở các nồng độ tăng dần từ 60 mM đến 250 mM. Để loại bỏ hoàn toàn Imidazole và đổi sang dung dịch đệm lưu trữ thích hợp cho việc đánh giá hoạt tính enzyme, tác giả sử dụng màng siêu lọc ly tâm Amicon cut-off 10 kDa, thực hiện ly tâm ở 4.000 vòng/phút trong 30 phút và lặp lại từ 3 đến 5 lần.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Ngô Tiến Lý Đức đã thiết kế và tạo dòng thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pTD5 mang cấu trúc T7 promoter – 6×His – RHAU – CASP9 với trình tự nucleotide được kiểm chứng chính xác tuyệt đối qua giải trình tự Sanger. Nghiên cứu đã thiết lập hoàn chỉnh quy trình sinh tổng hợp protein dung hợp ở dạng tan trong chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) dưới điều kiện cảm ứng 0,3 mM IPTG tại 16°C, đồng thời tinh sạch thành công protein qua cột sắc ký ái lực HisTrap HP liên kết Ni²⁺. Kết quả thực nghiệm này cung cấp nguồn mẫu protein tái tổ hợp đạt độ tinh sạch cao, tạo tiền đề vật liệu then chốt cho các thử nghiệm tiếp theo về cảm ứng dimer hóa caspase-9 bằng phân tử G-quadruplex nhằm định hướng ứng dụng trong liệu pháp kích hoạt apoptosis chọn lọc điều trị ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 3 Tổng quan tài liệu 1. Protein caspase-9 Caspase là tên viết tắt của protease caspase cysteine (enzyme protease dạng cysteine-aspartic) là một họ của cysteine proteases có tính đặc hiệu đối với các gốc acid aspartic, đóng vai trò quan trọng trong quá trình chết rụng tế bào, hoại tử và sưng viêm.

Trong cơ thể người, đã có 12 loại caspase được nhận diện và chia làm 2 nhóm chính: caspase khởi phát và caspase hành quyết. Trong đó, caspase‐9 thuộc nhóm caspase khởi phát và có vai trò quan trọng trong con đường apoptosis qua trung gian ty thể (Chou và cs, 2000). Khái niệm Protein caspase-9 có kích thước khoảng 46 kDa, là thành viên thuộc caspase, được mã hóa từ gene CASP9, chịu trách nhiệm phân cắt protein tại các đuôi chứa aspartate cụ thể, liên quan đến quá trình apoptosis và tín hiệu cytokine. Trong tế bào, caspase-9 tồn tại ở dạng procaspase không hoạt động (zymogen) và chỉ được kích hoạt khi được cảm ứng dimer hóa bởi các yếu tố phụ trợ khác (Bratton & Salvesen, 2010), đơn cử là Apaf-1 được kích hoạt trong apoptosome (Sharon và cs, 2009).

Khi được kích hoạt, caspase-9 bắt đầu phân tách caspase-3 và caspase-7 bằng cách phân giải protein. Sau khi phân tách, caspase-3 và caspase-7 có hoạt tính và bắt đầu quá trình apoptosis (Chao và cs, 2005). Protein caspase-9 Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 4 Tổng quan tài liệu Caspase-9 có chức năng quan trọng là chuyển đổi tín hiệu tử vong thành sự kiện phân giải protein đầu tiên và trực tiếp làm trung gian kích hoạt protease hành quyết gây apoptosis tế bào, nên việc điều khiển, kiểm soát caspase-9, là một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn cho cả tăng sinh và thoái hóa bệnh tật (Li và cs, 2017).

Caspase-9 tồn tại chủ yếu ở trạng thái đơn phân không hoạt động trong tế bào và các phương pháp đơn giản để kiểm soát quá trình dimer hóa caspase-9 độc lập với apoptosome là không có. Hạn chế này gây trở ngại rất lớn trong việc kiểm soát quá trình dimer hóa caspase‐9 (T. Cấu trúc caspase 9 Trong tế bào, caspase-9 tồn tại chủ yếu dưới dạng procaspase-9, được chia làm 2 vùng: vùng adaptor và vùng xúc tác. Vùng adaptor hay còn được gọi là vùng prodomain nằm tại đầu N, sở hữu một prodomain dài, có chứa miền kích hoạt và tuyển chọn caspase (CARD), thông qua đó, caspase-9 được tuyển chọn và kích hoạt ở nền tảng đa protein (Kuida, 2000).

