Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Quá trình đông máu là một cơ chế sinh lý thiết yếu nhằm bảo vệ cơ thể, chuyển fibrinogen hòa tan trong huyết tương thành mạng lưới sợi fibrin không hòa tan dưới sự xúc tác của enzyme thrombin để bịt kín vị trí thành mạch bị tổn thương. Trong điều kiện sinh lý bình thường, hệ thống đông máu và hệ thống chống đông máu luôn duy trì trạng thái cân bằng động. Khi mất cân bằng xảy ra theo chiều hướng tăng đông (thrombophilia), các cục máu đông bất thường sẽ hình thành trong lòng mạch, dẫn đến các bệnh lý huyết khối nguy hiểm như nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não, thuyên tắc động mạch phổi và hội chứng đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC). Các bệnh lý này gây ra tỷ lệ tử vong cao và tạo gánh nặng y tế lớn. Các thuốc chống đông và chống kết tập tiểu cầu tổng hợp hiện hành (như heparin, dẫn xuất coumarin, thuốc kháng P2Y12, aspirin) tuy có hiệu lực rõ rệt nhưng tiềm ẩn nhiều tác dụng không mong muốn nghiêm trọng, điển hình là nguy cơ xuất huyết và biến chứng giảm tiểu cầu do heparin (HIT).

Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú với hơn 3.000 loài cây thuốc. Trong Y học cổ truyền, nhóm dược liệu có công năng “hoạt huyết”, “phá huyết” từ lâu đã được ứng dụng để điều trị chứng “huyết ứ”, “huyết hành trệ”. Dù vậy, các nghiên cứu thực nghiệm sàng lọc đồng bộ trên quy mô hiện đại để so sánh và xác định các dược liệu tiềm năng nhất vẫn còn hạn chế.

Đề tài khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ “Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống đông máu và chống kết tập tiểu cầu in vitro của một số dược liệu” của sinh viên Tô Ngọc Tú (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2022) được triển khai nhằm thực hiện 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Đánh giá tác dụng chống đông in vitro của một số dược liệu.
  2. Đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro của một số dược liệu.

Nghiên cứu được tiến hành trên 11 loài dược liệu tiềm năng thu hái tại các địa phương của Việt Nam (và một mẫu nhập từ Trung Quốc), thực hiện phối hợp tại Khoa Dược lý Sinh hóa (Viện Dược liệu), Bộ môn Dược lực (Trường Đại học Dược Hà Nội), Bộ môn Sinh lý (Trường Đại học Y Hà Nội) và Trung tâm Huyết học và Truyền máu (Bệnh viện Bạch Mai). Đối tượng khảo sát sinh học gồm huyết tương thỏ Newzealand White (cho thử nghiệm đông máu) và huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh (cho thử nghiệm ngưng tập tiểu cầu).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và sinh lý học đông - cầm máu

Khóa luận vận dụng lý thuyết kinh điển về sinh lý cầm máu và ngưng tập tiểu cầu:

  • Cơ chế đông máu huyết tương: Phân chia thành con đường đông máu ngoại sinh (được kích hoạt khi mô tổn thương giải phóng thromboplastin mô, phối hợp yếu tố VII hoạt hóa yếu tố X; thăm dò qua thời gian prothrombin - PT, PT% và PT-INR), con đường đông máu nội sinh (kích hoạt khi tiếp xúc bề mặt lạ qua chuỗi yếu tố XII, XI, IX, VIII hoạt hóa yếu tố X; thăm dò qua thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa - aPTT), và con đường chung (hình thành phức hợp prothrombinase biến prothrombin thành thrombin, chuyển tiếp fibrinogen thành fibrin, thăm dò qua thời gian thrombin - TT).
  • Sinh lý kết tập tiểu cầu: Gồm 3 giai đoạn: kết dính tiểu cầu (qua trung gian collagen, yếu tố Von Willebrand và thụ thể GP Ib/IX/V), kích hoạt tiểu cầu (thay đổi hình dạng, giải phóng ADP, thromboxan A2, giảm cAMP, tăng $Ca^{2+}$ nội bào), và kết tụ tiểu cầu (liên kết chéo fibrinogen qua thụ thể glycoprotein GP IIb/IIIa).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

