ĐẶT VẤN ĐỀ Đông máu nghĩa là máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc nhờ chuyển fibrinogen hòa tan trong huyết tương thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác của thrombin, nhằm hạn chế mất máu ở nơi có tổn thương thành mạch, giữ sự toàn vẹn của mạch máu [5], [6]. Bình thường, quá trình đông máu cân bằng với quá trình chống đông. Sự cân bằng sinh lý giữa hai hệ thống này làm cho máu luôn giữ ở dạng lỏng để lưu hành trong hệ tuần hoàn và duy trì sự sống. Sự mất cân bằng dẫn đến hậu quả tắc mạch hoặc chảy máu.
Tình trạng tăng đông (thrombophilia) là một nhóm không đồng nhất các rối loạn bẩm sinh hoặc mắc phải dẫn đến khuynh hướng hình thành cục máu đông không thích hợp trong vòng tuần hoàn. Tình trạng tăng đông thứ phát dẫn đến huyết khối bao gồm huyết khối động mạch, huyết khối tĩnh mạch và huyết khối ở các vi quản [24]. Hiện nay chi phí điều trị cho các bệnh lý liên quan đến huyết khối tắc mạch như nhồi máu cơ tim, tắc mạch máu não, thuyên tắc động mạch phổi, hội chứng đông máu rải rác trong lòng mạch,. đang là gánh nặng đối với người bệnh, gia đình và xã hội.
Do đó, nghiên cứu phát triển thuốc mới có tác dụng chống đông, chống kết tập tiểu cầu là rất cần thiết. Việt Nam là quốc gia nằm ở khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, có nhiều điều kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Việt Nam có khoảng 3000 loài cây thuốc, trong đó có rất nhiều loài đặc hữu quý hiếm, có giá trị cao [22], [23]. Đã từ lâu trong Y học cổ truyền, nhóm thuốc “hoạt huyết”, “phá huyết” được sử dụng để điều trị các trường hợp “huyết ứ”, “huyết lưu thông khó khăn” [18].
Do đó cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các thuốc có tác dụng chống đông, chống kết tập tiểu cầu từ dược liệu. Tuy nhiên hiện nay chưa có nhiều bài nghiên cứu để sàng lọc các dược liệu có tiềm năng. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống đông máu và chống kết tập tiểu cầu in vitro của một số dược liệu” được tiến hành với mục tiêu sau: Mục tiêu 1. Đánh giá tác dụng chống đông in vitro của một số dược liệu.
Đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro của một số dược liệu. Đại cương về quá trình đông máu 1. Sinh lý quá trình đông máu Đông máu nghĩa là máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc nhờ chuyển fibrinogen hòa tan trong huyết tương thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác của thrombin, nhằm hạn chế mất máu ở nơi có tổn thương thành mạch, giữ sự toàn vẹn của mạch máu [6], [10]. Các yếu tố tham gia vào hoạt động hoạt hóa đông máu ❖ Nội mạc và dưới nội mạc huyết quản: Khi có tổn thương thành mạch, làm lớp dưới nội mạc tiếp xúc với máu sẽ hoạt hóa tiểu cầu và các yếu tố tiếp xúc [6].
❖ Tiểu cầu: Chức năng dưỡng mạch, tạo nút tiểu cầu, tham gia vào quá trình đông máu và ảnh hưởng đến quá trình tiêu sợi huyết [6]. ❖ Các yếu tố đông máu huyết tương Phần lớn các yếu tố đông máu là tiền chất của các enzym phân giải protein, và được sản xuất chủ yếu ở gan. Các yếu tố đông máu có thể chia thành 3 nhóm: Bốn yếu tố tham gia vào giai đoạn đầu, giai đoạn do tiếp xúc được gọi chung là các yếu tố tiếp xúc đó là: yếu tố XI, XII, prekallikrein, kininogen có đặc tính không phụ thuộc vào vitamin K khi tổng hợp, không phụ thuộc vào Ca2+ trong quá trình hoạt hóa, ổn định tốt trong huyết tương lưu trữ và là những yếu tố bền vững [6], [59]. Nhóm prothrombin gồm các yếu tố II, VII, IX, X.
