Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh không lây nhiễm gây tử vong đứng hàng thứ ba trên toàn cầu, chỉ xếp sau bệnh lý tim mạch và ung thư. Dữ liệu từ Hiệp hội Đái tháo đường Quốc tế (IDF) năm 2021 ghi nhận toàn thế giới có khoảng 537 triệu người mắc ĐTĐ với tổng chi phí y tế điều trị lên tới 966 tỷ USD; con số này được dự báo sẽ tăng lên 642 triệu người vào năm 2030. Tại Việt Nam, báo cáo năm 2023 của Bệnh viện Nội tiết Trung ương cho thấy cả nước có khoảng 7 triệu người mắc bệnh; trong đó hơn 55% bệnh nhân đã xuất hiện các biến chứng nghiêm trọng (34% biến chứng tim mạch, 39,5% biến chứng mắt và thần kinh, 24% biến chứng thận).

Mục tiêu cốt lõi trong kiểm soát ĐTĐ là duy trì nồng độ glucose máu lúc đói và sau ăn gần mức sinh lý nhằm kiểm soát chỉ số HbA1c và phòng ngừa biến chứng mạn tính. Một trong những biện pháp hữu hiệu là ức chế enzym α-glucosidase tại màng bàn chải ruột non—enzym xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,4-glucosid của oligosaccharid thành glucose tự do. Các thuốc ức chế enzym α-glucosidase (AGIs) đang lưu hành trên lâm sàng như acarbose, miglitol và voglibose thường gây ra tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa (đầy hơi, co thắt ruột, tiêu chảy); đồng thời từ sau năm 2000 đến nay chưa có thêm hoạt chất AGI mới nào được cấp phép lưu hành. Khung dị vòng indolin-2-on và nhóm thế sulfonamid đều là các nhóm cấu trúc mang hoạt tính sinh học đa dạng đã được ghi nhận có khả năng tương tác với trung tâm hoạt động của enzym, song sự kết hợp giữa khung indolin-2-on và nhóm sulfonamid nhằm mục đích ức chế enzym α-glucosidase vẫn chưa từng được công bố.

Từ thực tiễn đó, đề tài "Tổng hợp và thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase một số dẫn chất mới của indolin" do sinh viên Hà Thu Huyền thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Giang tại Trường Đại học Dược Hà Nội (năm 2024) tập trung giải quyết 2 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Tổng hợp được một số dẫn chất mới của indolin-2-on.
  2. Đánh giá được tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các chất tổng hợp được.

Đối tượng nghiên cứu là các dẫn chất nhân tạo của indolin-2-on mang nhóm thế sulfonamid và benzylidene. Phạm vi thực nghiệm tổng hợp hóa học, tinh chế và phân tích lý hóa được thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất (Trường Đại học Dược Hà Nội), Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội) và Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) trong năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh hóa về enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20) thuộc họ exohydrolysis, lớp glycoside hydrolase (GH), nhóm GH31 phân nhóm 1 với trình tự nhận diện WiDMNE tại tâm xúc tác. Enzym gồm hai tiểu đơn vị N tận và C tận với khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, có chức năng phân cắt liên kết α-1,4-glycosid ở đầu không khử của carbohydrat giải phóng α-D-glucose. Cơ chế tác dụng của các chất AGIs chủ yếu là ức chế cạnh tranh thuận nghịch do cấu trúc tương đồng với disaccharid hoặc oligosaccharid, làm chậm quá trình tiêu hóa đường và hấp thu glucose vào máu.

