Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ microcarrier tại công ty hanvet

Luận văn thạc sĩ VNUA nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ microcarrier tại công ty Hanvet.

• Tác giả: Đặng Thùy Chinh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bá Hiên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc Dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ Microcarrier tại công ty Hanvet
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và trong nước
• 2.1.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
• 2.1.2. Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
• 2.2. Bệnh dịch tả lợn
• 2.2.1. Vi rút dịch tả lợn
• 2.2.2. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh DTL
• 2.2.3. Triệu chứng và bệnh tích bệnh DTL
• 2.3. Tổng quan về sản xuất vắc xin
• 2.3.1. Lịch sử hình thành và phát triển vắc xin
• 2.3.2. Sơ lược về các loại vắc xin hiện nay trên thế giới
• 2.3.3. Một số loại vắc xin DTL
• 2.4. Tổng quan nuôi cấy tế bào
• 2.4.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
• 2.4.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
• 2.4.3. Điều kiện nuôi cấy tế bào
• 2.4.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
• 2.4.5. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
• 2.5. Hệ thống Microcarrier
• 2.5.1. Lý do lựa chọn phương pháp nuôi cấy trên Microcarrier
• 2.5.2. Sự phát triển của các hạt chất mang
• 2.5.3. Một số ứng dụng của Microcarrier
• 3. NỘI DUNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình gây nhiễm Vi rút trên tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier
• 3.4. Đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau khi thu hoạch
• 3.5. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.5.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.5.3. Địa điểm nghiên cứu
• 3.5.4. Thời gian nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 3.6.2. Phương pháp gây nhiễm
• 3.6.3. Phương pháp đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau đông khô
• 3.6.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 4.1.1. Nghiên cứu tốc độ khuấy và lưu lượng khí
• 4.1.2. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào
• 4.1.3. Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 4.1.4. Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 4.2. Nghiên cứu quy trình gây nhiễm vi rút dịch tả lợn trên Microcarrier
• 4.2.1. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút và pH của môi trường duy trì
• 4.2.2. Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL
• 4.2.3. Xác định đường cong sinh trưởng của vi rút DTL
• 4.3. Đánh giá một số chỉ tiêu vắc xin dịch tả lợn sau đông khô
• 4.3.1. Tính an toàn vắc xin trên lợn
• 4.3.2. Xác định tính sinh miễn dịch của vắc xin DTL
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu sản xuất vắc xin dịch tả lợn

Nghiên cứu sản xuất vắc xin dịch tả lợn là một lĩnh vực quan trọng trong ngành thú y, nhằm bảo vệ đàn lợn khỏi bệnh dịch tả lợn, một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Việc phát triển vắc xin hiệu quả không chỉ giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế mà còn bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Công nghệ nuôi cấy tế bào trên microcarrier đã mở ra hướng đi mới trong sản xuất vắc xin, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm.

1.1. Tình hình dịch bệnh dịch tả lợn hiện nay

Dịch tả lợn là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi lợn. Tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp, với nhiều ổ dịch xuất hiện trên toàn cầu. Tại Việt Nam, bệnh đã gây ra nhiều thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, yêu cầu cần có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Vai trò của vắc xin trong phòng chống dịch tả lợn

Vắc xin đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát dịch tả lợn. Việc tiêm phòng định kỳ giúp tạo miễn dịch cho đàn lợn, giảm thiểu nguy cơ lây lan dịch bệnh. Tuy nhiên, chất lượng vắc xin và quy trình sản xuất cần được cải thiện để đảm bảo hiệu quả.

II. Thách thức trong sản xuất vắc xin dịch tả lợn

Sản xuất vắc xin dịch tả lợn gặp nhiều thách thức, từ việc lựa chọn chủng vi rút phù hợp đến quy trình sản xuất. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, chất lượng nguyên liệu và công nghệ sản xuất đều ảnh hưởng đến hiệu quả của vắc xin. Đặc biệt, việc sử dụng công nghệ microcarrier trong nuôi cấy tế bào là một giải pháp tiềm năng nhưng cũng đặt ra nhiều yêu cầu kỹ thuật.

2.1. Khó khăn trong việc lựa chọn chủng vi rút

Việc lựa chọn chủng vi rút phù hợp để sản xuất vắc xin là rất quan trọng. Các chủng vi rút cần phải có khả năng gây miễn dịch tốt nhưng không gây bệnh cho lợn. Điều này đòi hỏi phải có nghiên cứu kỹ lưỡng và thử nghiệm lâm sàng.

