Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tác dụng ức chế enzym αglucosidase của cây chè vằng jasminum subtriplinerve trên mô hình in vitro và in silico

Khóa luận nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây chè vằng Jasminum subtriplinerve trên mô hình in vitro và in silico.

• Tác giả: Lê Minh Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Thanh Tùng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây chè vằng (Jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và in silico
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Bệnh đái tháo đường
• 1.2. Cơ chế bệnh sinh
• 1.3. Các biến chứng của bệnh ĐTĐ
• 1.4. Điều trị bệnh ĐTĐ
• 1.5. Enzym α-glucosidase và chất ức chế enzym α-glucosidase
• 1.5.1. Enzym α-glucosidase
• 1.5.2. Cấu trúc của enzym α-glucosidase
• 1.5.3. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase
• 1.5.4. Chất ức chế enzym α-glucosidase
• 1.6. Phương pháp docking phân tử
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Nghiên cứu trên mô hình in vitro
• 2.3. Nghiên cứu trên mô hình in silico
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nghiên cứu trên mô hình in vitro
• 2.4.2. Nghiên cứu trên mô hình in silico
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả quá trình chiết cao Chè vằng
• 3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng trên mô hình in vitro
• 3.3. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất trong cây Chè vằng bằng phương pháp docking phân tử
• 3.3.1. Đánh giá mô hình Docking
• 3.3.2. Tiến hành docking các hợp chất có tiềm năng ức chế alpha-glucosidase
• 3.4. Kết quả đánh giá quy tắc 5 tiêu chí của Lipinski
• 3.5. Dự đoán đặc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính (ADMET)
• 3.6. Về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase
• 3.7. Về phương pháp sàng lọc ảo
• 3.8. Về kỹ thuật docking phân tử
• 3.9. Về kết quả sàng lọc ảo
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng ức chế enzym α glucosidase của cây chè vằng

Cây chè vằng, hay còn gọi là Jasminum subtriplinerve, đã được nghiên cứu về nhiều tác dụng sinh học, trong đó có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase. Enzym này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, và việc ức chế nó có thể giúp kiểm soát mức đường huyết, đặc biệt trong điều trị bệnh đái tháo đường. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu đánh giá hiệu quả của cây chè vằng trong việc ức chế enzym này, từ đó mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh tiểu đường.

1.1. Cây chè vằng và đặc điểm sinh học của nó

Cây chè vằng (Jasminum subtriplinerve) là một loại thảo dược phổ biến ở Việt Nam. Nó chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như flavonoid và polyphenol, có khả năng chống oxy hóa và kháng viêm. Những hợp chất này có thể góp phần vào tác dụng ức chế enzym α-glucosidase.

1.2. Tầm quan trọng của enzym α glucosidase trong điều trị bệnh tiểu đường

Enzym α-glucosidase có vai trò quan trọng trong việc phân giải carbohydrate thành glucose. Việc ức chế enzym này giúp làm chậm quá trình hấp thụ glucose, từ đó giảm mức đường huyết sau bữa ăn. Điều này rất cần thiết trong điều trị bệnh đái tháo đường, giúp kiểm soát tình trạng bệnh hiệu quả hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng của cây chè vằng

Mặc dù cây chè vằng có nhiều tiềm năng trong việc ức chế enzym α-glucosidase, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ cây này. Các vấn đề như độ an toàn, hiệu quả và khả năng tương tác với các loại thuốc khác cần được xem xét kỹ lưỡng. Hơn nữa, việc thiếu các nghiên cứu lâm sàng cũng là một rào cản lớn trong việc ứng dụng thực tiễn.

2.1. Các tác dụng phụ tiềm ẩn của các chất ức chế enzym

Nhiều chất ức chế enzym α-glucosidase hiện tại như acarbose có thể gây ra tác dụng phụ như đầy bụng và tiêu chảy. Việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên như từ cây chè vằng có thể giúp giảm thiểu những tác dụng không mong muốn này.

2.2. Thiếu hụt nghiên cứu lâm sàng về cây chè vằng

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của cây chè vằng, nhưng vẫn thiếu các nghiên cứu lâm sàng để xác nhận hiệu quả và độ an toàn của nó trong điều trị bệnh tiểu đường. Điều này cần được khắc phục để có thể đưa cây chè vằng vào ứng dụng thực tiễn.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α glucosidase

Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây chè vằng được thực hiện thông qua hai phương pháp chính: mô hình in vitro và in silico. Phương pháp in vitro cho phép đánh giá trực tiếp tác dụng của các hợp chất chiết xuất từ cây chè vằng trên enzym, trong khi phương pháp in silico giúp dự đoán khả năng tương tác của các hợp chất này với enzym.

3.1. Nghiên cứu trên mô hình in vitro

Mô hình in vitro được sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các chiết xuất từ cây chè vằng. Kết quả cho thấy một số hợp chất trong cây có khả năng ức chế enzym này một cách hiệu quả, mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh tiểu đường.

