Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein Interleukin 7 Tái Tổ Hợp Trong Hệ Thống Nuôi Cấy Thực Vật

Nghiên cứu biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sinh học phân tử.

• Tác giả: Nguyễn Huy Hoàng
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein Interleukin 7 Tái Tổ Hợp Trong Hệ Thống Nuôi Cấy Thực Vật
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của luận án
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án
• 1.4.1. Ý nghĩa lý luận
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.5. Đóng góp mới của luận án
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người
• 2.1.1. Vai trò trong hệ miễn dịch người
• 2.1.2. Cơ chế hoạt động
• 2.1.2.1. Chemokine
• 2.1.2.2. Họ các yếu tố hoại tử khối u (TNF)
• 2.1.2.3. Họ interferon (IFN)
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu thực vật
• 3.2. Các chủng vi khuẩn, tế bào
• 3.3. Các gen và vector
• 3.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
• 3.5. Hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật
• 3.7.2. Thiết kế mồi
• 3.7.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp
• 3.7.4. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ thuốc lá
• 3.7.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen
• 3.7.6. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 3.7.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp
• 3.7.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp
• 3.7.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật
• 4.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá
• 4.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7
• 4.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7
• 4.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D
• 4.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
• 4.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp
• 4.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn
• 4.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2
• 4.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen
• 4.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration
• 4.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp
• 4.4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B
• 4.4.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ
• 4.4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá
• 4.4.4. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Về Interleukin 7 IL 7 Tái Tổ Hợp

Interleukin 7 (IL-7) là một cytokine quan trọng, đóng vai trò then chốt trong hệ miễn dịch. IL-7 chủ yếu tác động lên các tế bào lympho, đặc biệt là tế bào T và tế bào B, thúc đẩy sự phát triển, tồn tại và hoạt động của chúng. Sự thiếu hụt IL-7 có thể dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng về miễn dịch, làm tăng nguy cơ nhiễm trùng và các bệnh tự miễn. Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7 có ý nghĩa to lớn trong y học, mở ra tiềm năng điều trị các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và các bệnh ung thư. Các phương pháp sản xuất truyền thống gặp nhiều hạn chế về chi phí và an toàn, thúc đẩy sự tìm kiếm các hệ thống biểu hiện protein mới, hiệu quả hơn. Trong bối cảnh đó, hệ thống nuôi cấy thực vật nổi lên như một giải pháp đầy hứa hẹn, mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Vai trò sinh học của Interleukin 7 IL 7 trong miễn dịch học

Interleukin 7 (IL-7) là một cytokine thuộc họ Interleukin, đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và duy trì của tế bào lympho T và B. IL-7 kích thích sự sinh sản, biệt hóa và tồn tại của các tế bào này, đặc biệt là ở giai đoạn đầu của quá trình phát triển tế bào lympho. Bên cạnh đó, IL-7 còn có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nội môi của tế bào T ở giai đoạn trưởng thành. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, IL-7 thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến sự sống còn và ức chế apoptosis ở tế bào lympho. Thiếu IL-7 dẫn đến suy giảm số lượng tế bào T và B, gây ra các vấn đề nghiêm trọng về miễn dịch.

1.2. Ứng dụng của Interleukin 7 IL 7 trong y học và ứng dụng lâm sàng

Protein Interleukin 7 (IL-7) tái tổ hợp có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và ung thư. IL-7 có thể được sử dụng để tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân HIV/AIDS, bệnh nhân ung thư sau hóa trị hoặc xạ trị, và bệnh nhân sau ghép tạng. Ngoài ra, IL-7 còn được nghiên cứu sử dụng trong điều trị các bệnh tự miễn như lupus ban đỏ hệ thống và viêm khớp dạng thấp. Các nghiên cứu ứng dụng lâm sàng cho thấy IL-7 có thể cải thiện chức năng miễn dịch và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

II. Thách Thức Sản Xuất Protein Tái Tổ Hợp Interleukin 7 Hiện Nay

Sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7 phục vụ mục đích nghiên cứu và điều trị gặp nhiều thách thức. Các hệ thống biểu hiện protein truyền thống như vi khuẩn và tế bào động vật có vú có những hạn chế nhất định. Biểu hiện trong vi khuẩn thường dẫn đến việc protein bị gấp nếp sai và không có hoạt tính sinh học. Biểu hiện trong tế bào động vật có vú đòi hỏi quy trình phức tạp, chi phí cao và tiềm ẩn nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh cho người. Do đó, cần có những giải pháp thay thế hiệu quả hơn. Bài toán đặt ra là làm sao để sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7 với chi phí thấp, quy mô lớn, đảm bảo hoạt tính sinh học và an toàn cho người sử dụng.