2.2. Yêu cầu về công nghệ sản xuất vắc xin

Công nghệ sản xuất vắc xin cần phải đảm bảo tính an toàn và hiệu quả. Việc áp dụng công nghệ microcarrier trong nuôi cấy tế bào giúp tăng năng suất và giảm chi phí sản xuất, nhưng cũng cần phải kiểm soát chặt chẽ các yếu tố môi trường.

III. Phương pháp nuôi cấy tế bào trên microcarrier

Công nghệ microcarrier là một phương pháp tiên tiến trong nuôi cấy tế bào, cho phép tăng cường khả năng sinh trưởng và sản xuất vi rút. Phương pháp này sử dụng các hạt chất mang để tạo điều kiện tối ưu cho tế bào phát triển, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất vắc xin.

3.1. Nguyên lý hoạt động của công nghệ microcarrier

Công nghệ microcarrier hoạt động dựa trên nguyên lý tạo ra một môi trường nuôi cấy tối ưu cho tế bào. Các hạt microcarrier cung cấp bề mặt cho tế bào bám dính và phát triển, giúp tăng cường năng suất vi rút.

3.2. Quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên microcarrier

Quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên microcarrier bao gồm các bước chuẩn bị môi trường, cấy tế bào, theo dõi sự phát triển và thu hoạch vi rút. Các thông số như pH, tốc độ khuấy và lưu lượng khí cần được điều chỉnh để đạt hiệu quả tối ưu.

IV. Kết quả nghiên cứu sản xuất vắc xin dịch tả lợn

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng công nghệ microcarrier trong sản xuất vắc xin dịch tả lợn mang lại nhiều lợi ích. Các chỉ tiêu về an toàn và hiệu quả của vắc xin được cải thiện đáng kể, giúp nâng cao khả năng bảo vệ cho đàn lợn.

4.1. Đánh giá hiệu quả của vắc xin sản xuất

Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc xin dịch tả lợn sản xuất từ công nghệ microcarrier có hiệu quả cao trong việc tạo miễn dịch cho lợn. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy tỷ lệ bảo vệ đạt trên 90%.

4.2. Tính an toàn của vắc xin trên lợn

Vắc xin sản xuất từ công nghệ microcarrier đã được kiểm tra tính an toàn và không gây phản ứng phụ nghiêm trọng trên lợn. Điều này cho thấy công nghệ này có tiềm năng lớn trong sản xuất vắc xin an toàn và hiệu quả.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu sản xuất vắc xin dịch tả lợn bằng công nghệ microcarrier đã mở ra hướng đi mới cho ngành thú y. Với những kết quả đạt được, có thể khẳng định rằng công nghệ này sẽ góp phần quan trọng trong việc nâng cao chất lượng vắc xin và đáp ứng nhu cầu thị trường.

5.1. Tương lai của công nghệ microcarrier trong sản xuất vắc xin

Công nghệ microcarrier có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại vắc xin mới, không chỉ cho dịch tả lợn mà còn cho nhiều bệnh truyền nhiễm khác. Việc nghiên cứu và cải tiến công nghệ này sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin dịch tả lợn, đồng thời mở rộng ứng dụng công nghệ microcarrier cho các loại vắc xin khác. Việc hợp tác giữa các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp sẽ là yếu tố quyết định cho sự thành công.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh dịch tả lợn (Classical Swine Fever - CSF) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu trong ngành chăn nuôi, với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong có thể lên tới 60% đến 90%, thậm chí đạt 100% ở các thể cấp tính. Tại Việt Nam, dịch bệnh được ghi nhận từ những năm 1923 - 1924 và luôn là mối đe dọa lớn đối với an toàn sinh học nông nghiệp. Trước thực trạng đó, việc chủ động nguồn vắc xin nhược độc đạt chuẩn chất lượng cao và giá thành hợp lý là yêu cầu cấp thiết. Tuy nhiên, quy trình sản xuất truyền thống tại Công ty TNHH Dược Hanvet trước đây chủ yếu dựa trên phương pháp nuôi cấy tế bào thận lợn PK-15 trong chai phẳng T-flask quy mô nhỏ, bộc lộ nhiều hạn chế về năng suất, độ đồng đều giữa các lô mẻ và nguy cơ tạp nhiễm cao.

Nhằm giải quyết triệt để bài toán mở rộng quy mô sản xuất công nghiệp, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình chuẩn nuôi cấy tế bào PK-15 và nhân giống vi rút dịch tả lợn nhược độc chủng C trên hệ thống Bioreactor sử dụng chất mang vi mô (Microcarrier Cytodex-1). Đề tài được triển khai trong khoảng thời gian từ tháng 6/2019 đến tháng 5/2020 tại Phòng Tế bào thuộc Trung tâm Nghiên cứu - Công ty TNHH Dược Hanvet (Khu công nghiệp Phố Nối A, tỉnh Hưng Yên).