3.2. Nghiên cứu trên mô hình in silico

Phương pháp docking phân tử được áp dụng để dự đoán khả năng tương tác của các hợp chất trong cây chè vằng với enzym α-glucosidase. Kết quả cho thấy một số hợp chất có ái lực mạnh với enzym, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây chè vằng có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase hiệu quả, với một số hợp chất có giá trị IC50 thấp. Điều này cho thấy tiềm năng của cây chè vằng trong việc phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Việc ứng dụng các hợp chất này vào thực tiễn có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân tiểu đường.

4.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α glucosidase

Kết quả từ mô hình in vitro cho thấy cây chè vằng có khả năng ức chế enzym α-glucosidase với hiệu quả cao. Các hợp chất chiết xuất từ cây đã được xác định có tác dụng ức chế mạnh, mở ra cơ hội cho việc phát triển sản phẩm mới.

4.2. Tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường

Với tác dụng ức chế enzym α-glucosidase, cây chè vằng có thể được phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Việc sử dụng các sản phẩm từ cây chè vằng có thể giúp giảm thiểu các tác dụng phụ của thuốc điều trị hiện tại.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về cây chè vằng

Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây chè vằng mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm tự nhiên hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Tuy nhiên, cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu lâm sàng để xác nhận hiệu quả và độ an toàn của cây chè vằng. Tương lai của nghiên cứu này có thể dẫn đến những bước tiến mới trong điều trị bệnh tiểu đường.

5.1. Triển vọng phát triển sản phẩm từ cây chè vằng

Với những kết quả khả quan từ nghiên cứu, cây chè vằng có thể trở thành nguồn nguyên liệu quý giá trong ngành dược phẩm. Việc phát triển sản phẩm từ cây chè vằng có thể giúp cải thiện sức khỏe cộng đồng.

5.2. Cần thiết phải nghiên cứu thêm về cây chè vằng

Để khẳng định hiệu quả và độ an toàn của cây chè vằng, cần thực hiện thêm nhiều nghiên cứu lâm sàng. Điều này sẽ giúp đưa cây chè vằng vào ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh tiểu đường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh lý không truyền nhiễm có xu hướng gia tăng nhanh chóng trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu của Hiệp hội Đái tháo đường Quốc tế (IDF) năm 2021, thế giới ghi nhận khoảng 537 triệu người trưởng thành (độ tuổi 20–79) sống chung với bệnh đái tháo đường. Tại Việt Nam, đái tháo đường được dự báo nằm trong nhóm bảy nguyên nhân gây tử vong và tàn tật hàng đầu vào năm 2030. Trong các phác đồ điều trị ĐTĐ typ 2, ức chế enzym $\alpha$-glucosidase — enzym xúc tác quá trình thủy phân carbohydrate thành glucose tại ruột non — là một chiến lược kiểm soát glucose huyết sau ăn phổ biến. Tuy nhiên, các thuốc ức chế $\alpha$-glucosidase tân dược hiện nay như acarbose, miglitol thường gây ra các tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa (đầy bụng, tiêu chảy, buồn nôn). Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase cao và an toàn là hướng tiếp cận cần thiết.

Cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume., họ Nhài Oleaceae) là dược liệu dân gian quen tộc tại Việt Nam, đã được chứng minh có các hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và gây độc tế bào trong một số nghiên cứu trước. Mặc dù vậy, các dữ liệu thực nghiệm về tác dụng hạ đường huyết và ức chế enzym $\alpha$-glucosidase của Chè vằng tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Nhằm cung cấp bằng chứng khoa học phục vụ phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường, khóa luận thực hiện đề tài "Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym $\alpha$ – glucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và in silico" với 2 mục tiêu cụ thể:

1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym $\alpha$-glucosidase của cây Chè vằng trên mô hình in vitro.
2. Xác định những hợp chất trong cây Chè vằng có tác dụng ức chế enzym $\alpha$-glucosidase bằng phương pháp docking phân tử (in silico).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm: Lá cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume.) thu hái tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2021, được lưu giữ tại Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Đối tượng nghiên cứu sàng lọc ảo: Cơ sở dữ liệu gồm 39 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ lá cây Chè vằng, thu thập từ các công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.
• Phạm vi không gian và thời gian: Thực nghiệm in vitro tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; mô phỏng in silico thực hiện tại Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Dược – ĐHQGHN; hoàn thành khóa luận vào tháng 06/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng bệnh sinh học đái tháo đường, sinh hóa enzym học đường tiêu hóa, lý thuyết hóa tính tự nhiên và các thuật toán tính toán cấu trúc sinh học phân tử:

• Khung lý thuyết sinh học: Bệnh lý ĐTĐ (theo tiêu chuẩn phân loại của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ - ADA 2022); cấu trúc và cơ chế xúc tác của họ enzym glycoside hydrolase (GH13 và GH31); cơ chế ức chế cạnh tranh giải phóng phân tử $\alpha$-D-glucose của các chất ức chế enzym $\alpha$-glucosidase (AGIs); quy tắc 5 tiêu chí của Lipinski (Rule of Five - RO5) về đặc tính giống thuốc của phân tử nhỏ; mô hình dự đoán dược động học và độc tính (ADMET).
• Phương pháp chiết xuất và phân lập phân đoạn: Chiết hồi lưu phân đoạn lá Chè vằng bằng cồn $70^\circ$ (EtOH 70%), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cao toàn phần, sau đó chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane, ethyl acetate (EtOAc), $n$-butanol ($n$-BuOH) và cắn nước.
• Phương pháp thực nghiệm in vitro: Đánh giá hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase nguồn gốc từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae) theo phương pháp của Moradi-Afrapoli và cộng sự (2012). Phản ứng thủy phân cơ chất $p$-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG) tạo sản phẩm màu vàng $p$-nitrophenol, đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 405 nm trên máy đo ELISA Plate Reader (Biotek). Chất đối chứng dương là acarbose. Giá trị $IC_{50}$ được xử lý và tính toán qua phần mềm TableCurve 2Dv4.
• Phương pháp mô phỏng in silico:
  • Mô hình protein thụ thể: Cấu trúc tinh thể isomaltase từ Saccharomyces cerevisiae (PDB ID: 3A4A, độ phân giải 1,30 Å và 1,60 Å) đồng kết tinh với phối tử $\alpha$-D-glucopyranose. Xử lý protein (loại nước, thêm hydro, gán điện tích) qua MGL AutoDock Tools 1.5.6. Vùng hoạt động (Grid Box) được thiết lập tại tọa độ tâm X = 21,282; Y = -0,781; Z = 18,638; kích thước $28 \times 28 \times 28$ Å, khoảng cách lưới 1 Å, bao quanh các acid amin chủ chốt (ASP215, GLU277, ASP352).
  • Chuẩn bị phối tử: 39 hợp chất được lấy mã cấu trúc từ PubChem hoặc vẽ bằng ChemOffice 19.0, tối ưu hóa cấu trúc 3D với trường lực MMFF94 trên phần mềm Avogadro.
  • Docking và đánh giá: Thực hiện ghép nối phân tử bằng AutoDock Vina. Mô hình được thẩm định qua kiểm tra tái gắn phối tử đồng tinh thể (re-docking) với chỉ số sai lệch bình phương trung bình gốc RMSD < 1,0 Å. Phân tích tương tác không gian 2D/3D bằng Discovery Studio 2020 Client và UCSF Chimera 1.15.
  • Đánh giá RO5 và ADMET: Đánh giá 5 tiêu chí Lipinski qua công cụ trực tuyến và dự đoán các chỉ số dược động học, an toàn độc tính thông qua máy chủ trực tuyến pkCSM.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các kiến thức cơ sở về bệnh đái tháo đường (định nghĩa, phân loại, cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2, các biến chứng cấp tính và mạn tính, các nhóm thuốc điều trị hiện hành). Tác giả trình bày chi tiết về cấu trúc và cơ chế xúc tác của enzym $\alpha$-glucosidase, vai trò của các thuốc ức chế AGIs (acarbose, miglitol) và tổng quan các nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase từ thực vật (như curcuminoids từ Curcuma longa, saponin từ Gypsophila oldhamiana, alkaloid từ Piper umbellatum). Chương 1 cũng trình bày nguyên lý kỹ thuật docking phân tử, thuật toán tính điểm năng lượng liên kết, quy tắc 5 của Lipinski, các thông số ADMET cùng tổng quan thực vật học, phân loại học, thành phần hóa học (terpene glycosides, flavonoid, phenylpropanoid glycosides) và các hoạt tính sinh học đã công bố của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu dược liệu lá Chè vằng thu hái tại Hà Nội, hóa chất thử nghiệm (enzym yeast $\alpha$-glucosidase, pNPG, acarbose, dung môi tinh khiết) và danh mục trang thiết bị (ELISA Biotek, máy cô quay chân không Buchi R-210, cân phân tích Shimadzu AY 129). Tác giả thiết lập quy trình chiết xuất thu 5 phân đoạn và quy trình thử nghiệm sinh hóa in vitro đo quang ở bước sóng 405 nm trên khay 96 giếng. Đối với nghiên cứu in silico, chương này mô tả chi tiết quy trình 5 bước: chuẩn bị cấu trúc thụ thể 3A4A, tối ưu hóa phối tử 3D, thiết lập thông số docking AutoDock Vina, thẩm định mô hình qua RMSD và dự đoán đặc tính ADMET/Lipinski bằng hệ thống pkCSM.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu định lượng thu được từ thực nghiệm và mô phỏng:

1. Hiệu suất chiết xuất cao Chè vằng: Từ 500 g bột lá khô, chiết bằng EtOH 70% thu được 71,79 g cao chiết toàn phần (hiệu suất 14,4%). Sau khi phân bố lỏng - lỏng thu được: 1,04 g cao phân đoạn $n$-hexane; 14,66 g cao phân đoạn EtOAc; 21,78 g cao phân đoạn $n$-BuOH và 29,81 g cắn nước.
2. Hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase in vitro: Phân đoạn $n$-hexane và EtOAc thể hiện hoạt tính ức chế mạnh vượt trội so với đối chứng dương acarbose, trong khi cao toàn phần EtOH, cao $n$-BuOH và cắn nước có hoạt tính yếu ($IC_{50} > 500$ µg/mL).