2.1. Những hạn chế của hệ thống biểu hiện protein truyền thống

Các hệ thống biểu hiện protein truyền thống như E. coli và tế bào động vật có vú đối mặt với nhiều hạn chế trong sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7. E. coli thường không có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã cần thiết để đảm bảo hoạt tính sinh học của Interleukin 7. Tế bào động vật có vú, mặc dù có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã phức tạp, lại đòi hỏi chi phí nuôi cấy cao và thời gian sản xuất dài. Ngoài ra, còn có rủi ro nhiễm các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn khi sử dụng tế bào động vật có vú.

2.2. Yêu cầu về chất lượng và độ tinh khiết protein trong sản xuất dược phẩm

Trong sản xuất dược phẩm, độ tinh khiết protein là một yếu tố then chốt. Protein Interleukin 7 tái tổ hợp dùng trong điều trị cần phải đạt độ tinh khiết cao để đảm bảo an toàn và hiệu quả. Các tạp chất có thể gây ra các phản ứng phụ không mong muốn hoặc làm giảm hoạt tính sinh học của Interleukin 7. Do đó, quy trình tinh sạch protein phải được thiết kế cẩn thận để loại bỏ tất cả các tạp chất, bao gồm protein của tế bào chủ, DNA, RNA và các chất gây ô nhiễm khác.

III. Hệ Thống Nuôi Cấy Thực Vật Giải Pháp Biểu Hiện Gen IL 7 Tiềm Năng

Hệ thống nuôi cấy thực vật nổi lên như một giải pháp đầy hứa hẹn cho việc sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7. So với các hệ thống truyền thống, hệ thống nuôi cấy thực vật có nhiều ưu điểm vượt trội như chi phí sản xuất thấp, khả năng sản xuất quy mô lớn, tính an toàn cao và khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã tương tự như ở tế bào động vật có vú. Hệ thống nuôi cấy thực vật có thể sử dụng nhiều loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua... hoặc các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật như tế bào huyền phù và rễ tơ. Việc lựa chọn hệ thống phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của protein Interleukin 7 và mục tiêu sản xuất.

3.1. Ưu điểm hệ thống nuôi cấy thực vật so với các hệ thống khác

Hệ thống nuôi cấy thực vật sở hữu nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện protein khác. Chi phí sản xuất thường thấp hơn đáng kể do không đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp và đắt tiền. Khả năng sản xuất quy mô lớn cũng là một ưu điểm lớn, giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về protein Interleukin 7 tái tổ hợp. Ngoài ra, hệ thống nuôi cấy thực vật có tính an toàn cao hơn do không có nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh cho người.

3.2. Các phương pháp công nghệ sinh học thực vật để biểu hiện protein dược phẩm

Nhiều phương pháp công nghệ sinh học thực vật được sử dụng để biểu hiện protein dược phẩm, bao gồm chuyển gen ổn định và chuyển gen tạm thời. Chuyển gen ổn định tạo ra các dòng cây chuyển gen có khả năng biểu hiện protein dược phẩm liên tục qua nhiều thế hệ. Chuyển gen tạm thời, thường sử dụng Agrobacterium tumefaciens, cho phép biểu hiện protein dược phẩm nhanh chóng nhưng không ổn định. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào thời gian sản xuất, quy mô sản xuất và tính ổn định của protein dược phẩm.

3.3. Nicotiana benthamiana và vai trò trong biểu hiện protein tái tổ hợp

Nicotiana benthamiana là một loài cây thuốc lá được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong biểu hiện protein tái tổ hợp. Nicotiana benthamiana có nhiều ưu điểm như khả năng nhiễm Agrobacterium tumefaciens cao, thời gian sinh trưởng ngắn và dễ dàng nhân giống. Ngoài ra, hệ gen của Nicotiana benthamiana đã được giải trình tự, giúp cho việc thiết kế và tối ưu hóa các vector biểu hiện trở nên dễ dàng hơn.

IV. Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein Interleukin 7 Sử Dụng Agrobacterium tumefaciens

Sử dụng Agrobacterium tumefaciens là một phương pháp hiệu quả để chuyển gen IL-7 vào tế bào thực vật. Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn đất có khả năng chuyển DNA vào tế bào thực vật thông qua quá trình lây nhiễm tự nhiên. Gen IL-7 được chèn vào plasmid T-DNA của Agrobacterium tumefaciens, sau đó vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm vào lá hoặc tế bào thực vật. Sau khi lây nhiễm, T-DNA mang gen IL-7 sẽ được chuyển vào nhân tế bào thực vật và tích hợp vào nhiễm sắc thể, cho phép tế bào thực vật biểu hiện protein Interleukin 7.