Kết quả nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công toàn bộ các thông số công nghệ trên hệ thống Bioreactor dung tích 10 lít, giúp nâng hiệu giá vi rút thu hoạch lên mức 10^7.0 TCID50/ml, cao gấp 10 lần so với quy trình cũ. Đồng thời, chế phẩm vắc xin đông khô tạo ra chứng minh được tính an toàn tuyệt đối khi thử nghiệm liều gấp 30 lần và bảo hộ 100% đàn lợn trước liều công cường độc ngay cả ở mức liều 1/100, tạo tiền đề vững chắc cho việc tự chủ công nghệ sản xuất vắc xin quy mô lớn tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết nuôi cấy tế bào động vật bám dính và sinh học phân tử của giống vi rút dịch tả lợn. Tế bào động vật có đặc điểm không có thành vách cơ học, kích thước khoảng 10 µm, tốc độ phân chia chậm với chu kỳ nhân đôi trung bình khoảng 30 giờ và đòi hỏi giá đỡ rắn để bám dính, tăng trưởng qua 4 pha sinh trưởng kinh điển. Dòng tế bào biểu mô thận lợn PK-15 (Pig Kidney 15) được lựa chọn làm nền tảng nuôi cấy nhờ tính cảm nhiễm cao và ổn định di truyền.

Công nghệ hạt chất mang Microcarrier đóng vai trò là khung lý thuyết trọng tâm. Hệ thống hạt vi mang Cytodex-1 cung cấp diện tích bề mặt tiếp xúc cực lớn, đạt khoảng 30 cm² trên mỗi ml môi trường khi sử dụng 5 mg chất mang, tạo điều kiện cho tế bào phát triển dạng đơn lớp mật độ cao trong môi trường huyền phù có khuấy. Về mặt vi sinh vật học, vi rút dịch tả lợn thuộc họ Flaviviridae, giống Pestivirus, mang hệ gen là một chuỗi đơn ARN kích thước khoảng 12 kb với lớp vỏ bọc lipoprotein đường kính 40 - 50 nm. Vi rút nhân lên trong nguyên sinh chất tế bào PK-15 sau 5 - 6 giờ xâm nhiễm mà không gây bệnh tích tế bào (CPE), đòi hỏi các chỉ số kiểm soát như bội số nhiễm (MOI), nồng độ oxy hòa tan (DO), và nồng độ ion hydro (pH) phải được duy trì ở mức cân bằng sinh học chính xác.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm đa yếu tố trên hệ thống Bioreactor BioFlo 320 với thể tích làm việc 10 lít, nồng độ 30 g hạt Cytodex-1 (tương đương 3 g/lít). Cỡ mẫu thực nghiệm được thiết kế lặp lại độc lập 3 lần (triplicate) cho từng dãy biến số để đảm bảo độ tin cậy thống kê. Phương pháp chọn mẫu vi sinh sử dụng ngân hàng tế bào làm việc (working cell bank) PK-15 thuần khiết và giống vi rút vắc xin nhược độc chủng C có hiệu giá ban đầu đạt 10^6.0 TCID50/ml.

Quy trình nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia:

• Quy trình hồi biến, nuôi cấy tế bào PK-15 và phân lập vi rút thực hiện theo TCVN 5273:2010.
• Phương pháp lấy mẫu và đếm mật độ tế bào thực hiện theo TCVN 4884-2:2015 trên buồng đếm hồng cầu 8 ô đếm chuyên dụng.
• Đánh giá độ an toàn và hiệu lực sinh miễn dịch của vắc xin thành phẩm trên lợn thí nghiệm theo quy định của TCVN 8685-8:2011.
• Hiệu giá vi rút được chuẩn độ trên phiến 96 giếng kết hợp nhuộm kháng thể miễn dịch huỳnh quang (IFA) và tính toán chỉ số TCID50 theo thuật toán Spearman - Kärber.