Mẫu thử nghiệm	$IC_{50}$ ($\mu\text{g/mL}$)	% ức chế ở 500 $\mu\text{g/mL}$	% ức chế ở 100 $\mu\text{g/mL}$	% ức chế ở 20 $\mu\text{g/mL}$	% ức chế ở 4 $\mu\text{g/mL}$
Phân đoạn $n$-Hexane	7,27 ± 0,71	104,60 ± 4,72	99,75 ± 3,26	89,97 ± 2,19	16,66 ± 0,10
Phân đoạn Ethyl acetate	7,42 ± 0,95	102,19 ± 2,33	99,88 ± 1,07	89,54 ± 3,51	15,57 ± 1,07
Cao toàn phần EtOH	> 500	19,92 ± 1,56	2,74 ± 0,89	2,47 ± 2,89	1,93 ± 1,24
Phân đoạn $n$-Butanol	> 500	17,14 ± 0,37	4,24 ± 0,82	2,74 ± 0,28	1,53 ± 0,16
Cắn nước	> 500	12,76 ± 1,07	0,97 ± 1,75	1,25 ± 0,19	1,73 ± 1,47
Acarbose (Chứng dương)	127,53 ± 1,73	75,20 ± 0,62	48,57 ± 1,96	20,64 ± 0,34	8,32 ± 0,62

3. Kết quả mô phỏng Docking phân tử: Thẩm định mô hình tái gắn phối tử đồng tinh thể cho giá trị RMSD = 0,5 Å (đạt tiêu chuẩn tin cậy < 1,0 Å). Docking 39 hợp chất xác định được 8 hợp chất có năng lượng liên kết thấp hơn acarbose (-8,9 kcal/mol):

Hợp chất	Năng lượng liên kết (kcal/mol)	Liên kết Hydro với Acid amin	Tương tác Kỵ nước
Rutin	-10,4	ASP352, ASP307, ARG315, THR310, GLU277	PRO312, HIS280
Nicotiflorin	-10,4	ARG315, TYR158, HIS280	THR310, GLU277
Verbascoside	-9,7	ASP307, HIS280, PRO312, GLU277, ASP352, TYR158, SER241, ASP242, SER240, THR310, VAL308, GLN279, ARG315, ARG442	PHE303, PHE178, PHE159, GLU411, TYR316, ASN415, SER311, LEU313, LYS156, SER157, PHE314
Isoquercitrin	-9,4	ASP307, ASP242, ARG315, GLU277, ASP352, ARG442	HIS280, PRO312, GLN279, SER157, LYS156, SER240, THR310, SER311, PHE303, TYR158, GLN353
Isoverbascoside	-9,2	ASP215, ASP242, SER311, SER240, ASN415, ARG442, GLU411, GLN279	(Không ghi nhận thêm)
Stigmasterol	-9,2	PRO312	GLU277, ASP352, ARG446, ASP69, GLN279, HIS280, LEU313, SER240, PHE314, ARG315, ARG213, HIS351, ASP215, ARG442, PHE159, PHE178, HIS112, TYR158
Astragalin	-9,1	THR310, ASP352, GLN353, TYR158	ARG315, PRO312
Chevangin B (3)	-9,1	ARG315, ASP242, GLU277, TYR158, ASP307	ASP352
Acarbose (Chứng dương)	-8,9	ASP352, GLU277, ASP69, ARG442, LEU313, PHE314, GLN279, ASP307, ASP242, ARG315, TYR158	PHE303, HIS280, PRO312, SER311, PHE159, VAL216, HIS112, GLN181, TYR72, PHE178, HIS351, ARG446, ASP215

4. Đánh giá quy tắc 5 tiêu chí Lipinski và ADMET: Trong 8 hợp chất trên, có 4 hợp chất thỏa mãn $\ge 2$ tiêu chuẩn của Lipinski (được phân loại là giống thuốc): Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside và Stigmasterol. Dự đoán thông số ADMET của 4 chất này cho thấy:
   • Hấp thu: Độ tan trong nước ở mức trung bình ($10^{-2}$ đến $10^{-6}$ mol/L); tính thấm Caco-2 của stigmasterol đạt 1,213 (> 0,9 - thấm tốt) và hấp thu qua đường ruột đạt 94,97%; 3 chất còn lại có tỷ lệ hấp thu ruột đạt 47,178% - 48,178%.
   • Phân bố: Thể tích phân phối ($VD_{ss}$) ở mức trung bình (0,178 đến 2,255 L/kg); cả 4 chất không qua hàng rào máu não ($\log BB < 0,3$); verbascoside không thâm nhập hệ thần kinh trung ương ($\log PS < -3$).
   • Chuyển hóa & Thải trừ: Đa số không ức chế hay là cơ chất của CYP2D6, CYP3A4 (riêng stigmasterol là cơ chất CYP3A4); stigmasterol có độ thanh thải toàn phần cao nhất (0,618 $\log\text{ mL/min/kg}$).
   • Độc tính: Cả 4 hợp chất đều âm tính với thử nghiệm đột biến gen AMES, không gây độc trên gan và không gây nhạy cảm trên da.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả phân tích và đối chiếu kết quả thực nghiệm với các tài liệu trong nước và quốc tế:

• Hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase của phân đoạn $n$-hexane ($IC_{50} = 7,27$ µg/mL) và EtOAc ($IC_{50} = 7,42$ µg/mL) mạnh hơn khoảng 17 lần so với acarbose ($IC_{50} = 127,53$ µg/mL). Điều này chứng minh các hoạt chất có hoạt tính ức chế tập trung ở phân đoạn kém phân cực và phân cực trung bình. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trên các loài cùng chi Jasminum như Jasminum cuspidatum (hạ đường huyết, lipid máu trên chuột) và Jasminum polyanthum (ức chế $\alpha$-glucosidase từ lá và hoa đạt 31,92% và 37,76%).
• Về mặt cấu trúc, các hợp chất có năng lượng liên kết thấp tương tác chặt chẽ với các acid amin thiết yếu trong trung tâm hoạt động của enzym (ASP69, GLU277, ASP352, ARG446, GLN182). Verbascoside chia sẻ 15 acid amin liên kết chung với acarbose; stigmasterol chia sẻ 17 acid amin liên kết chung. Tác giả thảo luận chi tiết về cơ chế và tiềm năng của từng chất: astragalin (flavonoid có $IC_{50}$ ức chế $\alpha$-glucosidase theo tài liệu là 15,11 $\mu\text{M}$); isoquercitrin (tương tác kỵ nước đóng vai trò chủ đạo); verbascoside (phenylpropanoid glycoside); stigmasterol (phytosterol có hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase với $IC_{50}$ theo tài liệu đạt 91,08 $\mu\text{g/mL}$).
• Khóa luận cũng bàn luận về ưu điểm và hạn chế của phương pháp sàng lọc ảo in silico: ưu điểm giúp tiết kiệm chi phí, thời gian và định hướng cấu trúc; hạn chế nằm ở sai số thuật toán và sự khác biệt giữa mô hình tính toán so với sinh lý thực tế in vivo.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

• Chiết xuất thành công cao toàn phần từ lá Chè vằng với hiệu suất 14,4% và tạo được 4 phân đoạn chiết phân bố lỏng - lỏng.
• Xác định phân đoạn $n$-hexane ($IC_{50} = 7,27 \pm 0,71$ µg/mL) và ethyl acetate ($IC_{50} = 7,42 \pm 0,95$ µg/mL) có hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase in vitro vượt trội so với acarbose ($IC_{50} = 127,53 \pm 1,73$ µg/mL).
• Xây dựng cơ sở dữ liệu 39 hợp chất của Chè vằng, sàng lọc qua AutoDock Vina phát hiện 8 hợp chất có ái lực liên kết cao hơn acarbose (-8,9 kcal/mol), trong đó rutin và nicotiflorin đạt -10,4 kcal/mol.
• Sàng lọc qua quy tắc Lipinski và ADMET đã xác định được 4 hợp chất tiềm năng giống thuốc, có hồ sơ dược động học thuận lợi và an toàn độc tính: astragalin, isoquercitrin, verbascoside và stigmasterol.

Đóng góp khoa học tự nêu

• Là một trong những công trình đầu tiên tại Việt Nam kết hợp đồng thời mô hình thực nghiệm sinh hóa in vitro và mô phỏng điện toán in silico để nghiên cứu tác dụng ức chế $\alpha$-glucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve).
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định tiềm năng hạ đường huyết của Chè vằng, xác định rõ các phân đoạn giàu hoạt tính sinh học và chỉ điểm các phối tử tiềm năng định hướng cho công tác phân lập hóa thực vật tiếp theo.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Nghiên cứu in vitro mới dừng lại ở mức độ thử nghiệm hoạt tính trên các cao chiết phân đoạn thô, chưa phân lập và thử nghiệm trực tiếp hoạt tính trên từng hợp chất tinh khiết từ mẫu dược liệu thu hái.
• Sàng lọc ảo in silico sử dụng cấu trúc tương đồng từ nấm men (Saccharomyces cerevisiae), mô hình tĩnh chưa phản ánh toàn diện các biến đổi động học phân tử và quá trình hấp thu - chuyển hóa phức tạp trong cơ thể sống.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học các hoạt chất có trong hai phân đoạn giàu hoạt tính ($n$-hexane và ethyl acetate) từ lá Chè vằng.
• Triển khai thử nghiệm đánh giá tác dụng hạ glucose huyết và cơ chế tác dụng của các phân đoạn $n$-hexane và ethyl acetate trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên ngành Dược học, Hóa dược, Dược lý học: Tham khảo quy trình chuẩn bị mẫu, chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng và phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase in vitro trên khay 96 giếng.
• Các nhà nghiên cứu mô phỏng phân tử và phát triển thuốc mới: Tham khảo quy trình sàng lọc ảo tích hợp (từ chuẩn bị protein thụ thể 3A4A, tối ưu hóa phối tử trường lực MMFF94, docking bằng AutoDock Vina, thẩm định RMSD đến đánh giá quy tắc Lipinski và ADMET bằng công cụ pkCSM).
• Các đề tài nghiên cứu phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường từ thảo dược: Cung cấp dữ liệu cơ sở về ái lực liên kết phân tử và hoạt tính sinh học của các nhóm hoạt chất flavonoid, phenylpropanoid và phytosterol trong chi Jasminum.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Phân đoạn chiết xuất nào của lá Chè vằng thể hiện tác dụng ức chế $\alpha$-glucosidase mạnh nhất trên in vitro?