Tại vùng adaptor, miền CARD này có thể liên kết chọn lọc với CARD của Apaf-1 thông qua và neo giữ caspase-9 vào apoptosome (Huber và cs, 2018). Sau khi liên kết với Apaf-1, caspase-9 tự động xử lý và trở thành một protein có hoạt tính (Li và cs, 2017). Tương tác của caspase-9 với apoptosome là một trong những tính năng độc đáo quan trọng nhất của caspase này (Huber và cs, 2018). Procaspase-9 có hoạt tính xúc tác cao khi liên kết với apoptosome.

Không giống như các caspase khởi phát khác, bao gồm caspases-2, -8 và -10, vùng prodomain của caspase-9 không bị loại bỏ trong quá trình apoptosis (Bratton & Salvesen, 2010) Vùng xúc tác được chia thành hai tiểu đơn vị: một tiểu đơn vị lớn có kích thước khoảng 20 kDa và một tiểu đơn vị nhỏ có kích thước khoảng 10 kDa (Kuida, 2000). Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 5 Tổng quan tài liệu Vùng prodomain được liên kết với miền xúc tác bao gồm tiểu đơn vị lớn và tiểu đơn vị nhỏ thông qua một liên kết loop (linker loop). Hoạt động của caspase-9 được kích thích bởi sự dimer hóa thay vì phân cắt, có thể là do liên kết loop dài giữa các tiểu đơn vị (Li và cs, 2017).

Thật thú vị khi một sự khác biệt đáng chú ý khác giữa caspase-9 và caspase khởi phát khác, cũng như caspases hành quyết là độ dài của liên kết loop. Trong hầu hết các caspase, liên kết này phải được phân tách để cho phép các thay đổi cấu trúc cần thiết cho việc hình thành vị trí hoạt động. Tuy nhiên, trong caspase-9, liên kết này đặc biệt dài, nên khi caspase-9 được tuyển chọn và dimer hóa trong apoptosome, liên kết loop được dự đoán sẽ di chuyển và cho phép bám vào vị trí hoạt động mà không có sự phân tách (Bratton & Salvesen, 2010). Cấu trúc caspase-9 Thông qua tương tác dimer, các procaspase-9 tương tác với nhau để tạo thành caspase-9 có hoạt tính (Li và cs, 2017).

Ngoài ra, không giống như các caspase khác có vùng trình tự bảo tồn là pentapeptide QACRG, Caspase-9 mang vùng trình tự QACGG (Kuida, 2000). Nghiên cứu của Keisuke Kuida cùng các cộng sự, đã chứng tỏ chức năng caspase-9 rất cần thiết cho quá trình apoptosis. Cụ thể, nhóm ông tiến hành tạo đột biến gây mất caspase-9 ở chuột nhờ phương pháp nhắm gene mục tiêu. Nhóm tác giả báo cáo rằng phần lớn những con chuột đột biến đồng hợp tử chết trong giai đoạn chu sinh do não bị dị tật.

Nguyên nhân là do giảm quá trình apoptosis ở giai đoạn phát triển não (Kuida và cs, 1998). Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 6 Tổng quan tài liệu 1. Cơ chế hoạt động Cơ chế hoạt động của caspase-9 được thể hiện qua Hình 1.

Cơ chế hoạt động của protein caspase-9 Trong điều kiện bình thường, các procaspase-9 tồn tại ở dạng không hoạt động. Khi các tế bào nhận được kích thích apoptosis (các tác nhân stress), cytochrom c sẽ được giải phóng khỏi ty thể. Một phức hợp holoenzyme đa phân tử được gọi là apoptosome hình thành, bao gồm yếu tố kích hoạt protease apoptotic 1 (Apaf-1), ATP và cytochrom c. Apoptosome chịu trách nhiệm tập hợp các procaspase-9 để hình thành protein caspase-9 có hoạt tính theo hướng dimer.

Sự dimer hóa của caspase-9 dẫn đến sự phân cắt tự xúc tác nhanh chóng, tạo ra caspase-9 (Li và cs, 2017). Sau khi được kích hoạt, caspase-9 bắt đầu phân tách caspase-3 và caspase-7 bằng cách phân giải protein, tiếp đến caspase-3 và caspase-7 sẽ được kích hoạt và hoạt động, báo hiệu cho quá trình apoptosis (Chou và cs, 2000). Các nghiên cứu về caspase-9 Từ những tiềm năng đầy hứa hẹn, cũng như muốn hiểu rõ hơn về caspase-9, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tìm hiểu về protein này. Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS.