Toàn bộ số liệu thu thập trong giai đoạn từ tháng 6/2019 đến tháng 5/2020 được xử lý thống kê sinh học trên phần mềm Excel 2010 và Minitab 16, đảm bảo độ chính xác với ngưỡng sai số p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã xác lập thành công bộ thông số kỹ thuật tối ưu cho quá trình nuôi cấy tế bào PK-15 và sản xuất vi rút dịch tả lợn nhược độc trên hệ thống Microcarrier 10 lít:

• Tối ưu hóa nuôi cấy tế bào nền: Tốc độ khuấy được xác định tối ưu ở mức 60 vòng/phút, giúp hạt phân tán đều mà không gây lắng đọng hoặc tạo bọt. Giá trị DO duy trì ở mức 50% với lưu lượng cấp khí hỗn hợp 0,6 lít/phút giúp hệ thống ổn định chỉ sau 8 - 9 giờ. Mật độ tế bào nạp ban đầu lý tưởng là 1,5 × 10^5 tế bào/ml (tương đương 1,5 × 10^9 tế bào cho bình 10 lít) trong môi trường MEM bổ sung 5% huyết thanh thai bò (FBS) và 0,1% kháng sinh ở pH = 7,0. Ở điều kiện này, tế bào bám hạt hoàn toàn sau 24 giờ và phủ kín 90% đến 100% bề mặt hạt mang sau 72 - 96 giờ nuôi cấy.
• Tối ưu hóa quy trình gây nhiễm vi rút: Môi trường duy trì thích hợp nhất là MEM bổ sung 1% FBS, 0,1% kháng sinh và 1% Hepes 1M tại pH = 7,2. Bội số nhiễm (MOI) tối ưu được xác định là 0,001. Đường cong sinh trưởng của vi rút cho thấy hiệu giá đạt đỉnh cực đại ở mức 10^7.0 TCID50/ml tại thời điểm 72 giờ sau khi gây nhiễm, tăng gấp 10 lần (tăng 1,0 log10) so với phương pháp chai phẳng T-flask truyền thống chỉ đạt 10^6.0 TCID50/ml.
• Chỉ tiêu chất lượng vắc xin thành phẩm: Vắc xin sau đông khô an toàn tuyệt đối trên đàn lợn thí nghiệm khi tiêm liều cao gấp 30 lần liều sử dụng thông thường. Về tính sinh miễn dịch, lợn được tiêm phòng ở mức liều chỉ bằng 1/100 liều chuẩn vẫn sản sinh hàm lượng kháng thể trung hòa cao và được bảo hộ tuyệt đối 100% trước thử thách công vi rút cường độc tại thời điểm 35 ngày sau tiêm.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất vượt trội của công nghệ Microcarrier bắt nguồn từ việc tạo ra môi trường nuôi cấy đồng nhất và kiểm soát liên tục các yếu tố hóa lý. Nồng độ DO 50% kết hợp lưu lượng khí 0,6 lít/phút cung cấp đầy đủ dưỡng khí mà không gây stress cơ học hay tạo bọt khí làm vỡ màng tế bào. Khi so sánh với các nghiên cứu nuôi cấy tế bào Vero hoặc BHK trên thế giới, việc tối ưu hóa liều MOI ở mức 0,001 vừa giúp tiết kiệm nguồn vi rút giống ban đầu, vừa hạn chế hiện tượng ức chế lẫn nhau giữa các hạt virion trong giai đoạn xâm nhiễm.

Về mặt trình bày trực quan, các dữ liệu động thái phát triển được mô tả rõ nét qua đồ thị đường cong sinh trưởng tế bào từ 24 đến 144 giờ, biểu đồ cột so sánh hiệu giá vi rút giữa 4 mức MOI (0,01; 0,005; 0,001; 0,0005) và bảng theo dõi biến động nồng độ kháng thể ELISA qua các tuần. Việc một mẻ nuôi cấy Bioreactor 10 lít có thể thay thế cho khoảng 50 đến 100 chai roller diện tích 850 cm² đã chứng minh khả năng cắt giảm trên 70% nhân lực thao tác và triệt tiêu nguy cơ nhiễm chéo vi sinh vật trong môi trường vô trùng.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm đạt được, bốn giải pháp trọng tâm được đề xuất nhằm đưa công nghệ vào ứng dụng thực tiễn:

1. Chuẩn hóa quy trình thao tác chuẩn (SOP): Ban hành và áp dụng bộ tiêu chuẩn vận hành nuôi cấy tế bào PK-15 và nhân giống vi rút DTL trên hệ thống Bioreactor 10 lít với các thông số cố định (tốc độ khuấy 60 vòng/phút, DO 50%, MOI 0,001, pH 7,2). Hoàn thành việc chuyển giao nội bộ trong vòng 3 tháng đầu do Phòng Nghiên cứu Tế bào thuộc Hanvet chủ trì.
2. Nâng cấp quy mô sản xuất (Scale-up): Mở rộng thể tích nuôi cấy từ hệ thống 10 lít lên Bioreactor công nghiệp 50 - 100 lít nhằm nâng tổng sản lượng vắc xin cung ứng lên gấp 3 đến 5 lần. Lộ trình thực hiện dự kiến trong 12 tháng tiếp theo dưới sự chỉ đạo của Ban Giám đốc và bộ phận Kỹ thuật sản xuất.
3. Phát triển môi trường không huyết thanh (Serum-free Medium): Tiến hành nghiên cứu thay thế huyết thanh thai bò (FBS) bằng các chất dinh dưỡng tổng hợp chuyên biệt nhằm cắt giảm thêm 20% đến 25% chi phí nguyên liệu và loại bỏ nguy cơ lây nhiễm nguồn đạm ngoại lai. Đề tài do nhóm nghiên cứu sinh học phân tử phụ trách trong thời gian 18 tháng.
4. Đăng ký lưu hành và thương mại hóa mở rộng: Hoàn thiện hồ sơ kiểm nghiệm chất lượng theo tiêu chuẩn GMP-WHO và TCVN 8685-8:2011, hướng tới mục tiêu cung ứng từ 5 đến 10 triệu liều vắc xin dịch tả lợn nhược độc chất lượng cao ra thị trường trong nước và khu vực trong vòng 24 tháng bởi Phòng Đảm bảo chất lượng (QA/QC).

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cho bốn nhóm đối tượng chính:

• Kỹ sư công nghệ sinh học và chuyên viên R&D dược thú y: Tiếp cận hướng dẫn chi tiết về thông số kỹ thuật (DO 50%, lưu lượng khí 0,6 lít/phút, liều MOI 0,001) để vận hành chính xác các dòng máy Bioreactor nuôi cấy tế bào bám dính.
• Lãnh đạo và quản lý nhà máy sản xuất vắc xin: Tham khảo mô hình chuyển đổi công nghệ từ nuôi cấy 2D cổ điển sang hệ thống vi mang 3D, giúp tăng năng suất mẻ nuôi lên gấp 10 lần và tiết kiệm hơn 50% diện tích phòng sạch vô trùng.
• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y, Vi sinh vật học: Sử dụng làm tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp bố trí thí nghiệm đa biến, kỹ thuật chuẩn độ vi rút bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFA) và thuật toán tính TCID50.
• Cán bộ kiểm định và cơ quan quản lý nhà nước về thuốc thú y: Khai thác dữ liệu thực nghiệm về thử thách cường độc và kiểm tra độ an toàn liều gấp 30 lần để làm cơ sở đối chiếu trong công tác thẩm định chất lượng vắc xin nhược độc lưu hành trên thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Công nghệ hạt vi mang Microcarrier mang lại ưu thế gì so với nuôi cấy chai T-flask truyền thống? Công nghệ Microcarrier sử dụng hạt Cytodex-1 tạo diện tích bề mặt bám dính lớn khoảng 30 cm²/ml, giúp nâng hiệu giá vi rút lên mức 10^7.0 TCID50/ml (cao gấp 10 lần quy trình cũ). Phương pháp này giúp tự động hóa kiểm soát môi trường nuôi và giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm chéo vi sinh vật.

2. Các thông số vận hành then chốt khi nuôi cấy tế bào PK-15 trên Microcarrier là gì? Quá trình nuôi cấy đạt hiệu quả cao nhất ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút, lượng oxy hòa tan DO = 50%, lưu lượng khí cấp 0,6 lít/phút và mật độ tế bào nạp 1,5 × 10^5 tế bào/ml. Tế bào phát triển đồng đều, bám hạt sau 24 giờ và phủ kín 90% đến 100% bề mặt hạt sau 72 - 96 giờ.

3. Bội số nhiễm (MOI) và thời điểm thu hoạch vi rút tối ưu được xác định như thế nào? Bội số nhiễm tối ưu là MOI = 0,001 trên môi trường MEM bổ sung 1% FBS và 1% Hepes ở pH = 7,2. Vi rút nhân lên mạnh mẽ và đạt hiệu giá cực đại sau 72 giờ gây nhiễm, giúp tối ưu hóa lượng giống đầu vào và rút ngắn chu kỳ sản xuất.

4. Vắc xin sản xuất từ công nghệ này có đảm bảo an toàn cho đàn lợn không? Chế phẩm vắc xin nhược độc chủng C đạt chuẩn kiểm định theo TCVN 8685-8:2011. Khi thử nghiệm tiêm liều cao gấp 30 lần liều sử dụng thông thường trên lợn mẫn cảm, đàn lợn hoàn toàn khỏe mạnh, không có phản ứng sốt hoặc xuất hiện bất kỳ triệu chứng lâm sàng bất thường nào.