Phân đoạn $n$-hexane và phân đoạn ethyl acetate (EtOAc) có hoạt tính mạnh nhất với giá trị $IC_{50}$ lần lượt là $7,27 \pm 0,71$ µg/mL và $7,42 \pm 0,95$ µg/mL. Cả hai phân đoạn này đều có tác dụng ức chế mạnh hơn nhiều lần so với chất chứng dương acarbose ($IC_{50} = 127,53 \pm 1,73$ µg/mL).

2. Có bao nhiêu hợp chất trong cây Chè vằng được đưa vào sàng lọc docking phân tử và tiêu chí lựa chọn là gì?

Tổng cộng 39 hợp chất đã được xác định cấu trúc từ lá Chè vằng (thu thập từ các công bố khoa học) được đưa vào mô phỏng docking. Kết quả chọn ra 8 hợp chất có năng lượng liên kết thấp hơn acarbose (-8,9 kcal/mol) gồm: rutin (-10,4), nicotiflorin (-10,4), verbascoside (-9,7), isoquercitrin (-9,4), isoverbascoside (-9,2), stigmasterol (-9,2), astragalin (-9,1) và chevangin B (-9,1 kcal/mol).

3. Những hợp chất nào thỏa mãn đồng thời quy tắc Lipinski và có hồ sơ ADMET tiềm năng?

Trong 8 hợp chất có năng lượng liên kết thấp nhất, có 4 hợp chất thỏa mãn từ 2 tiêu chí trở lên của quy tắc Lipinski và có đặc tính ADMET an toàn (không có độc tính AMES, không gây độc gan, không kích ứng da): astragalin, isoquercitrin, verbascoside và stigmasterol.

4. Mô hình docking phân tử trong nghiên cứu được thẩm định độ tin cậy bằng phương pháp nào?

Mô hình docking được thẩm định thông qua kỹ thuật tái gắn (re-docking) phối tử đồng tinh thể $\alpha$-D-glucopyranose vào trung tâm hoạt động của protein isomaltase (PDB ID: 3A4A). Kết quả cho giá trị sai lệch bình phương trung bình gốc RMSD là 0,5 Å (đạt tiêu chuẩn tin cậy < 1,0 Å).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Minh Ngọc đã chứng minh thực nghiệm cao phân đoạn $n$-hexane ($IC_{50} = 7,27$ µg/mL) và ethyl acetate ($IC_{50} = 7,42$ µg/mL) từ lá cây Chè vằng có tác dụng ức chế enzym $\alpha$-glucosidase in vitro mạnh vượt trội so với acarbose. Thông qua phương pháp sàng lọc ảo in silico trên 39 hợp chất, đề tài đã xác định được 4 phối tử tiềm năng đáp ứng quy tắc Lipinski và hồ sơ ADMET an toàn gồm astragalin, isoquercitrin, verbascoside và stigmasterol. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học quan trọng khẳng định tiềm năng của lá Chè vằng trong việc định hướng chiết tách hoạt chất và phát triển các sản phẩm hỗ trợ kiểm soát đường huyết cho bệnh nhân đái tháo đường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đời sống con người không ngừng thay đổi về mọi mặt văn hoá, xã hội hay chăm sóc sức khoẻ. Theo đó, mô hình bệnh tật ở Việt Nam cũng có sự thay đổi, các bệnh không truyền nhiễm đang có xu hướng gia tăng nhanh chóng. Theo thống kê của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, tính đến năm 2021, thế giới có 537 triệu người trưởng thành từ 20-79 tuổi đang sống chung với bệnh tiểu đường 1. Tại Việt Nam, bệnh đái tháo đường được dự báo sẽ trở thành một trong bảy căn bệnh gây tử vong và tàn tật hàng đầu ở Việt Nam vào năm 2030 2.

