Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein Interleukin 7 Tái Tổ Hợp Trong Hệ Thống Nuôi Cấy Thực Vật

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. MỞ ĐẦU

1.1. Tính cấp thiết của luận án

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

1.3. Nội dung nghiên cứu

1.4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án

1.4.1. Ý nghĩa lý luận

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn

1.5. Đóng góp mới của luận án

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người

2.1.1. Vai trò trong hệ miễn dịch người

2.1.2. Cơ chế hoạt động

2.1.2.1. Chemokine

2.1.2.2. Họ các yếu tố hoại tử khối u (TNF)

2.1.2.3. Họ interferon (IFN)

3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu thực vật

3.2. Các chủng vi khuẩn, tế bào

3.3. Các gen và vector

3.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

3.5. Hóa chất và thiết bị máy móc

3.6. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.7. Phương pháp nghiên cứu

3.7.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật

3.7.2. Thiết kế mồi

3.7.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp

3.7.4. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2, rễ tơ thuốc lá

3.7.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen

3.7.6. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử

3.7.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp

3.7.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp

3.7.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm

4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật

4.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá

4.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7

4.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7

4.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D

4.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

4.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp

4.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn

4.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2

4.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen

4.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration

4.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp

4.4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B

4.4.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ

4.4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá

4.4.4. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Về Interleukin 7 IL 7 Tái Tổ Hợp

Interleukin 7 (IL-7) là một cytokine quan trọng, đóng vai trò then chốt trong hệ miễn dịch. IL-7 chủ yếu tác động lên các tế bào lympho, đặc biệt là tế bào T và tế bào B, thúc đẩy sự phát triển, tồn tại và hoạt động của chúng. Sự thiếu hụt IL-7 có thể dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng về miễn dịch, làm tăng nguy cơ nhiễm trùng và các bệnh tự miễn. Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7 có ý nghĩa to lớn trong y học, mở ra tiềm năng điều trị các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và các bệnh ung thư. Các phương pháp sản xuất truyền thống gặp nhiều hạn chế về chi phí và an toàn, thúc đẩy sự tìm kiếm các hệ thống biểu hiện protein mới, hiệu quả hơn. Trong bối cảnh đó, hệ thống nuôi cấy thực vật nổi lên như một giải pháp đầy hứa hẹn, mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Vai trò sinh học của Interleukin 7 IL 7 trong miễn dịch học

Interleukin 7 (IL-7) là một cytokine thuộc họ Interleukin, đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và duy trì của tế bào lympho T và B. IL-7 kích thích sự sinh sản, biệt hóa và tồn tại của các tế bào này, đặc biệt là ở giai đoạn đầu của quá trình phát triển tế bào lympho. Bên cạnh đó, IL-7 còn có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng nội môi của tế bào T ở giai đoạn trưởng thành. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, IL-7 thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến sự sống còn và ức chế apoptosis ở tế bào lympho. Thiếu IL-7 dẫn đến suy giảm số lượng tế bào T và B, gây ra các vấn đề nghiêm trọng về miễn dịch.

1.2. Ứng dụng của Interleukin 7 IL 7 trong y học và ứng dụng lâm sàng

Protein Interleukin 7 (IL-7) tái tổ hợp có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y học, đặc biệt trong điều trị các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và ung thư. IL-7 có thể được sử dụng để tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân HIV/AIDS, bệnh nhân ung thư sau hóa trị hoặc xạ trị, và bệnh nhân sau ghép tạng. Ngoài ra, IL-7 còn được nghiên cứu sử dụng trong điều trị các bệnh tự miễn như lupus ban đỏ hệ thống và viêm khớp dạng thấp. Các nghiên cứu ứng dụng lâm sàng cho thấy IL-7 có thể cải thiện chức năng miễn dịch và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

II. Thách Thức Sản Xuất Protein Tái Tổ Hợp Interleukin 7 Hiện Nay

Sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7 phục vụ mục đích nghiên cứu và điều trị gặp nhiều thách thức. Các hệ thống biểu hiện protein truyền thống như vi khuẩn và tế bào động vật có vú có những hạn chế nhất định. Biểu hiện trong vi khuẩn thường dẫn đến việc protein bị gấp nếp sai và không có hoạt tính sinh học. Biểu hiện trong tế bào động vật có vú đòi hỏi quy trình phức tạp, chi phí cao và tiềm ẩn nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh cho người. Do đó, cần có những giải pháp thay thế hiệu quả hơn. Bài toán đặt ra là làm sao để sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7 với chi phí thấp, quy mô lớn, đảm bảo hoạt tính sinh học và an toàn cho người sử dụng.