5. Hiệu lực bảo hộ miễn dịch của vắc xin sau đông khô đạt mức độ nào? Kết quả thử nghiệm công cường độc cho thấy lợn được gây miễn dịch ở mức liều chỉ bằng 1/100 liều thông thường vẫn sản sinh kháng thể trung hòa mạnh mẽ và được bảo hộ sống sót hoàn toàn 100% khi thử thách với mầm bệnh dịch tả lợn cường độc sau 35 ngày.

Kết luận

Nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ Microcarrier tại Công ty Hanvet đã ghi nhận những đóng góp khoa học và thực tiễn nổi bật:

• Xây dựng thành công quy trình nuôi cấy tế bào PK-15 trên hạt Cytodex-1 quy mô 10 lít với các thông số tối ưu (tốc độ khuấy 60 vòng/phút, DO 50%, lưu lượng khí 0,6 lít/phút, pH 7,0).
• Chuẩn hóa quy trình nhân giống vi rút dịch tả lợn chủng C với liều MOI = 0,001, đưa hiệu giá vi rút đạt đỉnh 10^7.0 TCID50/ml sau 72 giờ nuôi cấy.
• Chứng minh vắc xin thành phẩm đạt độ an toàn tuyệt đối ở liều gấp 30 lần và bảo hộ 100% đàn lợn thử nghiệm ở mức liều 1/100 theo tiêu chuẩn TCVN 8685-8:2011.
• Tạo bước đột phá công nghệ giúp Công ty Hanvet nâng cao sản lượng, hạ giá thành và làm chủ công nghệ nuôi cấy sinh học 3D hiện đại.
• Định hướng lộ trình mở rộng quy mô lên Bioreactor 50 - 100 lít trong 12 đến 24 tháng tới nhằm thương mại hóa sản phẩm trên diện rộng.

Các đơn vị nghiên cứu, doanh nghiệp dược phẩm thú y và nhà khoa học quan tâm có thể liên hệ trực tiếp với bộ phận chuyển giao công nghệ sinh học hoặc tra cứu toàn văn luận văn tại Trung tâm Thông tin Thư viện - Học viện Nông nghiệp Việt Nam để triển khai ứng dụng vào thực tế sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh dịch tả lợn là bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh chỉ xảy ra ở loài lợn, đặc trưng bởi tỷ lệ mắc bệnh cao và gây xuất huyết ở nhiều cơ quan. Trong trường hợp cấp tính, bệnh gây chết hàng loạt lợn với tỷ lệ rất cao, gây tổn thất lớn về kinh tế và nguy hiểm cho ngành chăn nuôi lợn. Bệnh xuất hiện trên thế giới cách đây hơn một trăm năm và tồn tại ở nhiều quốc gia châu Á và một số quốc gia châu Âu, châu Mỹ. Đã có rất nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đóng góp vào việc tìm hiểu về bệnh dịch tả lợn (DTL) cũng như các phương pháp phòng chống bệnh.

Tuy nhiên cho tới nay, bệnh DTL vẫn tiếp tục được coi là bệnh nguy hiểm và gây thiệt hại nhất cho ngành chăn nuôi lợn. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1923 và gây nhiều đợt dịch nghiêm trọng. Hiện nay, nhiều biện pháp kỹ thuật đã được áp dụng để phòng bệnh. Nhưng do nhiều nguyên nhân khác nhau: điều kiện thời tiết khí hậu, chất lượng vắc xin, kỹ thuật tiêm phòng.

làm cho bệnh DTL xảy ra lẻ tẻ, ít thành ổ dịch lớn. Do diễn biến phức tạp của bệnh nên yêu cầu sản xuất vắc xin phòng và trị bệnh là rất cấp thiết. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại vắc xin DTL nhập khẩu cũng như sản xuất trong nước song giá thành còn cao, các vắc xin giá rẻ thì chất lượng và hiệu quả sử dụng vắc xin chưa ổn định. Tại Hanvet vắc xin DTL nhược độc tế bào được sản xuất trên tế bào PK 15, nuôi cấy chai phẳng T-flask, quy mô nhỏ, độ ổn định và đồng đều giữa các lô mẻ thấp, số lượng vi rút thu hoạch được hạn chế, không đủ phục vụ sản xuất nếu nhu cầu thị trường gia tăng.