4.1. Quy trình chuyển gen IL 7 vào Nicotiana benthamiana bằng Agrobacterium

Quy trình chuyển gen IL-7 vào Nicotiana benthamiana bằng Agrobacterium tumefaciens bao gồm các bước chính sau: (1) Chuẩn bị vector chuyển gen chứa gen IL-7. (2) Biến nạp vector vào Agrobacterium tumefaciens. (3) Nuôi cấy Agrobacterium tumefaciens đến mật độ thích hợp. (4) Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens vào lá hoặc tế bào Nicotiana benthamiana. (5) Nuôi cấy Nicotiana benthamiana trong điều kiện thích hợp để kích thích sự biểu hiện gen IL-7.

4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện protein Interleukin 7

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện protein Interleukin 7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật, bao gồm cấu trúc của vector chuyển gen, chủng Agrobacterium tumefaciens được sử dụng, điều kiện nuôi cấy và đặc tính của gen IL-7. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đạt được hiệu quả biểu hiện cao nhất. Chẳng hạn, việc sử dụng promoter mạnh và codon tối ưu hóa cho thực vật có thể làm tăng đáng kể hiệu quả biểu hiện.

V. Đánh Giá và Ứng Dụng Protein Interleukin 7 Tái Tổ Hợp Từ Thực Vật

Sau khi thu được protein Interleukin 7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật, cần tiến hành đánh giá chất lượng và hoạt tính sinh học của protein. Các phương pháp đánh giá bao gồm Western blot, ELISA, và các xét nghiệm hoạt tính sinh học in vitro. Kết quả đánh giá sẽ giúp xác định liệu protein Interleukin 7 tái tổ hợp có đủ tiêu chuẩn để sử dụng trong các ứng dụng nghiên cứu và điều trị hay không. Nếu đạt yêu cầu, protein có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và ung thư.

5.1. Phương pháp Western blot và ELISA để xác định biểu hiện protein

Western blot và ELISA là hai phương pháp phổ biến được sử dụng để xác định biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong các mẫu thực vật. Western blot cho phép xác định kích thước và độ tinh khiết protein, trong khi ELISA cho phép định lượng chính xác hàm lượng protein Interleukin 7 tái tổ hợp. Cả hai phương pháp đều dựa trên nguyên tắc sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện protein Interleukin 7.

5.2. Kiểm tra hoạt tính sinh học của Interleukin 7 Tái Tổ Hợp

Kiểm tra hoạt tính sinh học của Interleukin 7 tái tổ hợp là bước quan trọng để đảm bảo protein có khả năng thực hiện chức năng sinh học của nó. Các xét nghiệm hoạt tính sinh học thường dựa trên khả năng của Interleukin 7 kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào lympho T. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học sẽ cho biết liệu protein Interleukin 7 tái tổ hợp có đủ khả năng để sử dụng trong các ứng dụng điều trị hay không.

VI. Kết Luận Triển Vọng Protein Trị Liệu Interleukin 7 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật mở ra nhiều triển vọng trong việc sản xuất các protein trị liệu với chi phí thấp và quy mô lớn. Mặc dù còn nhiều thách thức cần vượt qua, nhưng tiềm năng ứng dụng của protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong điều trị các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và ung thư là rất lớn. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình biểu hiện, tinh sạch protein và đánh giá hiệu quả điều trị in vivo.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo để tối ưu hóa hệ thống biểu hiện protein thực vật

Để tối ưu hóa hệ thống biểu hiện protein thực vật, cần tập trung vào việc cải thiện cấu trúc của vector chuyển gen, lựa chọn chủng Agrobacterium tumefaciens phù hợp, điều chỉnh điều kiện nuôi cấy và sử dụng các biện pháp kỹ thuật để tăng hiệu quả biểu hiện protein. Ngoài ra, cần nghiên cứu các phương pháp để cải thiện tính ổn định protein và giảm thiểu các tác động tiêu cực đến sự phát triển của cây.

6.2. Tiềm năng ứng dụng Interleukin 7 Tái Tổ Hợp trong miễn dịch học và ứng dụng dược phẩm

Interleukin 7 Tái Tổ Hợp có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong miễn dịch học và ứng dụng dược phẩm. Trong miễn dịch học, Interleukin 7 có thể được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế điều hòa miễn dịch và phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh tự miễn. Trong ứng dụng dược phẩm, Interleukin 7 có thể được sử dụng để tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, điều trị ung thư và cải thiện hiệu quả của vaccine.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình nghiên cứu sinh học thuộc chuyên ngành Di truyền học (mã số: 9 42 01 21) của nghiên cứu sinh Nguyễn Huy Hoàng, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Chu Hoàng Hà và PGS. Lê Văn Sơn tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên (2018), tập trung giải quyết vấn đề biểu hiện protein trị liệu của người trong các hệ thống thực vật.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Interleukin là nhóm cytokine tiết và phân tử tín hiệu giữ vai trò điều hòa phản ứng miễn dịch ở người; sự thiếu hụt interleukin có thể dẫn đến các bệnh tự miễn và suy giảm miễn dịch. Trước đây, các protein có hoạt tính sinh học dùng trong y học (hormone, enzyme, cytokine) chủ yếu được chiết xuất từ mô động vật. Nguồn cung này bộc lộ nhiều hạn chế về sản lượng, giá thành và nguy cơ lây truyền mầm bệnh nguy hiểm. Dù công nghệ sinh học phân tử đã cho phép sản xuất protein tái tổ hợp ở vi khuẩn (Escherichia coli), hệ thống này vẫn gặp các trở ngại: hình thành thể vùi bất hoạt, thiếu các biến đổi sau dịch mã và tích lũy nội độc tố lipopolysaccharide gây sốt.