Cơ sở hóa dược của đề tài dựa trên việc thiết kế các chất ức chế không mang khung carbohydrat. Khung indolin-2-on là cấu trúc trung tâm của nhiều thuốc điều trị ung thư như sunitinib, nintedanib và đã được chứng minh có nhóm carbonyl tạo liên kết hydro thuận lợi với các acid amin thiết yếu trong khoang xúc tác của protein (chẳng hạn tương tác với Lys233 theo công bố của M. Taha năm 2018). Đồng thời, nhóm sulfonamid (-SO2NH- hoặc -SO2N<) được tích hợp dựa trên các dữ liệu thực nghiệm cho thấy nguyên tử oxy của gốc sulfonamid có khả năng tạo liên kết hydro với His348, Arg212 và nguyên tử hydro liên kết với Asp349 của protein đích.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp tổng hợp hóa học: Phản ứng sulfo hóa theo cơ chế ái điện tử ($S_E$), phản ứng sulfonamid hóa theo cơ chế thế ái nhân ($S_N2$), và phản ứng ngưng tụ Knoevenagel với xúc tác base amin vòng no.
  • Phương pháp kiểm tra và tinh chế: Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) trên bản mỏng silicagel $60\text{ }F_{254}$, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (3 : 7) và dicloromethan : methanol (9 : 1). Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng có kiểm soát pH, kết tinh lại và đo nhiệt độ nóng chảy trên thiết bị tự động EZ-Melt.
  • Phương pháp khẳng định cấu trúc: Ghi phổ hồng ngoại (IR) trên máy Shimadzu theo kỹ thuật ép viên nén KBr (4000 – 400 $\text{cm}^{-1}$); phổ khối lượng (MS) trên thiết bị LC-MSD-Trap-SL (Agilent Technologies) với chế độ ion hóa phun bụi điện tử ($ESI^+$); phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ($^1\text{H-NMR}$, 500/600 MHz) và carbon-13 ($^{13}\text{C-NMR}$, 125/150 MHz) trên máy Bruker trong dung môi $\text{CDCl}_3$ với chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
  • Phương pháp thử hoạt tính sinh học in vitro: Tiến hành trên đĩa 96 giếng dựa trên phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranosid (pNPG) 2,5 mM bởi enzym $\alpha$-glucosidase (0,2 U/ml) trong đệm phosphat 100 mM (pH 6,8) tại 37 °C trong 30 phút. Phản ứng được dừng lại bằng $\text{Na}_2\text{CO}3$, đo độ hấp thụ quang học của p-nitrophenol giải phóng ở bước sóng 410 nm trên máy đo Biotek. Mẫu thử được khảo sát ở dãy nồng độ 1, 4, 16, 64 và 256 $\mu\text{g/ml}$; acarbose đóng vai trò là chất đối chiếu; phần mềm Tablecurve được sử dụng để xử lý dữ liệu và tính giá trị $\text{IC}{50}$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương này hệ thống hóa các dữ liệu dịch tễ học và cơ sở điều trị bệnh đái tháo đường:

  • Phân loại ĐTĐ theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) gồm tuýp 1 (trung gian miễn dịch và vô căn), tuýp 2 (chiếm 90–95%), ĐTĐ thai kỳ và các thể do khiếm khuyết di truyền (gen MODY, INSR) hoặc bệnh lý nội tiết, tụy tạng.
  • Trình bày cấu trúc không gian 3D, phân bố biểu mô màng ruột và thận, cùng cơ chế xúc tác phân cắt liên kết $\alpha$-1,4-glucosid của enzym $\alpha$-glucosidase với tốc độ gia tăng gấp $10^{17}$ lần so với phản ứng không có enzym.
  • Phân loại chất ức chế enzym $\alpha$-glucosidase thành hai nhóm: nhóm cấu trúc mô phỏng đường (dẫn xuất monosaccharid, azasugar, muối thiosugar từ chi thực vật Salacia) và nhóm không mang khung carbohydrat (dẫn xuất benzimidazol, chromon, dị vòng lớn).
  • Tổng hợp các công trình tiêu biểu về hoạt tính sinh học của khung indolin-2-on: công bố của M. Taha (2018) về 20 dẫn chất indolin-2-on lai hóa oxadiazol có chất thể hiện $\text{IC}{50} = 1,25\text{ }\mu\text{M}$; nghiên cứu của J. Lin (2022) về các dẫn xuất 5-fluoro-indolin-2-on ức chế thuận nghịch; và nghiên cứu của V. Klochkov (2022) với dẫn chất indolin-2-on đạt $\text{IC}{50} = 6,78\text{ }\mu\text{M}$ trên thử nghiệm in vivo.
  • Phân tích vai trò dược lý của nhóm chức sulfonamid và các dẫn liệu chứng minh tương tác liên kết hydro với bộ ba acid amin Asp349, His348 và Arg212 tại tâm hoạt động của enzym, tạo cơ sở khoa học để thiết kế phân tử lai giữa indolin-2-on và morpholinosulfonyl.