Hiện nay, để kiểm soát mức đường huyết trong điều trị bệnh tiểu đường, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ức chế enzym α-glucosidase là một chiến lược điều trị tiềm năng. Enzym α-glucosidase (AG) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân tinh bột thành glucose 3. Tuy nhiên, các hợp chất ức chế AG như miglitol, metformin và acarbose vẫn còn gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm kiếm các hợp chất nguồn gốc thiên nhiên an toàn và hiệu quả điều trị đái tháo đường đang ngày càng trở nên cấp thiết.

Tại Việt Nam, nhiều dược liệu có chứa những hợp chất có tác dụng sinh học như flavonoid, anthocyanosid, tannin, các polyphenol…được dùng làm thực phẩm, nước uống bổ dưỡng, giải độc hằng ngày, trong đó có cây Chè vằng. Các tác dụng sinh học của cây Chè vằng đã được nghiên cứu trước đây như kháng khuẩn, chống oxy hóa và gây độc tế bào 4. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của cây Chè vằng để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm tiềm năng trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Bên cạnh đó, docking phân tử đã trở thành một công cụ hiệu quả trong việc khám phá và phát triển các loại thuốc mới.

Do vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α- glucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và in silico” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau: 1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng trên mô hình in vitro. Xác định những hợp chất trong cây Chè vằng có tác dụng ức chế enzym α- glucosidase bằng phương pháp docking phân tử. Bệnh đái tháo đường 1.

Khái niệm Đái tháo đường là hội chứng các rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, đặc trưng bởi sự tăng glucose huyết do rối loạn bài tiết insulin hay sự giảm hoạt tính của insulin, hoặc cả hai 5. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh 6. Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, cần được chẩn đoán, phát hiện và điều trị theo đúng nguyên tắc để đảm bảo sức khoẻ và chất lượng cuộc sống. Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2022, ĐTĐ có thể được phân thành các loại sau 7: - ĐTĐ tuýp 1: còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin hay ĐTĐ ở ngưởi trẻ, được gây ra bởi sự phá hủy tế bào β đảo tuỵ, thường dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối.

- ĐTĐ tuýp 2: hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin. - ĐTĐ thai kỳ: được chẩn đoán vào giai đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh đái tháo đường. - ĐTĐ do các nguyên nhân khác: các nguyên nhân khác gồm hội chứng đái tháo đường đơn gen , bệnh của tuyến tuỵ ngoại tiết, bệnh nội tiết, hoặc do thuốc, hoá chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi cấy ghép nội tạng. Cơ chế bệnh sinh 1.

Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 Đái tháo đường typ 1 là một tình trạng đặc trưng bởi sự phá hủy các tế bào β đảo tụy thông qua hệ thống trung gian miễn dịch, dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin 8. Cụ thể, các tế bào bạch huyết bao quanh tiểu đảo (viêm quanh mô) và sau đó đi vào bên trong tiểu đảo, gây ra sự suy giảm tế bào β và kết quả dẫn đến tiểu đường typ 1 9. 2 Quá trình bệnh sinh được thúc đẩy thêm bởi sự tương tác giữa các yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường bên ngoài. Nghiên cứu chỉ ra rằng, hơn 60 gen có thể ảnh hưởng đến nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ typ 1, đặc biệt là những người mang kháng nguyên HLA DR4, DQ2, DQ8 10.

Bên cạnh yếu tố di truyền, một số yếu tố môi trường được coi là yếu tố nguy cơ như virus, vị trí địa lý, tuổi, cân nặng, chế độ ăn uống và tập luyện 11. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 Bệnh ĐTĐ typ 2, hay còn gọi là "bệnh tiểu đường không phụ thuộc insulin", chiếm 90–95% tổng số người mắc bệnh tiểu đường 7. Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến bệnh tiểu đường typ 2, trong đó hai yếu tố đóng vai trò quan trọng là sự đề kháng insulin và sự suy giảm chức năng bài tiết insulin 12. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cơ chế của sự kháng insulin bao gồm các thụ thể insulin bị rối loạn chức năng, các con đường truyền tín hiệu của thụ thể không ổn định và những bất thường trong vận chuyển glucose hoặc chuyển hóa glucose 13.

Các yếu tố môi trường cũng đóng vai trò lớn trong cơ chế phát sinh bệnh ĐTĐ typ 2, như béo phì, ít tập luyện thể thao, tuổi cao,…Phần lớn các bệnh nhân tiểu đường typ 2 bị thừa cân hoặc béo phì. Việc có cân nặng quá mức sẽ gây ra tình trạng kháng insulin ở một mức độ nào đó 7. Ở người bị béo phì, nồng độ axit béo tự do 13 trong máu cao sẽ ức chế cạnh tranh với glucose, gây nên tình trạng kháng insulin 13. Tăng axit béo tự do còn ức chế trực tiếp lên quá trình gắn insulin với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào và hoạt động của insulin tại tế bào gan 14.

Khi glucose huyết tăng, sẽ xuất hiện tăng bài tiết insulin để kiểm soát nồng độ glucose huyết. Nhưng sau đó, glucose huyết vẫn tiếp tục tăng cao, lúc này khả năng bài tiết insulin của tuỵ sẽ không đáp ứng kịp với mức độ tăng glucose huyết. Do ảnh hưởng của việc tăng đường huyết quá mức sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin 14.