Trong bối cảnh đó, hệ thống nuôi cấy thực vật nổi lên như một giải pháp thay thế với ưu điểm: môi trường dinh dưỡng đơn giản, khả năng tiết protein ra môi trường giúp việc thu hồi dễ dàng, tế bào có cơ chế cải biến sau dịch mã của sinh vật nhân thực và an toàn sinh học do virus thực vật không gây bệnh cho người. Tuy nhiên, việc nghiên cứu biểu hiện interleukin 7 của người (hIL-7) trên các mô hình nuôi cấy thực vật khác nhau chưa được khảo sát đồng bộ. Luận án được thực hiện nhằm tối ưu hóa biểu hiện và tinh sạch hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu cụ thể:

1. Xác định được hệ thống nuôi cấy thực vật biểu hiện tối ưu protein hIL-7 tái tổ hợp.
2. Thu nhận và tinh sạch được protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu trên, tác giả triển khai bốn nội dung nghiên cứu:

1. Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hiện ở hệ thống thực vật.
2. Thiết kế vector chứa cấu trúc gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với các hệ thống nuôi cấy thực vật.
3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ và cây thuốc lá chuyển gen.
4. Phân tích, kiểm tra và đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy thực vật.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Trình tự gen hIL-7 người (mã số GenBank: J04156.1); các hệ thống thực vật gồm dòng tế bào huyền phù Nicotiana tabacum Bright Yellow 2 (BY2), giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 (tạo rễ tơ), cây thuốc lá Nicotiana benthamiana (biểu hiện tạm thời); các chủng vi sinh vật gồm E. coli DH-5α, E. coli Rosetta-gami B, Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260, Agrobacterium rhizogenes; dòng tế bào động vật 2E8 (ATCC).
• Phạm vi không gian: Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
• Phạm vi thời gian: Các thực nghiệm được tiến hành trong giai đoạn từ năm 2012 đến năm 2016.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước

Tác giả đã hệ thống hóa các nhóm cytokine (Chemokine, TNF, Interferon, Interleukin từ IL-1 đến IL-36) và các nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp:

• Cấu trúc và chức năng hIL-7: hIL-7 được phát hiện năm 1988 bởi hãng Immunex và nhân bản cDNA năm 1989. Phân tử là glycoprotein xoắn 4α nặng 17,4 kDa, định vị tại nhiễm sắc thể 8q21 (kích thước 33 kb, 6 exon, 5 intron). Thụ thể gồm chuỗi IL-7Rα (CD127, 80 kDa, trên nhiễm sắc thể 5p13) và chuỗi chung γc (CD132). Cơ chế dẫn truyền tín hiệu thông qua Jak1, Jak3, phosphoryl hóa gốc Y449, kích hoạt Stat5 và con đường PI3K/Akt/GSK3, điều hòa các yếu tố chống chết theo chương trình tế bào (Bcl-2, Bcl-XL) và ức chế các protein pro-apoptosis (Bid, Bad, Bax). Morrissey (1991) cùng nhiều tác giả đã chứng minh vai trò của hIL-7 trong biệt hóa lympho B, lympho T và cân bằng nội môi tế bào T CD8+.
• Biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn: Sanchez-Garcia (2016) ghi nhận 86% protein điều trị ung thư được sản xuất từ E. coli, tuy nhiên gặp nhược điểm về codon hiếm, thể vùi và độc tố lipopolysaccharide.
• Biểu hiện cytokine ở thực vật: Các công trình quốc tế đã biểu hiện Erythropoietin (25 pg/l), G-CSF (105 µg/l), GM-CSF (150–250 µg/l), IL-2 (0,09 mg/l), IL-4 (0,45 mg/l), IL-12 (175 µg/l) trong tế bào BY2; GM-CSF trong mía (0,02%), hạt lúa (0,5–14 µg/hạt), khoai tây (2%); IL-2 trong khoai tây (115 U/mg protein tổng số); IL-10 (0,27% protein tan tổng số); IL-13 (0,15%); IL-18 (351 ng/g); TNF-α (15 µg/g mô); FGF8b (4,1% protein tổng số) trong lá thuốc lá.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Trương Nam Hải (2010) sản xuất thành công IL-2 tái tổ hợp đạt độ tinh sạch 95%; Trung tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh nghiên cứu thử nghiệm hIL-33 điều trị hen suyễn trên chuột; Phan Tường Lộc và cộng sự (2012) chuyển thành công gen HIV-1 p24 và aadA vào lục lạp giống thuốc lá Virginia (V2).