Chương 2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Trung Quốc) và thiết lập sơ đồ tổng hợp hóa học 3 giai đoạn:

  • Giai đoạn 1: Sulfo hóa indolin-2-on bằng acid chlorosulfonic tạo tiền chất 2-oxoindolin-5-sulfonyl chlorid (H1).
  • Giai đoạn 2: Phản ứng sulfonamid hóa giữa H1 với morpholin trong dung môi dicloromethan tạo chất trung gian 5-(morpholinosulfonyl)indolin-2-on (H2).
  • Giai đoạn 3: Phản ứng ngưng tụ Knoevenagel giữa H2 và 2-nitrobenzaldehyd với xúc tác base piperidin trong dung môi ethanol tuyệt đối để thu hồi sản phẩm đích 5-(morpholinosulfonyl)-3-(2-nitrobenzylidene)indolin-2-on (H3).
  • Trình bày quy trình chi tiết về việc theo dõi phản ứng trên bản mỏng silicagel $60\text{ }F_{254}$, kỹ thuật đo phổ hồng ngoại KBr, đo phổ khối ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ trong dung môi $\text{CDCl}_3$, cùng quy trình vi phân tích enzym $\alpha$-glucosidase trên đĩa 96 giếng ở bước sóng 410 nm.

Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các thông số thực nghiệm, số liệu phân tích phổ và thảo luận cơ chế phản ứng:

  • Tổng hợp và tối ưu hóa điều kiện tạo H1: Phản ứng sulfo hóa indolin-2-on (1,00 g; 7,51 mmol) với $\text{ClSO}3\text{H}$ (12,0 ml) được khảo sát ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau. Kết quả thực nghiệm khẳng định điều kiện 70 °C trong 3 giờ đạt hiệu suất tối ưu là 57,48% (so với 30,13% ở 50 °C / 2 giờ và 45,83% ở 60 °C / 2 giờ). Khảo sát dung môi hòa tan hỗn hợp tủa thô cho thấy THF, 1,4-dioxan và aceton đều hòa tan tốt; tuy nhiên THF được lựa chọn do aceton tan vô hạn trong nước gây khó khăn cho quá trình chiết lỏng – lỏng, còn 1,4-dioxan có nhiệt độ sôi cao khó cô loại bỏ. Trong quá trình chiết tách loại tạp acid sulfonic ($R_f = 0$), dung môi dicloromethan (DCM) được chứng minh vượt trội hơn ethyl acetat nhờ tỷ trọng lớn ($d = 1,33\text{ g/cm}^3$), phân tách hai pha nhanh và không kéo theo nước vào pha hữu cơ. Thu được 1,00 g H1 dạng chất rắn màu cam, $t{\text{nc}} = 200,2 - 203,4\text{ }^\circ\text{C}$, $R_f = 0,81$ (hệ A). H1 kém bền, dễ bị thủy phân tạo tạp nên phải đưa ngay vào phản ứng tiếp theo.
  • Tổng hợp và tối ưu hóa phản ứng tạo H2: Phản ứng giữa H1 (0,50 g; 2,15 mmol) và morpholin (0,4 ml; 5,00 mmol) trong 35 ml DCM diễn ra hoàn toàn sau 2 giờ ở nhiệt độ phòng, đạt hiệu suất 73,14% (thu 0,45 g chất rắn màu trắng sữa, $t_{\text{nc}} = 216,0 - 218,2\text{ }^\circ\text{C}$, $R_f = 0,59$ trên hệ A và 0,49 trên hệ B). Nghiên cứu so sánh thấy quy trình dùng DCM ưu việt hơn hẳn tài liệu công bố trước đây (dùng 1,4-dioxan/pyridin mất 6 giờ phản ứng; hoặc dùng THF ở 80 °C mất 6 giờ nhưng phản ứng không hoàn toàn do THF dễ hút ẩm gây thủy phân H1). Đặc biệt, dung môi DCM giúp hòa tan và bảo vệ cấu trúc sulfonamid không bị thủy phân trong bước chiết rửa bằng dung dịch đệm acid $\text{pH} = 2$ nhằm loại bỏ morpholin dư thừa.
  • Tổng hợp H3 qua ngưng tụ Knoevenagel: Phản ứng giữa H2 (0,15 g; 0,53 mmol) và 2-nitrobenzaldehyd (0,12 g; 0,80 mmol) với xúc tác piperidin 1% trong ethanol tuyệt đối ở 80–90 °C trong 8 giờ, để kết tinh qua đêm, lọc rửa tủa bằng ethanol lạnh và chiết rửa bằng đệm acid $\text{pH} = 2$ để loại tạp base xúc tác piperidin (vết $R_f = 0$). Thu được 0,11 g H3 dạng chất rắn màu vàng nâu, hiệu suất 49,96%, $t_{\text{nc}} = 230,2 - 231,9\text{ }^\circ\text{C}$, $R_f = 0,67$ (hệ A).
  • Khẳng định cấu trúc hóa học bằng phân tích phổ:
    • Chất H1: Phổ IR thể hiện tín hiệu đặc trưng tại $3161\text{ cm}^{-1}$ (dao động hóa trị N-H), $3088\text{ cm}^{-1}$ (C-H thơm), $1710\text{ cm}^{-1}$ (C=O lactam), $1588\text{ cm}^{-1}$ (C=C thơm) và đặc biệt có cặp vạch tại $1358\text{ cm}^{-1}$, $1123\text{ cm}^{-1}$ của nhóm $>\text{SO}_2\text{Cl}$.
    • Chất H2: Phổ khối lượng ghi nhận pic ion phân tử $m/z = 283,3\text{ }[\text{M}+\text{H}]^+$ (phù hợp với CTPT $\text{C}{12}\text{H}{14}\text{N}_2\text{O}_4\text{S}$, khối lượng phân tử lý thuyết 282,31). Phổ IR cho dải hấp thụ N-H tại $3163\text{ cm}^{-1}$, C=O tại $1712\text{ cm}^{-1}$ và nhóm $>\text{SO}_2-\text{N}$ tại $1153\text{ cm}^{-1}$. Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($600\text{ MHz, CDCl}_3$) chỉ rõ sự biến mất của một proton vòng benzen, thay vào đó xuất hiện hai tín hiệu triplet tại $\delta\text{ }3,76\text{ ppm}$ ($J = 4,8\text{ Hz}$, $2\text{H}$) và $\delta\text{ }3,01\text{ ppm}$ ($J = 4,5\text{ Hz}$, $2\text{H}$) của vòng morpholin; tín hiệu singlet của proton N-H tại $\delta\text{ }8,31\text{ ppm}$; pic singlet của nhóm $-\text{CH}_2-$ tại C-3 ở $\delta\text{ }3,63\text{ ppm}$; các tín hiệu thơm gồm proton H-4 ($\delta\text{ }7,63\text{ ppm}$, $s$), H-6 ($\delta\text{ }7,68\text{ ppm}$, $d$, $J = 8,2\text{ Hz}$) và H-7 ($\delta\text{ }7,02\text{ ppm}$, $d$, $J = 8,4\text{ Hz}$). Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ($150\text{ MHz}$) xác nhận đủ 12 nguyên tử carbon, nổi bật với carbon carbonyl lactam tại $\delta\text{ }176,31\text{ ppm}$, carbon methylene C-3 tại $\delta\text{ }35,77\text{ ppm}$, hai cặp carbon tương đương của vòng morpholin tại $\delta\text{ }66,09\text{ ppm}$ (2C) và $\delta\text{ }46,02\text{ ppm}$ (2C).
    • Chất H3: Phổ MS cho ion $m/z = 416,4\text{ }[\text{M}+\text{H}]^+$ (phù hợp với CTPT $\text{C}{19}\text{H}{17}\text{N}_3\text{O}_6\text{S}$, M = 415,42). Phổ IR xuất hiện dải hấp thụ của nhóm $-\text{NO}_2$ tại $1520\text{ cm}^{-1}$ và $1321\text{ cm}^{-1}$, dải C=C liên hợp mới tại $1612\text{ cm}^{-1}$. Trên phổ $^1\text{H-NMR}$, tín hiệu singlet của nhóm $-\text{CH}_2-$ tại C-3 ($\delta\text{ }3,63\text{ ppm}$) hoàn toàn biến mất, đồng thời xuất hiện một pic singlet mới ở $\delta\text{ }8,23\text{ ppm}$ tương ứng với proton vinyl ($-\text{CH}=\text{C}<$); proton N-H dịch chuyển về phía trường thấp tại $\delta\text{ }8,81\text{ ppm}$. Trên phổ đồ $^{13}\text{C-NMR}$ của H3, tín hiệu của carbon lai hóa $sp^3$ tại vị trí 3 ($\delta\text{ }35,77\text{ ppm}$) hoàn toàn mất đi, thay vào đó là hệ thống 19 carbon lai hóa $sp^2$ và carbon morpholin phù hợp với cấu trúc phân tử dự kiến.
  • Kết quả thử hoạt tính sinh học in vitro: Đánh giá độ ức chế enzym $\alpha$-glucosidase của hai chất H2 và H3 so với acarbose được ghi nhận chi tiết theo từng mức nồng độ, chứng minh rõ mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính sinh học.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã tổng hợp thành công 3 dẫn chất của indolin-2-on ở quy mô phòng thí nghiệm, kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy và giải mã đầy đủ cấu trúc hóa học bằng hệ thống phổ nghiệm hiện đại.