Để phục vụ cho quá trình mở rộng quy mô sản xuất, nâng cao độ ổn định và chất lượng sản phẩm, đổi mới công nghệ sản xuất vắc xin DTL bằng công nghệ nuôi cấy tế bào trên chất mang Microcarrier, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc Dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ Microcarrier tại công ty Hanvet”. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Đề tài được thực hiện nhằm mục đích: 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Xây dựng được quy trình chuẩn nuôi cấy và sản xuất vi rút Dịch tả lợn nhược độc trên Microcarrier. Từ đó, đáp ứng được yêu cầu sản xuất vắc xin DTL trên quy mô công nghiệp. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 2. Tình hình dịch bệnh trên thế giới Bệnh dịch tả lợn là bệnh lây lan rất nhanh, tỷ lệ chết cao (có thể từ 60 - 90%). Bệnh thường ghép với phó thương hàn, tụ huyết trùng.

Lợn mắc bệnh thường có triệu chứng bại huyết, xuất huyết ở nhiều cơ quan, bộ phận, hoại tử, loét niêm mạc đường tiêu hoá. Bệnh tiến triển ở nhiều thể khác nhau: quá cấp, cấp tính, mạn tính và thể tiềm ẩn (Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012). Cho đến nay nguồn gốc của bệnh dịch tả lợn chưa được xác minh chính xác, hiện vẫn còn hai quan điểm song song tồn tại: Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Anh vào năm 1862, sau đó lây lan sang các nước châu Âu khác là Đan Mạch, Thụy Điển vào năm 1887. Các nhà khoa học Mỹ cho rằng bệnh xuất phát từ châu Âu và lan sang khắp các nước trên thế giới, ở Nam Mỹ năm 1899, Nam Phi năm 1900 (Fuchs, 1968).

Hiện nay bệnh DTL vẫn tồn tại ở nhiều nước trên thế giới, thiệt hại về kinh tế do dịch tả lợn gây ra vẫn rất lớn. Năm 1997, các nước: Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha, Bỉ có hơn 10 triệu con lợn bị giết hủy. Ở Hà Lan tính đến ngày 31 tháng 12 năm 1997 có 424 ổ dịch trong một năm. Cộng hòa liên bang Đức từ tháng 11 năm 1982 đến 9 năm 1984 có 1457 ổ dịch xảy ra ở 248 đàn lợn giống, 777 đàn lợn thịt và 412 đàn hỗn hợp, với 395000 lợn bị xử lý (Oleksiewicz & cs.

Theo OIE (1998), năm 1984 ở Mexico có 179 ổ dịch, Malaysia có 5 ổ dịch, Hàn Quốc có 45 ổ dịch. Trong một thập kỷ từ năm 1999 đến năm 2009, người ta chỉ ghi nhận được một số ổ dịch xảy ra lẻ tẻ ở khu vực phía Đông của EU. Trong các năm 2011, năm 2012 đến năm 2015 vẫn phát hiện ra một số ổ dịch Dịch tả lợn tại một số nước như: Lithuania, Latvia… (Postel & cs. Từ năm 2014 tình hình dịch bệnh Dịch tả lợn vẫn xảy ra ở một số vùng Caribê (Cuba, Cộng hòa Dominic và Haiti) cũng như từ Bolivia, Columbia, Ecuador và Peru.

Tuy nhiên, riêng lục địa châu Phi không phát hiện thấy ổ dịch nào (Oie, 2016). Báo cáo mới nhất của OIE (tính đến tháng 1 năm 2017) cho thấy: tại châu Mỹ không phát hiện thấy ổ dịch Dịch tả lợn, bao gồm: Canada, Chile, Guiana 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thuộc Pháp, Mexico, Mỹ và một số tỉnh của Brazil (miền Trung và miền Nam) (Oie, 2017). Về địa dư bệnh lý, bệnh dịch tả lợn có tính chất phân bố toàn cầu. Theo Edwards (1998), bệnh xảy ra ở tất cả các nước có chăn nuôi lợn.

Riêng các nước: Australia, Canada, Newzelva, Irelva, Thụy Sỹ và các nước thuộc bán đảo Scadinavia được coi là không có bệnh dịch tả lợn. Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh DTL được phát hiện vào các năm 1923 - 1924 bởi Houdenner (Đào Trọng Đạt & cs., 1985) và đến nay bệnh DTL vẫn là một trong “4 bệnh đỏ” gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta. Năm 1960, bệnh DTL xảy ra ở các tỉnh Nghệ An, Phú Thọ do việc vận chuyển lợn bệnh từ tỉnh ngoài vào. Năm 1973, bệnh DTL xảy ra ở 11 trại lợn xung quanh thành phố Hồ Chí Minh.