Tên Cytokine	Đối tượng thực vật	Đặc điểm cassette biểu hiện	Hàm lượng protein ghi nhận
GM-CSF	Mía	Promoter Mubi-1 / Scubi-9	0,02% protein tan tổng số
GM-CSF	Thuốc lá	Promoter Gt1, Gt3, tín hiệu peptide, nos term	0,005 - 1,3% protein tan tổng số
GM-CSF	Lúa	Promoter Gt3α, tín hiệu peptide glutelin	0,5 - 14 µg/hạt
Murine GM-CSF	Thuốc lá	Promoter RbcS1, tín hiệu peptide, KDEL	19 µg/g lá tươi (0,22%)
IL-2	Khoai tây	Promoter patatin, nos terminator	115 U/mg protein tổng số
IL-4	Thuốc lá, khoai tây	Promoter 35S, KDEL	0,1% (thuốc lá); 0,08% (khoai tây)
IL-10	Thuốc lá	Promoter 35S, enhancer, ELP, KDEL	0,27% protein tan tổng số
IL-12	Thuốc lá, cà chua	Promoter 35S, enhancer, 35S terminator	40 ng/g (thuốc lá); 7,3 µg/g (cà chua)
IL-13	Thuốc lá	Hai promoter 35S, KDEL, nos terminator	0,15% protein tổng số
IL-18	Thuốc lá	Promoter 35S, nos terminator	0,004 - 0,051% (351 ng/g)
TNF-α	Khoai tây	Promoter 35S, trình tự SEKDEL	15 µg/g mô
FGF8b	Thuốc lá	Promoter 35S, hai enhancer, c-myc, his, KDEL	4,1% protein tổng số

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù nhiều loại cytokine đã được thử nghiệm biểu hiện trên thực vật, việc biểu hiện cytokine hIL-7 của người trong các hệ thống nuôi cấy thực vật (tế bào huyền phù BY2, rễ tơ và biểu hiện tạm thời qua Agro-infiltration) chưa được công bố và đánh giá đầy đủ. Luận án tập trung giải quyết khoảng trống này thông qua việc thiết kế đồng bộ các vector chuyển gen tái tổ hợp, đánh giá biểu hiện và tinh sạch protein hIL-7 có hoạt tính sinh học.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Tối ưu hóa mã bộ ba (Codon Optimization): Tần suất sử dụng codon ở thực vật khác biệt so với người. Thay thế các codon hiếm bằng codon ưu tiên ở thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin giúp tăng hiệu quả dịch mã và độ bền của phân tử mRNA ngoại lai.
• Chuyển gen qua Agrobacterium: Sử dụng A. tumefaciens mang T-DNA tái tổ hợp để chuyển gen vào tế bào thực vật và A. rhizogenes mang Ri-plasmid (vùng TL-DNA và TR-DNA) kích thích tạo rễ tơ tự dưỡng hormone, sinh trưởng nhanh.
• Biểu hiện tạm thời (Agro-infiltration): Xâm nhiễm hệ thống lá thực vật đã biệt hóa (N. benthamiana) bằng vi khuẩn mang cấu trúc gen ngoại lai dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S và yếu tố hỗ trợ phiên mã FUS3/Hc-Pro nhằm thu nhận protein mục tiêu trong thời gian ngắn.
• Công nghệ tinh sạch mITC và ELP: Dung hợp chuỗi polypeptide tương tự elastin (100xELP) với protein đích giúp tinh sạch protein qua chu kỳ chuyển pha nhiệt đảo ngược trên màng lọc (mITC), kết hợp với sắc ký ái lực kim loại cố định (IMAC) nhờ đoạn His-tag.

Phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích

• Công cụ tin sinh học: Cơ sở dữ liệu Codon Usage Database, phần mềm Codon Optimization 2.0, Invitrogen, BioEdit và Graphical Codon Usage Analyzer dùng để kiểm tra phân bố codon, loại bỏ trình tự gây mất ổn định mRNA (như mô-típ ATTTA), bổ sung vị trí cắt enzyme giới hạn (SacI, NcoI, HindIII, BamHI) cùng các đoạn thẻ c-myc tag và His-tag.
• Kỹ thuật sinh học phân tử:
  • Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli DH-5α bằng sốc nhiệt (42°C trong 90 giây).
  • Tách chiết plasmid bằng phương pháp kiềm (dung dịch Sol I, Sol II, Sol III, xử lý chloroform : isoamylalcohol 24:1 và kết tủa isopropanol/ethanol 70%).
  • Phản ứng cắt ghép bằng enzyme giới hạn (NcoI, HindIII, SacI, BamHI, T4 ligase) và phản ứng tái tổ hợp Gateway LR.
  • Phản ứng PCR và Colony PCR nhân đoạn gen mục tiêu.