Tên hợp chất Danh pháp hóa học Công thức phân tử Hiệu suất tổng hợp (%) Nhiệt độ nóng chảy ($^\circ\text{C}$) Giá trị $R_f$ (hệ n-hexan : EtOAc = 3:7) Độ ức chế ở 256 $\mu\text{g/ml}$ (%) Giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{g/ml}$)
H1 2-oxoindolin-5-sulfonyl chlorid $\text{C}_8\text{H}_6\text{ClNO}_3\text{S}$ 57,48% 200,2 – 203,4 0,81 — —
H2 5-(morpholinosulfonyl)indolin-2-on $\text{C}{12}\text{H}{14}\text{N}_2\text{O}_4\text{S}$ 73,14% 216,0 – 218,2 0,59 0% > 256
H3 5-(morpholinosulfonyl)-3-(2-nitrobenzylidene)indolin-2-on $\text{C}{19}\text{H}{17}\text{N}_3\text{O}_6\text{S}$ 49,96% 230,2 – 231,9 0,67 42% > 256
Acarbose (đối chứng) — — — — — 63% 156,16 ± 5,43

Chi tiết thử nghiệm ức chế enzym $\alpha$-glucosidase theo nồng độ khảo sát:

Hợp chất Nồng độ thử ($\mu\text{g/ml}$) Phần trăm ức chế (%) Giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu\text{g/ml}$)
H2 (H2T01) 256
64
16
4
1		 0
0
0
0
0		 > 256
H3 (H2T02-238) 256
64
16
4
1		 42
31
10
0
0		 > 256
Acarbose 256 63 156,16 ± 5,43

Về mặt đóng góp học thuật và cải tiến quy trình:

  • Tác giả đã cải tiến quy trình tổng hợp chất trung gian H2 bằng cách thay thế dung môi 1,4-dioxan kết hợp pyridin độc hại (phải phản ứng kéo dài 6 giờ) bằng dung môi dicloromethan (DCM) thực hiện trực tiếp ở nhiệt độ phòng với thời gian rút ngắn xuống 2 giờ và hiệu suất đạt 73,14%.
  • Thiết lập quy trình tinh chế chiết phân bố lỏng – lỏng có kiểm soát pH kết hợp dung môi DCM giúp bảo vệ nhóm chức sulfonamid và sulfonyl chlorid không bị thủy phân bởi môi trường nước và acid, khắc phục được hiện tượng tạo tạp sulfonic acid và phân hủy dẫn chất.
  • Dữ liệu thử nghiệm sinh học đã cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp về mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR): bản thân khung indolin-2-on gắn nhóm thế 5-morpholinosulfonyl đơn độc (chất H2) hoàn toàn không có tác dụng ức chế enzym $\alpha$-glucosidase (độ ức chế 0% tại mọi nồng độ); tuy nhiên khi gắn thêm nhóm thế benzylidene thông qua cầu nối liên hợp tại vị trí C-3 (chất H3), hoạt tính ức chế enzym được cải thiện rõ rệt (đạt 42% ở nồng độ 256 $\mu\text{g/ml}$).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Số lượng dẫn chất được tổng hợp và đánh giá hoạt tính sinh học còn khiêm tốn (mới khảo sát được 2 chất H2 và H3 ở thử nghiệm in vitro).
  • Hiệu suất phản ứng ngưng tụ Knoevenagel tạo dẫn chất H3 chỉ đạt mức trung bình (49,96%).
  • Sản phẩm H3 tạo thành là hỗn hợp đồng phân hình học quanh liên kết đôi $>\text{C}=\text{CH}-$ (đồng phân $Z$ và $E$), khóa luận chưa phân tách và cô lập riêng rẽ từng dạng đồng phân lập thể để thử hoạt tính sinh học độc lập.
  • Hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase của dẫn chất H3 vẫn ở mức thấp hơn đáng kể so với chất đối chiếu lâm sàng acarbose ($\text{IC}_{50} > 256\text{ }\mu\text{g/ml}$ so với $156,16\text{ }\mu\text{g/ml}$).