2.1. Những hạn chế của hệ thống biểu hiện protein truyền thống

Các hệ thống biểu hiện protein truyền thống như E. coli và tế bào động vật có vú đối mặt với nhiều hạn chế trong sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7. E. coli thường không có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã cần thiết để đảm bảo hoạt tính sinh học của Interleukin 7. Tế bào động vật có vú, mặc dù có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã phức tạp, lại đòi hỏi chi phí nuôi cấy cao và thời gian sản xuất dài. Ngoài ra, còn có rủi ro nhiễm các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn khi sử dụng tế bào động vật có vú.

2.2. Yêu cầu về chất lượng và độ tinh khiết protein trong sản xuất dược phẩm

Trong sản xuất dược phẩm, độ tinh khiết protein là một yếu tố then chốt. Protein Interleukin 7 tái tổ hợp dùng trong điều trị cần phải đạt độ tinh khiết cao để đảm bảo an toàn và hiệu quả. Các tạp chất có thể gây ra các phản ứng phụ không mong muốn hoặc làm giảm hoạt tính sinh học của Interleukin 7. Do đó, quy trình tinh sạch protein phải được thiết kế cẩn thận để loại bỏ tất cả các tạp chất, bao gồm protein của tế bào chủ, DNA, RNA và các chất gây ô nhiễm khác.

III. Hệ Thống Nuôi Cấy Thực Vật Giải Pháp Biểu Hiện Gen IL 7 Tiềm Năng

Hệ thống nuôi cấy thực vật nổi lên như một giải pháp đầy hứa hẹn cho việc sản xuất protein tái tổ hợp Interleukin 7. So với các hệ thống truyền thống, hệ thống nuôi cấy thực vật có nhiều ưu điểm vượt trội như chi phí sản xuất thấp, khả năng sản xuất quy mô lớn, tính an toàn cao và khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã tương tự như ở tế bào động vật có vú. Hệ thống nuôi cấy thực vật có thể sử dụng nhiều loại cây trồng khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua... hoặc các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật như tế bào huyền phù và rễ tơ. Việc lựa chọn hệ thống phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của protein Interleukin 7 và mục tiêu sản xuất.

3.1. Ưu điểm hệ thống nuôi cấy thực vật so với các hệ thống khác

Hệ thống nuôi cấy thực vật sở hữu nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện protein khác. Chi phí sản xuất thường thấp hơn đáng kể do không đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp và đắt tiền. Khả năng sản xuất quy mô lớn cũng là một ưu điểm lớn, giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về protein Interleukin 7 tái tổ hợp. Ngoài ra, hệ thống nuôi cấy thực vật có tính an toàn cao hơn do không có nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh cho người.

3.2. Các phương pháp công nghệ sinh học thực vật để biểu hiện protein dược phẩm

Nhiều phương pháp công nghệ sinh học thực vật được sử dụng để biểu hiện protein dược phẩm, bao gồm chuyển gen ổn định và chuyển gen tạm thời. Chuyển gen ổn định tạo ra các dòng cây chuyển gen có khả năng biểu hiện protein dược phẩm liên tục qua nhiều thế hệ. Chuyển gen tạm thời, thường sử dụng Agrobacterium tumefaciens, cho phép biểu hiện protein dược phẩm nhanh chóng nhưng không ổn định. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào thời gian sản xuất, quy mô sản xuất và tính ổn định của protein dược phẩm.

3.3. Nicotiana benthamiana và vai trò trong biểu hiện protein tái tổ hợp

Nicotiana benthamiana là một loài cây thuốc lá được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong biểu hiện protein tái tổ hợp. Nicotiana benthamiana có nhiều ưu điểm như khả năng nhiễm Agrobacterium tumefaciens cao, thời gian sinh trưởng ngắn và dễ dàng nhân giống. Ngoài ra, hệ gen của Nicotiana benthamiana đã được giải trình tự, giúp cho việc thiết kế và tối ưu hóa các vector biểu hiện trở nên dễ dàng hơn.

IV. Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein Interleukin 7 Sử Dụng Agrobacterium tumefaciens

Sử dụng Agrobacterium tumefaciens là một phương pháp hiệu quả để chuyển gen IL-7 vào tế bào thực vật. Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn đất có khả năng chuyển DNA vào tế bào thực vật thông qua quá trình lây nhiễm tự nhiên. Gen IL-7 được chèn vào plasmid T-DNA của Agrobacterium tumefaciens, sau đó vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm vào lá hoặc tế bào thực vật. Sau khi lây nhiễm, T-DNA mang gen IL-7 sẽ được chuyển vào nhân tế bào thực vật và tích hợp vào nhiễm sắc thể, cho phép tế bào thực vật biểu hiện protein Interleukin 7.