                             [ 11 Dược liệu ]
        [ Chiết Nước & Cồn 50% ]            [ Chiết Cồn 70% & Cột D101 ]
        (Nghệ trắng, Cốt khí củ,            (Tam thất, Tam thất hoang,
         Nghệ ten đồng, Nga truật,           Đan sâm; Lá hồng chuẩn hóa)
                         [ 18 Mẫu Cao Chiết ]
             [ Sàng lọc tác dụng chống đông in vitro ]
           (Máu thỏ, đo PT & aPTT trên máy SYSMEX CA 50)
           (Nồng độ khảo sát: 5,0 ➔ 2,5 ➔ 1,3 ➔ 0,6 ➔ 0,3 mg/ml)
              [ Chọn các cao tiềm năng mạnh nhất ]
        [ Đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro ]
      (Máu người tình nguyện, kích tập bằng ADP trên máy Aggregometer)
  • Chuẩn bị mẫu cao chiết (18 mẫu từ 11 dược liệu):
    • Phương pháp chiết nước và chiết cồn 50%: Áp dụng cho 7 dược liệu (Nghệ trắng, Cốt khí củ, Nghệ ten đồng, Nga truật, Hạt vải, Gắm trắng, Gắm đen). Chiết 3 lần liên tiếp với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 10/8/8 (ml/g), cô hồi lưu và bay hơi dung môi thu cao tổng.
    • Phương pháp chiết cồn 70%: Áp dụng cho Tam thất, Tam thất hoang và Đan sâm; chiết hồi lưu 2 lần (tỷ lệ 7/1 ml/g) trong 2 giờ, cô áp suất giảm ở $50^\circ\text{C}$ và sấy chân không.
    • Phương pháp điều chế cao định chuẩn Lá hồng (DKF): Chiết ethanol 70%, cô dịch chiết về độ cồn 40%, hấp phụ qua cột hạt nhựa D101, rửa giải bằng ethanol 60%, cô đặc và sấy khô (độ ẩm < 5%). Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao DKF đạt 21% (định lượng bằng HPLC).
  • Phương pháp đánh giá tác dụng chống đông in vitro:
    • Mô hình: Máu thỏ Newzealand White (1,8 - 2,2 kg) lấy qua tĩnh mạch tai, chống đông bằng natri citrat 3,8% (tỷ lệ 1:9), ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút lấy huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP).
    • Kỹ thuật đo: Đo độ tán xạ ánh sáng trên máy phân tích đông máu bán tự động SYSMEX CA 50 (Nhật Bản). Huyết tương được ủ với mẫu thử theo tỷ lệ thể tích 11:1.
    • Quy trình sàng lọc nồng độ: Bắt đầu ở nồng độ 5 mg/ml; các mẫu có hoạt tính được pha loãng bậc 2 liên tiếp xuống 2,5; 1,3; 0,6; 0,3 mg/ml để tìm nồng độ tối thiểu còn tác dụng.
    • Chất đối chứng: Nước muối sinh lý 0,9% (chứng âm) và Heparin 1,5 UI/ml (chứng dương).
  • Phương pháp đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro:
    • Mô hình: Máu toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh (có văn bản đồng thuận), chống đông bằng natri citrat 3,8%. Ủ mẫu thử ở nồng độ 1,5 mg/ml và 3 mg/ml với máu toàn phần trước khi ly tâm tách huyết tương giàu tiểu cầu (PRP - 700 vòng/phút, 10 phút) và huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP - 3.000 vòng/phút, 10 phút).
    • Kỹ thuật đo: Đo độ truyền quang trên máy đo ngưng tập tiểu cầu Aggregometer (Chrono-Log, Mỹ), kích tập bằng ADP (0,5 mg/ml) ở $37^\circ\text{C}$.
    • Chất đối chứng: Cao bán thành phẩm thuốc Angobin (chiết cồn 80% rễ củ Đương quy Nhật Bản) ở liều 3 mg/ml (chứng dương).
  • Xử lý số liệu: Biểu diễn kết quả dưới dạng số trung bình và sai số chuẩn ($\bar{X} \pm SE$), so sánh bằng t-test Student qua Microsoft Excel, mức ý nghĩa thống kê xác lập tại $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết sinh lý học hệ đông - cầm máu, các nhóm thuốc chống đông đường uống/tiêm, thuốc ức chế kết tập tiểu cầu hiện đại (aspirin, clopidogrel, abciximab, cilostazol) và tổng quan các nghiên cứu thực vật hóa học, dược lý của 11 loài dược liệu:

  1. Lá hồng (Diospyros kaki L.): Chứa flavonoid, kéo dài thời gian TT và aPTT.
  2. Nga truật (Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe): Chứa curcumin, ermanin, ức chế kết tập tiểu cầu do collagen và acid arachidonic.
  3. Nghệ trắng (Curcuma aromatica Salisb.): Chứa tinh dầu, curdione và curcumin, có hoạt tính ức chế kết tập tiểu cầu do PAF, thrombin, collagen.
  4. Nghệ ten đồng (Curcuma aeruginosa Roxb): Chứa terpenoid, ức chế gắn kết thụ thể PAF.
  5. Gắm trắng (Gnetum macrostachyum Hook.): Chứa stilbenoid (resveratrol, isorhapotigenin), ức chế tiểu cầu do thrombin.
  6. Gắm đen (Gnetum montanum Markgr.): Chứa alkaloid, flavonoid, stilbenoid chống oxy hóa.
  7. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Feng): Chứa saponin triterpenoid kiểu oleanane, kéo dài aPTT, PT.
  8. Tam thất (Panax notoginseng (Burkill) FHChen): Chứa ginsenoside Rg1, Rg2, notoginsenoside R1 chống đông và ức chế tiểu cầu.
  9. Hạt vải (Litchi chinensis Sonn.): Chứa polyphenol, chiết xuất quả kéo dài thời gian đông máu.
  10. Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge): Chứa tanshinone IIA, salvianolic acid ức chế huyết khối và ngưng tập tiểu cầu.
  11. Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.): Chứa resveratrol, polydatin, ức chế kết tập tiểu cầu và kéo dài thời gian đông máu nội sinh.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày xuất xứ các mẫu dược liệu thu thập từ Lạng Sơn, Hà Nội, Hải Dương, Đồng Nai, Sơn La, Hà Giang và Trung Quốc; quy trình chiết xuất thu 18 mẫu cao; thông số kỹ thuật của trang thiết bị đo (SYSMEX CA 50, Chrono-Log Aggregometer) cùng hóa chất xét nghiệm chuẩn (Thromborel S, Dade Actin FS, CaCl2, Heparin Sigma-Aldrich, ADP Chrono-PAR).

Kết quả nghiên cứu và Bàn luận

1. Hiệu suất chiết xuất cao dược liệu

Quy trình điều chế thu được 18 mẫu cao với độ ẩm dao động từ 3,12% đến 11,70%. Hiệu suất chiết tương đối đạt từ 9,415% (cao nước Hạt vải) đến 38,75% (cao cồn Tam thất hoang):