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

  • Tiếp tục nghiên cứu, mở rộng phản ứng ngưng tụ Knoevenagel giữa chất trung gian H2 với các dẫn chất benzaldehyd mang các nhóm thế có tính chất hút hoặc đẩy điện tử khác nhau nhằm tối ưu hóa ái lực liên kết với enzym.
  • Nghiên cứu quy trình sắc ký hoặc kết tinh phân đoạn nhằm phân tách triệt để hai đồng phân hình học $Z$ và $E$ của các dẫn chất ngưng tụ tại vị trí C-3.
  • Tiếp tục thiết kế và tổng hợp các dẫn chất mới trên khung indolin-2-on nhằm nâng cao hoạt tính ức chế enzym $\alpha$-glucosidase và xác định toàn diện quy luật tương quan cấu trúc – tác dụng.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tư liệu thực nghiệm hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Dược học, Hóa dược, Hóa học hữu cơ và Công nghệ Hóa học:

  • Kỹ thuật xử lý nhóm chức nhạy ẩm: Cung cấp giải pháp thực nghiệm chi tiết trong việc kiểm soát dung môi, nhiệt độ và kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng đa tầng pH để xử lý và tinh chế nhóm sulfonyl chlorid và sulfonamid kém bền với nước.
  • Điều kiện phản ứng sulfonamid hóa thân thiện: Quy trình phản ứng tạo sulfonamid bằng DCM tại nhiệt độ phòng trong 2 giờ là tài liệu tham khảo có tính ứng dụng cao cho các đề tài tổng hợp dẫn chất sulfonamid dị vòng.
  • Bộ dữ liệu phân tích phổ chuẩn tắc: Các dữ liệu chi tiết về độ dịch chuyển hóa học ($\delta$), hằng số tương tác spin-spin ($J$), vân phổ $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, các dải hấp thụ hồng ngoại IR và phân mảnh ion ESI-MS của khung indolin-2-on là tài liệu tham chiếu tin cậy cho công tác định danh cấu trúc các dẫn chất indolin tương tự.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phản ứng sulfonamid hóa tổng hợp chất H2 lại lựa chọn dung môi dicloromethan (DCM) ở nhiệt độ phòng thay vì dùng 1,4-dioxan/pyridin hoặc THF?
Trả lời: Theo khảo sát thực nghiệm trong khóa luận, khi dùng dung môi 1,4-dioxan kết hợp pyridin, phản ứng phải kéo dài 6 giờ và còn vết nguyên liệu mờ, đồng thời pyridin gây phức tạp cho quá trình xử lý chiết loại tạp. Khi dùng THF đun hồi lưu ở 80 °C trong 6 giờ, nguyên liệu H1 vẫn còn nhiều do phân tử THF chứa nguyên tử oxy dễ tạo liên kết hydro với nước, dẫn đến hiện tượng dung môi bị ẩm và làm thủy phân nhóm sulfonyl chlorid của H1. Trong khi đó, DCM là dung môi trơ, rẻ tiền, phản ứng diễn ra hoàn toàn chỉ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng; ngoài ra DCM có tỷ trọng lớn ($1,33\text{ g/cm}^3$) giúp tách pha nhanh và bảo vệ cấu trúc sulfonamid không bị thủy phân khi chiết rửa bằng pha nước acid ($\text{pH} = 2$).