4.1. Quy trình chuyển gen IL 7 vào Nicotiana benthamiana bằng Agrobacterium

Quy trình chuyển gen IL-7 vào Nicotiana benthamiana bằng Agrobacterium tumefaciens bao gồm các bước chính sau: (1) Chuẩn bị vector chuyển gen chứa gen IL-7. (2) Biến nạp vector vào Agrobacterium tumefaciens. (3) Nuôi cấy Agrobacterium tumefaciens đến mật độ thích hợp. (4) Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens vào lá hoặc tế bào Nicotiana benthamiana. (5) Nuôi cấy Nicotiana benthamiana trong điều kiện thích hợp để kích thích sự biểu hiện gen IL-7.

4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện protein Interleukin 7

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện protein Interleukin 7 trong hệ thống nuôi cấy thực vật, bao gồm cấu trúc của vector chuyển gen, chủng Agrobacterium tumefaciens được sử dụng, điều kiện nuôi cấy và đặc tính của gen IL-7. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là rất quan trọng để đạt được hiệu quả biểu hiện cao nhất. Chẳng hạn, việc sử dụng promoter mạnh và codon tối ưu hóa cho thực vật có thể làm tăng đáng kể hiệu quả biểu hiện.

V. Đánh Giá và Ứng Dụng Protein Interleukin 7 Tái Tổ Hợp Từ Thực Vật

Sau khi thu được protein Interleukin 7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật, cần tiến hành đánh giá chất lượng và hoạt tính sinh học của protein. Các phương pháp đánh giá bao gồm Western blot, ELISA, và các xét nghiệm hoạt tính sinh học in vitro. Kết quả đánh giá sẽ giúp xác định liệu protein Interleukin 7 tái tổ hợp có đủ tiêu chuẩn để sử dụng trong các ứng dụng nghiên cứu và điều trị hay không. Nếu đạt yêu cầu, protein có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và ung thư.

5.1. Phương pháp Western blot và ELISA để xác định biểu hiện protein

Western blot và ELISA là hai phương pháp phổ biến được sử dụng để xác định biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong các mẫu thực vật. Western blot cho phép xác định kích thước và độ tinh khiết protein, trong khi ELISA cho phép định lượng chính xác hàm lượng protein Interleukin 7 tái tổ hợp. Cả hai phương pháp đều dựa trên nguyên tắc sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện protein Interleukin 7.

5.2. Kiểm tra hoạt tính sinh học của Interleukin 7 Tái Tổ Hợp

Kiểm tra hoạt tính sinh học của Interleukin 7 tái tổ hợp là bước quan trọng để đảm bảo protein có khả năng thực hiện chức năng sinh học của nó. Các xét nghiệm hoạt tính sinh học thường dựa trên khả năng của Interleukin 7 kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào lympho T. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học sẽ cho biết liệu protein Interleukin 7 tái tổ hợp có đủ khả năng để sử dụng trong các ứng dụng điều trị hay không.

VI. Kết Luận Triển Vọng Protein Trị Liệu Interleukin 7 Tái Tổ Hợp

Nghiên cứu biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật mở ra nhiều triển vọng trong việc sản xuất các protein trị liệu với chi phí thấp và quy mô lớn. Mặc dù còn nhiều thách thức cần vượt qua, nhưng tiềm năng ứng dụng của protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong điều trị các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch và ung thư là rất lớn. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình biểu hiện, tinh sạch protein và đánh giá hiệu quả điều trị in vivo.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo để tối ưu hóa hệ thống biểu hiện protein thực vật

Để tối ưu hóa hệ thống biểu hiện protein thực vật, cần tập trung vào việc cải thiện cấu trúc của vector chuyển gen, lựa chọn chủng Agrobacterium tumefaciens phù hợp, điều chỉnh điều kiện nuôi cấy và sử dụng các biện pháp kỹ thuật để tăng hiệu quả biểu hiện protein. Ngoài ra, cần nghiên cứu các phương pháp để cải thiện tính ổn định protein và giảm thiểu các tác động tiêu cực đến sự phát triển của cây.

6.2. Tiềm năng ứng dụng Interleukin 7 Tái Tổ Hợp trong miễn dịch học và ứng dụng dược phẩm

Interleukin 7 Tái Tổ Hợp có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong miễn dịch học và ứng dụng dược phẩm. Trong miễn dịch học, Interleukin 7 có thể được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế điều hòa miễn dịch và phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh tự miễn. Trong ứng dụng dược phẩm, Interleukin 7 có thể được sử dụng để tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, điều trị ung thư và cải thiện hiệu quả của vaccine.