MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của luận án. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.
Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án. Ý nghĩa thực tiễn. Đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16 1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước.
Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2). Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật.
Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật. Các chủng vi khuẩn, tế bào.
Các gen và vector. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị máy móc. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật. Thiết kế mồi. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp.
Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ thuốc lá. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp.
Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật.
Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.
Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2.
Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E.
coli rosetta-gami B. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC.
107 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 138 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Tiếng Anh Tiếng Việt Acquired immunodeficiency Hội chứng suy giảm miễn dịch AIDS syndrome mắc phải ở người A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens A. rhizogenes Agrobacteria rhizogenes AS Acetosyringone bp Base pairs Cặp bazơ BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò BY2 Bright yellow 2 Cal Calreticulin cDNA Complementary DNA ADN bổ sung Cetyl trimethyl Chất hoạt động bề mặt ammonium CTAB ammonium bromide bromide DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate DTT Dithiothreitol E.
Coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic Enzyme-linked xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên ELISA immunosorbent assay kết với enzyme ELP Elastin-like peptide Cục quản lý thực phẩm và dược FDA Food & drug administration phẩm Hoa Kỳ Fibroblast growth factor 8 Yếu tố tăng trưởng nguyên bào FGF8b isoform b sợi 8 isoform b hIL-7 Human interleukin 7 Interleukin 7 của người HEV Hepatitis E virus Virus viêm gan E HPV Human papilloma virus Virus papilloma ở người HRP Horseradish peroxidase IFN Interferon IL Interleukin Immobilized metal ion affinity IMAC Sắc kí ion cố định kim loại chromatography Isopropyl β-D-1- IPTG thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo danton Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy LB Luria and Bertani vi khuẩn theo Luria và Bertani MHC Major histocompatibility complex Phức hệ phù hợp tổ chức Membrane-based inverse transition mITC Đảo ngược theo màng cycling mRNA ARN messenger ARN thông tin Môi trường dinh dưỡng cơ bản MS Murashige and Skoog nuôi cấy mô thực vật theo Murashige và Skoog NK cell Natural killer cell tế bào giết tự nhiên Neomycin phosphotransferase Gen kháng kháng sinh nptII II gen kanamycine OD Optical density Mật độ quang PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate PBST Phosphate buffer saline + tween 20 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng trong western blot Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật RNAi RNA interference ARN can thiệp RNase Ribonuclease phân giải ARN Rpm Revolutions per minute Vòng/phút scFv Single-chain variable fragment SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis siRNA small interfering RNA TAE Tris acetate EDTA TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine UV Ultraviolet Tia tử ngoại vir Virulence region Vùng gây độc v/v Volume/volume thể tích/thể tích Môi trường nuôi cấy theo WPM Woody plant medium Mccown WT Wild type Chủng hoang dại w/v weight/volume khối lượng/thể tích YEB Yeast extract broth YMB Yeast malnitol broth v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân nhóm IL ở người.2 Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2.3 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật .1 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận án.2 Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án.3 Thành phần phản ứng LR.4 Thành phần gel SDS-PAGE.1 Xử lý mẫu protein với DTT.2 Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL-7.3 Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2.4 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tế bào BY2.5 Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá thuốc lá trên môi trường chọn lọc.6 Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.7 Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7.8 Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm).9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC.10 Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein hIL-7. 99 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc protein hIL-7.2 Thụ thể hIL-7.3 Vai trò của hIL-7.4 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2).1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.2 Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal.1 Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu hiện trong hệ thống thực vật .2 Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7 khi biểu hiện trong hệ thống thực vật.3 Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền.4 Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7.5 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.6 Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7.7 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7.8 Kết quả colony PCR pK7WG2D.9 Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 bằng enzyme SacI và HindIII.10 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.11 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.12 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.13 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme NcoI.14 Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta.15 Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli Rosetta gami B nuôi ở 37oC và 28oC.16 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot.17 Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.18 Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen.19 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng IL7_F và IL7_R.20 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng cặp mồi gen virC.21 Các dòng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày nuôi cấy.22 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2 chuyển gen (theo khối lượng tươi).23 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2 chuyển gen (theo khối lượng khô).24 Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế bào huyền phù BY2 bằng Western blot.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2 chuyển gen.26 Kết quả quá trình tạo và chọn dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7………….27 Kết quả PCR 5 dòng rễ tơ bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R.28 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi).29 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng khô).30 Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ bằng Western blot.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen 90 Hình 3.32 Kết quả colony PCR bằng cặp mồi IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R.33 Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI.34 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá bằng Western blot.35 Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC 95 Hình 3.36 Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC.37 Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot.38 Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ hợp. Tính cấp thiết của luận án Interleukin là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukin, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu hụt miễn dịch.
Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người. Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp. Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn [11].