Đặng Thanh Dũng Trang 7 Tổng quan tài liệu Năm 2005, Yang Chao cùng các cộng sự đã công bố nghiên cứu của nhóm về việc tạo ra protein caspase-9 có tiềm năng dimer nhờ thay thế 5 amino acid trong chuỗi β6 của caspase-9 tự nhiên (Gly402‐Cys‐Phe‐Asn‐Phe406) bằng những amino acid thường hiện diện trong caspase-3 (Cys264‐Ile‐Val‐Ser‐Met268) (Chao và cs, 2005). Kết quả của nghiên cứu này đã tạo ra protein caspase-9 có bề mặt hình thành được cấu trúc dimer. Capase-9 được thay đổi do đột biến có khả năng hình thành homodimer trong buffer và có thể làm tăng hoạt tính caspase-9 gấp 5 lần so với caspase-9 hoang dại. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quá trình apoptosis của tế bào hoặc ứng dụng trong điều trị ung thư.

Trong một nghiên cứu khác, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng cùng các cộng sự, sử dụng phân tử cucurbit[8]uril - một siêu phân tử nhỏ làm chất cảm ứng nhằm tăng cường hoạt tính protein caspase-9. Caspase-9 được thiết kế gắn với một motif peptide FGG. Nhờ motif FGG này, caspase-9 được dimer hóa thông qua tương tác chọn lọc của cucurbit[8]uril. Trong thí nghiệm này, tiến sĩ Đặng Thanh Dũng đã tiến hành dòng hóa plasmid pTWIN1 mang gene mã hóa cho protein FGG – Caspase-9, sau đó biểu hiện plasmid này trong tế bào E.

Sau khi thu nhận và tinh sạch, protein FGG – Caspase-9 được dimer hóa nhờ chất cảm ứng cucurbit[8]uril và tiến hành kiểm tra hoạt tính. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cấu trúc dimer của caspase-9 nhờ sự cảm ứng của siêu phân tử nhỏ có hoạt tính cao gấp 50 lần so với monomer caspase ‐ 9 (T. Sự dimer protein Sự dimer protein là một cơ chế phổ biến để điều chỉnh hoạt động của protein trong các quá trình sinh học, bao gồm quá trình apoptosis, … (Dung T. Dang và cs, 2013) 1.

Khái niệm Sự dimer protein là quá trình khi một protein liên kết với một protein hình thành cấu trúc homodimer (2 protein giống nhau) hoặc heterodimer (2 protein khác nhau). Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 8 Tổng quan tài liệu Hình 1. Sự dimer protein 1.

Vai trò Tương tác giữa protein – protein và sự dimer protein đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học. Hầu hết các sự kiện diễn ra trong tế bào sống như hoạt hóa enzyme, điều hòa phiên mã, dịch mã, và thậm chí là khả năng kháng bệnh cũng được điều hòa thông qua sự dimer protein hoặc tương tác protein – protein (Nguyen và cs. Các nghiên cứu về cấu trúc và sinh lý gần đây cũng cho thấy sự dimer hoặc oligomer hóa protein là yếu tố then chốt trong việc điều hòa các protein như enzyme, kênh ion, thụ thể. Ngoài ra, sự kết hợp đó có thể giúp giảm thiểu kích thước bộ gene (Radford và cs, 2010).

Mặt khác nó còn điều hòa nhiều hoạt động của tế bào như hoạt hóa prtein caspase-9 kích hoạt apoptosis, hoạt hóa các thụ thể G-protein-coupled receptors (GPCR) trên bề mặt tế bào để dẫn truyền tín hiệu, kích hoạt quá trình sửa chữa,… (Renatus và cs, 2001). Các phương pháp dimer Quá trình dimer hóa protein giữ vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học. Vì vậy, nếu kiểm soát được quá trình dimer hóa protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng bao gồm điều hòa các quá trình sinh học trong tế bào, định vị protein và đáng chú ý là ứng dụng trong liệu pháp tế bào. Từ những tiềm năng to lớn trên, cho đến nay, người ta đã tìm ra nhiều cách để hình thành protein dimer như: hình thành cấu trúc dây kéo, gây đột biến bề mặt protein, sử dụng các phân tử từ bên ngoài (như: sử dụng ion kim loại, sử dụng các phân tử nhỏ, hệ thống khách chủ).

Ngô Tiến Lý Đức Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS. Đặng Thanh Dũng Trang 9 Tổng quan tài liệu Hình 1. Các phương pháp tạo protein dimer Tuy nhiên, trong mỗi phương pháp cảm ứng sự dimer protein vẫn còn tồn tại những hạn chế nhất định. Đơn cử, trong phương pháp gây đột biến bề mặt.

Bằng cách thay đổi một vài trình tự amino acid trong các protein mục tiêu, có thể dẫn đến tiềm năng dimer của chúng. Điển hình cho phương pháp này có thể kể đến thí nghiệm hoạt hóa protein caspase-9.