Đây là các yếu tố phụ thuộc vào vitamin K khi tổng hợp cần có Ca2+ trong quá trình hoạt hóa, trừ yếu tố II các yếu tố còn lại không bị tiêu thụ trong quá trình đông máu (có mặt trong huyết thanh), ổn định trong huyết tương lưu trữ [6], [59]. Nhóm fibrinogen gồm các yếu tố I, V, VIII, XIII. Thrombin có tác dụng qua lại với tất cả các yếu tố này. Chúng bị tiêu thụ trong quá trình đông máu (không có mặt trong huyết thanh), yếu tố V và VIII mất hoạt tính trong huyết tương lưu trữ [6], [59].
❖ Các yếu tố tổ chức Sự tiếp xúc của máu với tổ chức dập nát sẽ phát động quá trình đông máu, chất có vai trò là một lipoprotein gọi là yếu tố tổ chức hay thromboplastin ngoại sinh. Yếu tố 2 tổ chức không có hoạt tính men nhưng tác động như một đồng yếu tố trong hoạt hóa yếu tố VII, X [6]. ❖ Ion canxi Ion canxi tạo thuận lợi cho các protein phụ thuộc vào vitamin K kết hợp với phospholipid. Chúng cũng can thiệp vào các phản ứng không liên quan đến protein phụ thuộc vào vitamin K, cần thiết cho sự thể hiện hoạt tính men của yếu tố XIIIh, cho sự ổn định yếu tố V và phức hệ yếu tố Willebrand và yếu tố VIII [6].
Các giai đoạn của quá trình hình thành cục máu đông ❖ Giai đoạn cầm máu ban đầu Khi thành mạch bị tổn thương, lập tức xảy ra quá trình cầm máu ban đầu. Hiện tương co mạch xảy ra cục bộ ngay chỗ mạch máu tổn thương làm dòng chảy của máu nhỏ lại [6]. Tiếp theo là hiện tượng kết tập tiểu cầu. Đây là quá trình phức tạp với phản ứng kết dính tiểu cầu, phản ứng giải phóng, ngưng tập tiểu cầu và làm hoạt hóa quá trình đông máu [6].
Sinh lý quá trình ngưng tập tiểu cầu sẽ được trình bày ở mục 1. ❖ Giai đoạn đông máu huyết tương Hình 1. Sơ đồ quá trình đông máu [13]. Quá trình đông máu huyết tương được chia thành 3 giai đoạn: 3 Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase Bước này có tới trên 10 yếu tố gây đông máu bị hoạt hóa để tạo ra một phức hợp phân tử mới gọi là chất hoạt hóa prothrombin.
Chức năng của nó là biến prothrombin thành thrombin. Có hai cơ chế hình thành chất hoạt hóa prothrombin là cơ chế nội sinh và cơ chế ngoại sinh. - Con đường đông máu ngoại sinh: Khi các mô, thành mạch tổn thương tiếp xúc với máu sẽ giải phóng thromboplastin mô, một phức hợp đặc biệt bao gồm phospholipid màng và lipoprotein. Dưới tác dụng của thromboplastin, yếu tố VII được hoạt hóa thành VIIh, VIIh cùng ion Ca2+ kích hoạt yếu tố X thành yếu tố X hoạt hóa (Xh) [12], [59].
- Con đường đông máu nội sinh Khi máu bị tổn thương hoặc tiếp xúc với bề mặt lạ làm hoạt hóa tiểu cầu và yếu tố XII thành XIIh. Yếu tố XIIh cùng với ion Ca2+ hoạt hóa yếu tố XI, IX thành XIh và IXh. Tiểu cầu giải phóng phospholipid tiểu cầu cùng với IXh, ion Ca2+, VIIIh (hoạt hóa bởi thrombin) tham gia hoạt hóa yếu tố X thành Xh [6], [12]. Sau khi yếu tố X được hoạt hóa qua con đường đông máu nội sinh hoặc ngoại sinh sẽ cùng ion Ca2+, phospholipid tiểu cầu, Vh (hoạt hóa bởi thrombin) tạo thành phức hợp prothrombinase.