STT Tên dược liệu Dạng cao chiết Khối lượng dược liệu (g) Khối lượng cao thu được (g) Độ ẩm (%) Hiệu suất chiết (%)
1 Nghệ trắng Cao nước 30,02 3,9509 5,95 13,16
Cao cồn 50% 30,04 4,9128 3,12 16,35
2 Cốt khí củ Cao nước 30,06 7,4106 7,89 24,65
Cao cồn 50% 30,06 7,5400 11,70 25,08
3 Nghệ ten đồng Cao nước 30,06 3,4900 4,24 11,61
Cao cồn 50% 30,03 4,3698 4,04 14,55
4 Nga truật Cao nước 30,02 3,3400 5,47 11,12
Cao cồn 50% 30,04 3,3327 4,16 11,08
5 Hạt vải Cao nước 30,03 2,8274 5,09 9,415
Cao cồn 50% 30,05 5,1506 4,19 17,14
6 Gắm trắng Cao nước 30,00 5,1537 5,44 17,17
Cao cồn 50% 30,06 5,3545 3,61 17,79
7 Gắm đen Cao nước 30,04 5,7857 6,89 19,24
Cao cồn 50% 30,09 7,2681 3,13 24,16
8 Tam thất Cao cồn 70% 100,00 28,02 3,81 28,02
9 Tam thất hoang Cao cồn 70% 100,00 38,75 3,65 38,75
10 Đan sâm Cao cồn 70% 100,00 36,20 3,34 36,20
11 Lá hồng Cao định chuẩn (DKF) 10.000,00 302,00 3,13 3,02

2. Kết quả sàng lọc tác dụng chống đông máu in vitro

  • Ở nồng độ 5 mg/ml: Có 7/18 mẫu cao thể hiện tác dụng kéo dài thời gian đông máu có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$):
    • Nhóm kéo dài aPTT (đường nội sinh): Cao nước Nghệ trắng (aPTT = $32,88 \pm 2,41$ s so với chứng $16,45 \pm 0,43$ s; tăng tỷ lệ aPTTb-c lên $1,22 \pm 0,09$), Cao cồn Hạt vải ($22,05 \pm 0,95$ s), Cao nước Hạt vải ($22,83 \pm 1,03$ s), Cao cồn Cốt khí củ ($19,10 \pm 0,76$ s), Cao định chuẩn Lá hồng ($19,05 \pm 0,33$ s).
    • Nhóm kéo dài PT (đường ngoại sinh): Cao nước Nghệ ten đồng (PT = $8,60 \pm 0,16$ s so với chứng $7,50 \pm 0,06$ s, PT-INR tăng lên 0,74, PT% giảm xuống 193,73%) và Cao cồn 50% Nghệ ten đồng (PT = $8,60 \pm 0,16$ s).
    • Các cao không thể hiện tác dụng ở 5 mg/ml: Nga truật (nước/cồn), Gắm trắng (nước/cồn), Gắm đen (nước/cồn), Tam thất, Tam thất hoang, Đan sâm, Nghệ trắng cồn 50%, Cốt khí củ chiết nước.
  • Khảo sát ở các nồng độ pha loãng thấp hơn:
    • Nồng độ 2,5 mg/ml: Còn 4 cao giữ hoạt tính gồm Cao nước Nghệ trắng (aPTT = $23,05 \pm 1,22$ s), Cao định chuẩn Lá hồng (aPTT = $18,60 \pm 0,56$ s), Cao nước Nghệ ten đồng (PT = $10,93 \pm 0,30$ s) và Cao cồn Nghệ ten đồng (PT = $10,85 \pm 0,28$ s).
    • Nồng độ 1,3 mg/ml: Còn 2 cao giữ hoạt tính gồm Cao nước Nghệ trắng (aPTT = $19,00 \pm 0,62$ s) và Cao định chuẩn Lá hồng (aPTT = $18,03 \pm 0,43$ s).
    • Nồng độ 0,6 mg/ml: Duy nhất Cao nước Nghệ trắng còn tác dụng kéo dài aPTT ($17,25 \pm 0,21$ s so với chứng $16,03 \pm 0,23$ s, $p < 0,01$).
    • Nồng độ 0,3 mg/ml: Không còn mẫu cao nào thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.
Mức nồng độ tối thiểu còn tác dụng chống đông in vitro của các cao chiết:

3. Kết quả đánh giá tác dụng chống kết tập tiểu cầu in vitro

Thử nghiệm trên máu người tình nguyện với chất kích tập ADP cho thấy:

  • Cao nước Nghệ ten đồng (3 mg/ml): Thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất, làm giảm % ngưng tập tiểu cầu xuống $12,25 \pm 3,32%$ (tương ứng mức ức chế $79,50 \pm 5,59%$ so với chứng $62,50 \pm 8,45%$). Tuy nhiên, ở nồng độ 1,5 mg/ml, mẫu này chưa biểu hiện tác dụng (mức ức chế $-4,72%$).
  • Cao nước Nghệ trắng: Ức chế ngưng tập tiểu cầu phụ thuộc nồng độ rõ rệt: ở 1,5 mg/ml đạt mức ức chế $25,65 \pm 9,75%$; ở 3 mg/ml đạt mức ức chế $56,01 \pm 6,98%$ (% ngưng tập giảm còn $27,00 \pm 4,72%$).
  • Cao đối chứng Angobin (3 mg/ml): Đạt mức ức chế $29,85 \pm 9,62%$ (% ngưng tập là $45,67 \pm 11,69%$).

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các kết quả thực nghiệm nổi bật

Mẫu thử nghiệm Nồng độ thử nghiệm Thông số đánh giá Giá trị đo được ($\bar{X} \pm SE$) Giá trị lô chứng ($\bar{X} \pm SE$) Mức độ ý nghĩa ($p$)
Cao nước Nghệ trắng 5 mg/ml aPTT (s) $32,88 \pm 2,41$ $16,45 \pm 0,43$ $p < 0,01$
2,5 mg/ml aPTT (s) $23,05 \pm 1,22$ $16,23 \pm 0,28$ $p < 0,01$
1,3 mg/ml aPTT (s) $19,00 \pm 0,62$ $16,43 \pm 0,36$ $p < 0,05$
0,6 mg/ml aPTT (s) $17,25 \pm 0,21$ $16,03 \pm 0,23$ $p < 0,01$
3 mg/ml % ức chế kết tập TC $56,01 \pm 6,98%$ - $p < 0,05$
Cao nước Nghệ ten đồng 5 mg/ml PT (s) $8,60 \pm 0,16$ $7,50 \pm 0,06$ $p < 0,01$
2,5 mg/ml PT (s) $10,93 \pm 0,30$ $7,65 \pm 0,19$ $p < 0,001$
3 mg/ml % ức chế kết tập TC $79,50 \pm 5,59%$ - $p < 0,01$
Cao cồn Nghệ ten đồng 5 mg/ml PT (s) $8,60 \pm 0,16$ $7,50 \pm 0,06$ $p < 0,001$
2,5 mg/ml PT (s) $10,85 \pm 0,28$ $7,65 \pm 0,19$ $p < 0,001$
Cao định chuẩn Lá hồng 5 mg/ml aPTT (s) $19,05 \pm 0,33$ $16,45 \pm 0,43$ $p < 0,01$
1,3 mg/ml aPTT (s) $18,03 \pm 0,43$ $16,43 \pm 0,36$ $p < 0,05$
Cao đối chứng Angobin 3 mg/ml % ức chế kết tập TC $29,85 \pm 9,62%$ - $p < 0,05$
Heparin (chứng dương) 1,5 UI/ml aPTT (s) $37,45 \pm 2,35$ $16,45 \pm 0,43$ $p < 0,01$
PT (s) $9,10 \pm 0,23$ $7,50 \pm 0,06$ $p < 0,01$