Ký hiệu mồi	Trình tự nucleotide (5' - 3')	Mục đích sử dụng	Kích thước sản phẩm (bp)
IL7_F	TCGAGCTCGATTGTGATATT	Kiểm tra gen hIL-7 trong PCR, colony-PCR	536
IL7_R	AGGAAACACAAGTCATTCAG
IL7_BamHI_F	GAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGATCC	Kiểm tra gen hIL-7 biểu hiện tạm thời	564
IL7_BamHI_R	CCGGATCCTCCCTGAAAATACAGGTTTT
35S-SQF	CACTGACGTAAGGGATGACGC	Kiểm tra chiều gắn gen hIL-7 vào pRTRA	814
35Sterm	CTGGGAACTACTCACACA
virC_F	ATCATTTGTAGCGACT	Kiểm tra mẫu sạch khuẩn Agrobacterium	899
virC_R	AGCTCAAACCTGCTTC

• Danh mục kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu:
  • Kanamycin: 50 mg/l (chọn lọc chuyển gen).
  • Rifammycin: 50 mg/l.
  • Cefotaxime: 400 mg/l và 500 mg/l (loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium).
  • Chloramphenicol: 34 mg/l.
  • Carbenicillin: 50 mg/l.
  • Spectinomycin: 100 mg/l.
• Phân tích sinh lý và hóa sinh:
  • Đánh giá sinh trưởng của tế bào BY2 và rễ tơ theo đồ thị khối lượng tươi (FW), khối lượng khô (DW) và chiều dài rễ.
  • Điện di SDS-PAGE, Western blot sử dụng màng PVDF và kháng thể đặc hiệu kháng His-tag/c-myc, định lượng bằng ELISA reader.
  • Thử nghiệm sinh học: Đánh giá khả năng hoạt hóa tăng sinh dòng tế bào phụ thuộc IL-7 là 2E8.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu trình bày tính cấp thiết của đề tài, nêu rõ hai mục tiêu, bốn nội dung nghiên cứu, ý nghĩa lý luận, ý nghĩa thực tiễn và những đóng góp mới của luận án trong việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật để sản xuất cytokine tái tổ hợp.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật chi tiết:

• Phân loại, nguồn gốc và vai trò sinh học của các interleukin ở người (IL-1 đến IL-36).
• Đặc điểm phân tử của gen và protein hIL-7, cấu trúc thụ thể IL-7Rα/γc, con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào qua Jak/Stat và PI3K/Akt, cũng như vai trò ức chế apoptosis của hIL-7.
• Tình hình nghiên cứu ứng dụng cytokine trên thế giới và tại Việt Nam.
• Đánh giá so sánh các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp: E. coli, tế bào huyền phù BY2, hệ thống rễ tơ chuyển gen (hairy root) và cây thuốc lá chuyển gen/biểu hiện tạm thời.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết:

• Nguồn gốc các vật liệu thực vật (N. tabacum BY2, N. tabacum K326, N. benthamiana), chủng vi khuẩn (E. coli DH-5α, E. coli Rosetta-gami B, A. tumefaciens C58C1, A. rhizogenes), tế bào 2E8, các vector plasmid và hóa chất/thiết bị.
• Quy trình tin sinh học tối ưu hóa mã di truyền gen hIL-7.
• Quy trình tạo dòng và thiết kế các vector chuyển gen: pET32c(+)/IL7, pENTR221/cal/IL7, pK7WG2D.1/cal/IL7, pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP, pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.
• Quy trình chuyển gen vào tế bào BY2, tạo rễ tơ thuốc lá K326 và biểu hiện tạm thời trên lá N. benthamiana bằng Agro-infiltration.
• Các phương pháp phân tích phân tử (PCR, Western blot, ELISA), tinh sạch protein (IMAC, mITC) và thử nghiệm hoạt tính sinh học trên tế bào 2E8.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Nội dung chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Tối ưu hóa mã gen hIL-7: Chuyển đổi thành công các codon hiếm thành codon phổ biến ở thực vật, loại bỏ trình tự ATTTA, bổ sung các điểm cắt enzyme giới hạn cùng thẻ c-myc và His-tag; gen nhân tạo được tổng hợp và duy trì trong vector pBSK-IL7.
• Thiết kế vector chuyển gen: Xây dựng thành công 5 cấu trúc vector tái tổ hợp (pET32c(+)/IL7, pENTR221/cal/IL7, pK7WG2D.1/cal/IL7, pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP), kiểm tra độ chính xác qua cắt enzyme giới hạn và PCR.
• Biểu hiện hIL-7 trong E. coli Rosetta-gami B: Protein hIL-7 tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng pha tan khi nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 28°C và 37°C.
• Biểu hiện hIL-7 trong dòng tế bào huyền phù BY2: Tạo và chọn lọc thành công các dòng tế bào BY2 kháng kanamycin; kiểm tra PCR xác nhận có mặt gen hIL-7 và loại sạch khuẩn Agrobacterium bằng cặp mồi gen virC; Western blot xác nhận sự biểu hiện của hIL-7 tái tổ hợp trong sinh khối tế bào.
• Biểu hiện hIL-7 trong hệ thống rễ tơ chuyển gen: Xâm nhiễm mô lá thuốc lá K326 bằng A. rhizogenes tạo ra các dòng rễ tơ chuyển gen sinh trưởng độc lập không cần chất điều hòa sinh trưởng; phân tích Western blot xác nhận protein hIL-7 tích lũy trong rễ tơ.
• Biểu hiện tạm thời hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration: Xâm nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens vào lá N. benthamiana cho hàm lượng biểu hiện protein hIL-7 cao nhất sau 5 ngày xâm nhiễm, đạt 36,7 ng/µg protein tan tổng số.
• Tinh sạch và đánh giá hoạt tính: Protein hIL-7 dung hợp ELP được tinh sạch hiệu quả qua phương pháp mITC và IMAC; thử nghiệm sinh học cho thấy protein hIL-7 tái tổ hợp thu được có khả năng hoạt hóa và kích thích sự tăng sinh của dòng tế bào 2E8.