Các biến chứng của bệnh ĐTĐ Bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ, nếu không được chăm sóc và điều trị đúng cách, sẽ gặp phải các bệnh và biến chứng nguy hiểm, lâu dài có thể dẫn đến tử vong. Một số biến chứng thường gặp của bệnh ĐTĐ có thể kể đến như: nhiễm toan ceton – nguyên nhân gây tử vong cao nhất trong các biến chứng cấp tính của ĐTĐ, hạ glucose huyết, hay các biến chứng mạn tính trên thận, mắt và tim mạch 14,6. Đối với các biến chứng mạn tính, người bệnh cần được kiểm tra sức khoẻ thường xuyên. Bệnh thận do ĐTĐ nên được đánh giá albumin niệu và mức lọc cầu thận ít nhất mỗi năm một lần.

Bệnh lý võng mạc do ĐTĐ cũng cần được khám mắt 3 toàn diện và đo thị lực định kỳ hàng năm, để có thể kiểm soát được tiến triển bệnh và giảm nguy cơ mù loà về sau 6. Nhìn chung, các biến chứng do bệnh ĐTĐ để lại sẽ ảnh hưởng một phần đến sức khoẻ và chất lượng cuộc sống của người bệnh, nếu không được điều trị tích cực sẽ gây ra hậu quả nặng nề. Điều trị bệnh ĐTĐ 1. Điều trị ĐTĐ typ 1 Do cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là tuỵ không còn khả năng bài tiết insulin để đáp ứng nhu cầu cơ thể, nên nguyên tắc điều trị chính là điều trị insulin thay thế suốt đời và phối hợp chế độ ăn uống khoa học, cũng như tập luyện thể lực một cách hợp lý 14.

Hiện nay có rất nhiều dạng insulin khác nhau, như: insulin tác dụng nhanh, tác dụng trung gian, tác dụng kéo dài. Căn cứ vào từng trường hợp cụ thể mà bác sĩ sẽ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp với từng bệnh nhân, để có được kết quả tốt nhất. Điều trị ĐTĐ typ 2 Đối với người mắc bệnh ĐTĐ typ 2, nguyên tắc điều trị chung là thay đổi lối sống, có một chế độ tập luyện và ăn uống khoa học, kết hợp sử dụng thuốc điều trị ĐTĐ typ 2. Thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 hiện nay rất đa dạng, mỗi loại thuốc có cơ chế tác dụng và tương tác khác nhau, đem lại nhiều thuận lợi trong việc lựa chọn thuốc cho bệnh nhân.

Thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 được chia làm 3 nhóm chính 14: - Nhóm thuốc kích thích bài tiết insulin: sulfonylurea, meglinid. - Nhóm thuốc làm tăng tác dụng insulin tại cơ quan đích và chống lại tình trạng kháng insulin: metformin, thiazolidindion. - Nhóm thuốc ức chế hấp thu glucose tại ruột: acarbose, miglitol. Ngoài ra, bệnh nhân ĐTĐ typ 2 cần được điều trị hỗ trợ bằng insulin trong một số trường hợp sau 14: - Trong trường hợp cấp cứu: tiền hôn mê, hôn mê do biến chứng cấp tính của bệnh ĐTĐ.

- Bệnh nhân sút cân nhiều, suy dinh dưỡng, có các bệnh nhiễm khuẩn cấp và mạn tính kèm theo. - Chuẩn bị can thiệp phẫu thuật, trong thời gian phẫu thuật và hậu phẫu. - Có biến chứng nặng ĐTĐ: bệnh lý võng mạc, suy gan nặng, suy thận nặng, bệnh lý tim mạch nặng. - Khi dùng thuốc uống liều tối đa không có tác dụng, bệnh nhân thất bại thứ phát với thuốc uống hạ glucose huyết.

4 Một số yếu tố cần xem xét khi lựa chọn thuốc hạ đường huyết 6: - Hiệu quả giảm glucose huyết - Nguy cơ hạ glucose huyết: sulfonylurea, insulin - Tăng cân: Pioglitazon, insulin, sulfonylurea - Giảm cân: GLP-1 RA, ức chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose (SGLT2i), ức chế enzym α-glucosidase (giảm cân ít) - Không ảnh hưởng nhiều lên cân nặng: ức chế enzym DPP-4, metformin - Giá thuốc: cân nhắc dựa trên chi phí và hiệu quả điều trị 1. Enzym 𝛂-glucosidase và chất ức chế enzym 𝛂-glucosidase 1. Enzym 𝜶-glucosidase Enzym -glucosidase (E.20) là một nhóm các enzym, bao gồm một số enzym như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α- glucopyranosidase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α1,4-glucosidase, α-D- glucosid glucohydrolase. Enzym -glucosidase là một exohydrolase điển hình xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate để giải phóng phân tử -D-glucose.