Đóng góp khoa học của khóa luận

  1. Phát hiện mới về Nghệ trắng (Curcuma aromatica): Lần đầu tiên chứng minh cao chiết nước Nghệ trắng có hoạt tính chống đông máu in vitro chọn lọc theo con đường nội sinh mạnh nhất trong số các dược liệu khảo sát, duy trì hoạt tính kéo dài aPTT ở nồng độ thấp đến 0,6 mg/ml, đồng thời có khả năng ức chế kết tập tiểu cầu phụ thuộc liều ($56,01%$ ở 3 mg/ml).
  2. Phát hiện mới về Nghệ ten đồng (Curcuma aeruginosa): Là dược liệu duy nhất trong nghiên cứu kéo dài thời gian đông máu theo con đường ngoại sinh (kéo dài PT, tăng PT-INR, giảm PT%), đồng thời thể hiện khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu do ADP rất cao ($79,50%$ ở nồng độ 3 mg/ml, vượt trội so với chất đối chứng Angobin).
  3. Cung cấp dữ liệu sàng lọc in vitro hệ thống: Xác nhận tác dụng kéo dài aPTT của Cao định chuẩn Lá hồng (đạt ngưỡng 1,3 mg/ml), Cao cồn Cốt khí củ và Hạt vải; cung cấp cơ sở dữ liệu đối chiếu hoạt tính giữa các phân đoạn chiết nước và chiết cồn của 11 dược liệu hoạt huyết Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Nghiên cứu mới dừng lại ở các thử nghiệm sàng lọc in vitro, chưa đánh giá hiệu lực chống huyết khối và tính an toàn trên mô hình động vật sống (in vivo).
    • Khảo sát chủ yếu thực hiện trên dịch chiết thô (cao nước, cao cồn), chưa tiến hành phân lập và tinh chế sâu từng phân đoạn hoạt chất tinh khiết chịu trách nhiệm chính (trừ cao Lá hồng đã định chuẩn hàm lượng flavonoid).
    • Do hạn chế về thời gian và kinh phí, thử nghiệm ức chế kết tập tiểu cầu mới chỉ thực hiện trên 2 mẫu cao chiết có tiềm năng cao nhất (Nghệ trắng và Nghệ ten đồng) với một tác nhân kích tập duy nhất là ADP, chưa thử nghiệm trên các chất kích tập khác như collagen, acid arachidonic hoặc thrombin.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Tiếp tục chiết xuất phân đoạn, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hoạt chất chính có hoạt tính chống đông và chống ngưng tập tiểu cầu từ Nghệ trắng và Nghệ ten đồng.
    • Mở rộng thử nghiệm ức chế kết tập tiểu cầu in vitro với nhiều loại tác nhân kích tập khác nhau (collagen, PAF, thrombin, arachidonic acid).
    • Triển khai đánh giá tác dụng chống đông máu, chống tạo huyết khối in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm (chuột cống/thỏ gây huyết khối tĩnh mạch/động mạch hoặc mô hình gây đông máu rải rác nội mạch bằng hóa chất).
    • Tiến hành các thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn nhằm định hướng phát triển chế phẩm thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cho:

  • Sinh viên, học viên sau đại học và nghiên cứu viên ngành Dược học (chuyên ngành Dược lý, Dược liệu, Hóa thực vật): Cung cấp tài liệu tham khảo về quy trình chiết xuất cao dược liệu, kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương giàu/nghèo tiểu cầu, quy trình vận hành phương pháp đo quang bán tự động (SYSMEX CA 50 và Chrono-Log Aggregometer) trong sàng lọc thuốc tác động trên hệ huyết học.
  • Các nhóm nghiên cứu phát triển thuốc Y học cổ truyền: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tác dụng sinh học của nhóm thuốc hoạt huyết, đặc biệt là nguồn nguyên liệu Nghệ trắng và Nghệ ten đồng, hỗ trợ định hướng khai thác nguồn tài nguyên dược liệu bản địa để phát triển các sản phẩm phòng ngừa huyết khối tắc mạch.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã sàng lọc bao nhiêu dược liệu và điều chế được bao nhiêu mẫu cao chiết?

Khóa luận đã tiến hành thu thập và nghiên cứu trên 11 loài dược liệu tiềm năng (gồm Lá hồng, Nga truật, Nghệ trắng, Nghệ ten đồng, Gắm trắng, Gắm đen, Tam thất, Tam thất hoang, Hạt vải, Cốt khí củ, Đan sâm). Từ 11 dược liệu này, tác giả đã điều chế được 18 mẫu cao chiết khác nhau (gồm 14 mẫu cao nước và cao cồn 50%, 3 mẫu cao cồn 70% và 1 mẫu cao định chuẩn lá hồng).