Kết luận và đề nghị

Tóm tắt các kết luận chính về mặt thiết kế cấu trúc, mức độ biểu hiện trên từng hệ thống nuôi cấy và đưa ra các kiến nghị cho các hướng nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về lý luận và khoa học

• Cung cấp cơ sở khoa học về việc biến đổi mã di truyền gen cytokine người (hIL-7) để tối ưu hóa mức độ biểu hiện trong hệ thống biểu hiện thực vật mà vẫn bảo toàn cấu trúc acid amin tự nhiên.
• Thiết kế thành công 3 hệ thống cấu trúc vector biểu hiện gen hIL-7 chuyên biệt cho tế bào huyền phù BY2, rễ tơ và cây thuốc lá.
• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng các hệ thống nuôi cấy thực vật khác nhau (huyền phù BY2, rễ tơ tự dưỡng, biểu hiện tạm thời qua lá) làm bioreactor sản xuất interleukin 7 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.

Đóng góp mới về thực tiễn

• Thiết lập quy trình công nghệ biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm trên các hệ thống nuôi cấy mô/tế bào thực vật.
• Xác định được phương thức biểu hiện tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng kỹ thuật Agro-infiltration đạt hiệu suất cao nhất sau 5 ngày xâm nhiễm với hàm lượng 36,7 ng/µg protein tan tổng số.
• Ứng dụng thành công phương pháp tinh sạch mITC dựa trên dung hợp peptide 100xELP để thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp có hoạt tính kích thích dòng tế bào 2E8.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tiếp tục tối ưu hóa các thông số nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, điều kiện chiếu sáng, chu kỳ nuôi cấy) nhằm nâng cao sinh khối và hiệu suất tích lũy protein trong dòng tế bào BY2 và rễ tơ.
• Nghiên cứu mở rộng quy mô tinh sạch và đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học của protein hIL-7 trên các mô hình động vật sống (in vivo).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Các nghiên cứu thực nghiệm mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa triển khai nuôi cấy sinh khối lớn trên hệ thống bioreactor công nghiệp.
• Việc đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp mới thực hiện bước đầu trên mô hình tăng sinh dòng tế bào 2E8 (in vitro), chưa tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật mô hình.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Hoàn thiện quy trình công nghệ nuôi cấy rễ tơ và tế bào huyền phù BY2 quy mô lớn nhằm thu hồi protein hIL-7 liên tục từ môi trường nuôi cấy.
• Tiến hành các thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch và ứng dụng trị liệu của protein hIL-7 tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị khoa học và thực tiễn đối với các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học, Sinh học thực vật: Tham khảo phương pháp tối ưu hóa codon cho thực vật, thiết kế vector Gateway/ELP và kỹ thuật chuyển gen (Agrobacterium).
• Giảng viên các trường khối khoa học tự nhiên, y sinh: Sử dụng làm tài liệu giảng dạy chuyên đề về protein tái tổ hợp, công nghệ tế bào thực vật và các hệ thống biểu hiện dược phẩm sinh học.
• Nhà nghiên cứu phát triển dược sinh học: Tham khảo quy trình biểu hiện tạm thời bằng Agro-infiltration và quy trình tinh sạch nhanh protein qua màng mITC.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cấu trúc phân tử và thụ thể của protein hIL-7 ở người có những đặc điểm gì nổi bật?

hIL-7 ở người là glycoprotein xoắn 4α có khối lượng phân tử 17,4 kDa, ổn định nhờ gốc N-/O-glycosyl hóa và các cầu nối disulfide. Gen hIL-7 có kích thước 33 kb gồm 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8 (vị trí 8q21). Thụ thể của hIL-7 gồm hai tiểu phần: IL-7Rα (CD127, nặng 80 kDa, định vị tại 5p13) và chuỗi chung γc (CD132). Khi hIL-7 liên kết với thụ thể, phức hệ này kích hoạt các kinase Jak1/Jak3 phosphoryl hóa gốc Y449, tạo điểm bám cho Stat5 và hoạt hóa con đường PI3K/Akt nhằm truyền tín hiệu điều hòa sinh trưởng và chống apoptosis tế bào lympho.