2. Dấu hiệu phổ học nào trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân chứng minh phản ứng ngưng tụ Knoevenagel giữa H2 và 2-nitrobenzaldehyd tạo chất H3 đã xảy ra thành công?
Trả lời: Dấu hiệu nhận biết rõ nhất là:

  • Trên phổ $^1\text{H-NMR}$: Tín hiệu singlet của 2 proton nhóm methylene ($-\text{CH}_2-$) tại vị trí số 3 của khung indolin ở vùng $\delta\text{ }3,63\text{ ppm}$ trên chất H2 hoàn toàn biến mất ở chất H3; đồng thời xuất hiện một tín hiệu singlet mới ở vùng trường thấp $\delta\text{ }8,23\text{ ppm}$ đặc trưng cho proton của liên kết vinyl ($-\text{CH}=\text{C}<$).
  • Trên phổ $^{13}\text{C-NMR}$: Pic của carbon methylene $sp^3$ ở vị trí C-3 với độ dịch chuyển $\delta\text{ }35,77\text{ ppm}$ trên phổ H2 hoàn toàn mất đi, thay vào đó là tín hiệu của các carbon lai hóa $sp^2$ trong hệ liên hợp mới.

3. Khó khăn lớn nhất trong việc tinh chế sản phẩm sulfo hóa H1 (2-oxoindolin-5-sulfonyl chlorid) là gì và tác giả đã giải quyết như thế nào?
Trả lời: Nhóm sulfonyl chlorid rất nhạy cảm với độ ẩm và dễ bị thủy phân tạo thành acid sulfonic (tạp chất có $R_f = 0$ trên SKLM) khi tiếp xúc với nước trong quá trình dập tắt phản ứng bằng nước đá. Tác giả đã giải quyết bằng cách hòa tan khối tủa thô trong hỗn hợp dung môi THF và DCM, sau đó tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng với dung dịch đệm kiềm nhẹ ($\text{pH} = 8 - 9$) hai lần. Pha nước kiềm nhẹ sẽ giữ lại tạp chất acid sulfonic, còn sản phẩm H1 nằm lại trong pha hữu cơ DCM/THF, sau đó pha hữu cơ được làm khan bằng $\text{Na}_2\text{SO}_4$ và cất quay thu được H1 tinh khiết.

4. Khóa luận rút ra kết luận gì về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR) của các dẫn chất thử nghiệm đối với enzym $\alpha$-glucosidase?
Trả lời: Dữ liệu sinh học cho thấy:

  • Chất H2 mang cấu trúc sulfonamid đơn thuần trên khung indolin-2-on hoàn toàn không thể hiện hoạt tính ức chế enzym ở tất cả các nồng độ thử nghiệm từ 1 đến 256 $\mu\text{g/ml}$ (độ ức chế 0%).
  • Chất H3 khi được đưa thêm nhóm thế 2-nitrobenzylidene vào vị trí C-3 đã gia tăng đáng kể khả năng ức chế enzym, đạt độ ức chế 42% tại nồng độ 256 $\mu\text{g/ml}$, 31% ở 64 $\mu\text{g/ml}$ và 10% ở 16 $\mu\text{g/ml}$. Điều này chứng minh cấu trúc benzylidene liên hợp tại vị trí số 3 là yếu tố quyết định tạo nên hoạt tính sinh học ức chế $\alpha$-glucosidase cho khung indolin-2-on sulfonamid.

Kết luận

Khóa luận của sinh viên Hà Thu Huyền đã hoàn thành đầy đủ hai mục tiêu đặt ra thông qua việc xây dựng quy trình tổng hợp tối ưu, tinh chế và khẳng định cấu trúc lý hóa bằng hệ thống phổ IR, MS, $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ cho 3 dẫn chất của indolin-2-on gồm 2-oxoindolin-5-sulfonyl chlorid (H1), 5-(morpholinosulfonyl)indolin-2-on (H2) và 5-(morpholinosulfonyl)-3-(2-nitrobenzylidene)indolin-2-on (H3). Thử nghiệm sinh học in vitro khẳng định dẫn chất sulfonamid H2 không có hoạt tính, trong khi sự hiện diện của nhóm thế benzylidene ở vị trí C-3 trên chất H3 đã làm tăng đáng kể khả năng ức chế enzym $\alpha$-glucosidase (đạt 42% ở nồng độ 256 $\mu\text{g/ml}$). Kết quả nghiên cứu đã đóng góp các dữ liệu thực nghiệm quan trọng về kỹ thuật tổng hợp hóa dược và định hướng cho việc tiếp tục phát triển các dẫn chất indolin-2-on mới có hiệu lực ức chế enzym cao hơn trong điều trị bệnh đái tháo đường.