2. Mẫu cao chiết nào thể hiện tác dụng chống đông máu theo con đường ngoại sinh?

Cao nước và cao cồn 50% của Nghệ ten đồng (Curcuma aeruginosa) là hai mẫu duy nhất trong 18 mẫu cao khảo sát thể hiện tác dụng chống đông máu theo con đường ngoại sinh. Ở nồng độ 5 mg/ml và 2,5 mg/ml, hai mẫu cao này kéo dài thời gian PT ($8,60$ s ở 5 mg/ml và $>10,8$ s ở 2,5 mg/ml so với chứng $7,50 - 7,65$ s), làm tăng chỉ số PT-INR và giảm chỉ số PT% có ý nghĩa thống kê ($p < 0,01$).

3. Dược liệu nào có tác dụng chống đông nội sinh mạnh nhất và nồng độ tối thiểu còn tác dụng là bao nhiêu?

Cao chiết nước của Nghệ trắng (Curcuma aromatica) thể hiện tác dụng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (aPTT) mạnh nhất trong toàn bộ các dược liệu nghiên cứu. Ở nồng độ 5 mg/ml, cao nước Nghệ trắng kéo dài aPTT lên $32,88 \pm 2,41$ s (so với chứng $16,45 \pm 0,43$ s). Đây cũng là mẫu cao duy nhất còn duy trì hoạt tính chống đông in vitro ở nồng độ thấp đến 0,6 mg/ml (aPTT đạt $17,25 \pm 0,21$ s so với chứng $16,03 \pm 0,23$ s, $p < 0,01$).

4. Kết quả ức chế kết tập tiểu cầu của Nghệ ten đồng và Nghệ trắng đạt mức bao nhiêu so với chất đối chứng?

Khi thử nghiệm trên máu người tình nguyện với chất kích thích ADP ở nồng độ 3 mg/ml:

  • Cao nước Nghệ ten đồng đạt tỷ lệ ức chế kết tập tiểu cầu cao nhất là $79,50 \pm 5,59%$ (độ ngưng tập giảm còn $12,25%$).
  • Cao nước Nghệ trắng đạt tỷ lệ ức chế $56,01 \pm 6,98%$ (độ ngưng tập giảm còn $27,00%$).
  • Cả hai mẫu cao này đều thể hiện hiệu lực ức chế cao hơn mẫu chứng dương là cao Angobin 3 mg/ml (đạt mức ức chế $29,85 \pm 9,62%$).

5. Cao định chuẩn Lá hồng (DKF) được điều chế như thế nào và thể hiện hoạt tính ra sao?

Lá hồng sau khi sấy khô và xay nhỏ được chiết 3 lần với ethanol 70%, cô dịch chiết về độ cồn 40%, sau đó hấp phụ lên cột chứa hạt nhựa D101, rửa tạp bằng ethanol 30% và rửa giải hoạt chất bằng ethanol 60%. Dịch giải hấp được cô cách thủy và sấy khô thu được cao khô DKF có hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 21% (xác định bằng HPLC). Trên thực nghiệm đông máu in vitro, cao DKF kéo dài thời gian aPTT có ý nghĩa thống kê ở các mức nồng độ 5 mg/ml, 2,5 mg/ml và 1,3 mg/ml ($p < 0,05$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Tô Ngọc Tú đã hoàn thành việc sàng lọc thực nghiệm in vitro tác dụng chống đông máu của 18 mẫu cao chiết từ 11 loài dược liệu trên máu thỏ và tác dụng chống kết tập tiểu cầu trên máu người. Công trình lần đầu tiên phát hiện cao nước Nghệ trắng có khả năng kéo dài thời gian đông máu nội sinh (aPTT) mạnh mẽ ở nồng độ thấp đến 0,6 mg/ml cùng hiệu lực ức chế tiểu cầu đạt 56,01%, đồng thời xác định Nghệ ten đồng là dược liệu duy nhất kéo dài thời gian đông máu ngoại sinh (PT) và có hoạt tính ức chế kết tập tiểu cầu nổi bật (79,50%). Các kết quả thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về phân lập hoạt chất và thử nghiệm in vivo đối với các dược liệu thuộc chi Curcuma trong phòng ngừa và điều trị huyết khối.