2. Tác giả đã thực hiện việc tối ưu hóa mã di truyền của gen hIL-7 như thế nào?

Dựa trên trình tự mRNA mã số J04156.1, tác giả sử dụng phần mềm Codon Optimization 2.0 và cơ sở dữ liệu Codon Usage Database để thay thế các codon hiếm của người bằng codon phổ biến ở thực vật mà không làm đổi trình tự acid amin. Đồng thời, trình tự phân hủy ATTTA được loại bỏ, bổ sung các vị trí cắt của enzyme giới hạn (SacI, NcoI, HindIII, BamHI) và gắn thêm đoạn mã hóa cho c-myc tag và His-tag ở đầu 3' phục vụ cho phân tích và tinh sạch.

3. Những hệ thống nuôi cấy thực vật nào đã được sử dụng và hệ thống nào cho hàm lượng biểu hiện hIL-7 cao nhất?

Luận án đã thử nghiệm biểu hiện hIL-7 trên ba hệ thống thực vật: dòng tế bào huyền phù N. tabacum BY2, hệ thống rễ tơ chuyển gen từ lá thuốc lá N. tabacum K326 (nhờ A. rhizogenes) và biểu hiện tạm thời trên lá N. benthamiana (bằng Agro-infiltration). Trong đó, hệ thống biểu hiện tạm thời trên lá cây thuốc lá qua Agro-infiltration cho hàm lượng hIL-7 cao nhất, đạt 36,7 ng/µg protein tan tổng số sau 5 ngày xâm nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens.

4. Phương pháp tinh sạch mITC dựa trên dung hợp ELP hoạt động theo nguyên lý nào?

Phương pháp mITC (Membrane-based inverse transition cycling) dựa trên đặc tính chuyển pha nhiệt đảo ngược của chuỗi polypeptide tương tự elastin (100xELP) được dung hợp với protein hIL-7. Khi thay đổi nhiệt độ hoặc nồng độ muối, protein dung hợp ELP chuyển pha và kết tụ, cho phép giữ lại và tinh sạch qua hệ thống màng lọc chuyên dụng một cách nhanh chóng mà không cần qua các bước sắc ký phức tạp.

5. Hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp thu nhận từ thực vật được đánh giá bằng phương pháp nào?

Hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp sau khi tinh sạch (qua IMAC và mITC) được đánh giá thông qua khả năng kích thích và duy trì sự tăng sinh của dòng tế bào 2E8 (dòng tế bào phụ thuộc IL-7 được cung cấp bởi Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC). Kết quả thực nghiệm xác nhận protein tái tổ hợp giữ được hoạt tính sinh học chức năng.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Huy Hoàng đã tối ưu hóa thành công trình tự mã di truyền gen hIL-7 và thiết kế các cấu trúc vector phục vụ biểu hiện protein trị liệu trong hệ thống nuôi cấy thực vật. Công trình đã chứng minh sự biểu hiện thành công của protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ chuyển gen và biểu hiện tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng kỹ thuật Agro-infiltration (đạt hàm lượng 36,7 ng/µg protein tan tổng số). Protein hIL-7 tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng phương pháp mITC và IMAC giữ được hoạt tính kích hoạt dòng tế bào 2E8, cung cấp cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm phục vụ hướng nghiên cứu sản xuất dược phẩm sinh học từ thực vật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của luận án. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án. Ý nghĩa thực tiễn. Đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16 1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước.

Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2). Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật.

Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật. Các chủng vi khuẩn, tế bào.

Các gen và vector. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị máy móc. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật. Thiết kế mồi. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp.

Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ thuốc lá. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp.

Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật.

Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.

Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2.

Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E.

coli rosetta-gami B. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC.

107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 138 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Tiếng Anh Tiếng Việt Acquired immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS syndrome mắc phải ở người A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens A. rhizogenes Agrobacteria rhizogenes AS Acetosyringone bp Base pairs Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò BY2 Bright yellow 2 Cal Calreticulin cDNA Complementary DNA ADN bổ sung Cetyl trimethyl Chất hoạt động bề mặt ammonium CTAB ammonium bromide bromide DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate DTT Dithiothreitol E.