Giai đoạn II: Hình thành thrombin Prothrombin là một protein huyết tương được hình thành bởi gan ở dạng zymogen không hoạt động [36], [59]. Phức hệ prothrombinase cùng ion Ca2+ chuyển prothrombin thành thrombin là một enzyme có hoạt tính. Thrombin được tạo ra hoạt hóa yếu tố V và VIII tạo ra Vh và VIIIh là đồng yếu tố tham gia hình thành prothrombinase [59]. Giai đoạn III.
Hình thành fibrin Thrombin thủy phân fibrinogen thành fibrin đơn phân, Các fibrin đơn phân liên kết với nhau tạo thành fibrin trùng hợp. Thrombin cùng ion Ca2+ hoạt hóa yếu tố XIII thành XIIIh, XIIIh có vai trò giữ sự ổn định của fibrin trùng hợp. Mạng lưới fibrin sau khi được hình thành và ổn định bao bọc lấy các tế bào máu tạo nên cục máu đông, bịt các vết thương thành mạch làm ngưng chảy máu [6], [59]. ❖ Giai đoạn tan cục máu đông Tiêu sợi huyết là một quá trình enzym làm tan cục máu đông fibrin thành các sản phẩm phân giải fibrin (Fibrin degradation products, FDP) bởi plasmin có nguồn gốc từ 4 plasminogen liên kết fibrin trong gan.
Phản ứng này được xúc tác bởi chất hoạt hóa plasminogen tPA hoặc urokinase (u-PA) được giải phóng từ nội mô mạch máu. Mục đích cơ bản của giai đoạn này là làm tan fibrin và trả lại sự thông thoáng cho mạch máu [6], [59]. Các chất ức chế đông máu sinh lý Hệ thống chống đông máu đóng vai trò điều hòa hoạt động đông máu do đó ngăn ngừa nguy cơ huyết khối và tắc mạch. Chất ức chế chống đông máu được chia thành hai nhóm chính.
Nhóm thứ nhất gồm các chất ức chế serin protease, những chất này tạo thành phức hợp với enzym đông máu, bao gồm antithrombin III (AT III), alpha 1 – anti trypsin (α1-AT), alpha 2 – macro globullin (α2-MG), chất ức chế C1, đồng yếu tố heparin. Nhóm thứ hai gồm 2 protein huyết tương (Protein C và Protein S) và một protein màng là thrombomodulin. Hệ thống protein này can thiệp bằng cách làm bất hoạt hai đồng yếu tố Vh, VIIIh [6], [59]. Sinh lý quá trình ngưng tập tiểu cầu Có 3 giai đoạn chính trong quá trình ngưng tập tiểu cầu: Sự kết dính, hoạt hóa tiểu cầu và sự kết tụ [24], [42], [86].
❖ Sự kết dính Với sự tiếp xúc của collagen dưới nội mô khi tế bào bị tổn thương với vWF, sẽ xảy ra sự thay đổi cấu trúc trong các đa phân tử có trọng lượng phân tử cao, sau đó là sự tương tác giữa vWF và các thụ thể GP Ib/IX/V. Điều này cho phép kết dính tiểu cầu với collagen dưới nội mô thông qua tương tác với vWF. VWF, GP Ib/ IX/V, collagen và GP Ia/IIa cũng như GP VI đều tham gia vào bước này [24], [42], [86]. ❖ Kích hoạt tiểu cầu: Trong quá trình này, có sự gia tăng nồng độ canxi trong tế bào chất cùng với sự thay đổi hình dạng của tiểu cầu, kéo dài các pseudopodia (chân giả) và giải phóng các chất hóa học như adenosine diphosphate (ADP), thromboxan A2, serotonin, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu và thrombin.
Các phân tử tín hiệu này liên kết với các thụ thể ở màng ngoài của các tiểu cầu đang nghỉ lưu thông gần đó. Các tiểu cầu trước đó không hoạt động trở nên được kích hoạt và bắt đầu kết tụ. Những tác động này được thực hiện qua trung gian của một số hệ thống truyền tin, cuối cùng dẫn đến tăng nồng độ canxi và giảm nồng độ cAMP trong tiểu cầu [24], [42], [86].