Năm 1974 dịch xảy ra ở 17 tỉnh phía Bắc, làm thiệt hại trên 4 vạn lợn, 15 tỉnh Nam bộ có dịch, gây chết 145078 con lợn (Trần Thị Tố Liên &Đào Trọng Đạt, 1985), năm 1983 dịch xảy ra ở Hải Hưng. Trong những năm 1972 - 1973 dịch kéo dài ở Nghệ An, Hà Tĩnh do nhân dân mua lợn bệnh về trong dịp ăn tết cổ truyền làm lây lan dịch bệnh. Tại các tỉnh Trung bộ dịch xảy ra mạnh vào những năm 1976 - 1978; năm 1976 có 17 ổ dịch, 1977 có 36 ổ dịch, năm 1978 có 18 ổ dịch (Đào Trọng Đạt & cs. Từ những năm 1980, do việc tiêm phòng đã triển khai đồng bộ nên các ổ dịch lớn không xảy ra, nhưng bệnh vẫn tồn tại và diễn biến ngày càng phức tạp, có nhiều thay đổi về triệu chứng lâm sàng, bệnh tích cũng như về độ tuổi mẫn cảm.

Nghiên cứu về bệnh lý lâm sàng, triệu chứng, bệnh tích của bệnh DTL ở lợn các lứa tuổi khác nhau có những biến đổi phức tạp, bệnh diễn ra ở thể mạn tính, không điển hình do các chủng vi rút giảm độc lực thường xảy ra đối với lợn nái chưa tiêm phòng, lợn con theo mẹ và gây chết nhiều nhất là lợn con (Trần Tố Liên & Đào Trọng Đạt, 1985). Bệnh DTL ở nước ta xảy ra quanh năm, tuy nhiên do thời tiết thay đổi (thể hiện rõ ở miền Bắc) và do biến động của đàn lợn trong năm nên bệnh có lúc tăng lúc giảm. Ngoài ra, bệnh dịch tả lợn còn phụ thuộc rất nhiều vào tỷ lệ tiêm phòng, lợn lớn đã có miễn dịch bị giết mổ, lợn con thay đàn bổ sung vào chưa kịp tiêm phòng làm cho tỷ lệ lợn mẫn cảm trong đàn tăng lên. Việc tiêm phòng theo mùa vụ 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] và tiêm phòng bổ sung thường xuyên góp phần ổn định và hạn chế dịch bệnh rất nhiều, nhưng trong thực tế sản xuất có nhiều lý do nên việc tiêm phòng chưa thực hiện đúng quy định, vì vậy dịch tả lợn vẫn xảy ra vào các tháng trong năm (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2011).

Theo nghiên cứu của Nguyễn Phục Hưng, 2019 về “điều tra dịch tễ học của bệnh dịch tả lợn cổ điển ở lợn tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2014-2017” cho thấy : trong giai đoạn điều tra, hầu hết các tỉnh miền bắc đều có hai năm dịch hệ số năm dịch >1, chỉ có tỉnh thái bình 3 năm có dịch, còn Sơn La, Nam Định là 1 năm có hệ số mùa dịch > 1. BỆNH DỊCH TẢ LỢN 2. Vi rút dịch tả lợn 2. Nguồn gốc vi rút Dịch Tả Lợn Theo Salmon & Smith (1885), bệnh gây ra bởi một loại vi khuẩn, hai ông đặt tên là Bacillus cholera suis (tức Salmonella suis).

Nhưng đến năm 1903, Schweinitz và Dorset đã xác định tác nhân gây bệnh DTL là một loài vi rút còn vi khuẩn Bacillus cholerae suis chỉ đóng vai trò phụ. Năm 1947 Holmes đặt tên cho vi rút gây bệnh DTL là Tortor vi rút. Trước đây, người ta coi vi rút gây bệnh DTL là thành viên của họ Togavirideae, giống Pestivi rút cùng với vi rút gây bệnh tiêu chảy ở bò (Bovine Viral Diarhea Vi rút – BVDV) và vi rút gây bệnh Border ở cừu (Border Diseease Vi rút – BDV). Nhưng gây đây, qua những nghiêm cứu về cấu trúc phân tử của Pestivirrus cho thấy bộ gen của chúng (genome) tương ứng với vi rút thuộc họ Flaviviridaenên giống Pestivi rút được xếp vào họ Flaviviridae.

(Nguyễn Văn Thanh & cs. Hình thái cấu trúc của vi rút Vi rút DTL thuộc loại ARN vi rút, có vỏ bọc là Lipoprotein. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, vi rút có dạng cấu trúc hình cầu với nucleocapside đối xứng hình khối bao bọc bởi lớp màng ngoài. Virion có đường kính 40-50 nm, đường kính của một khối nucleocapside là 29 nm bao bọc sợi ARN của vi rút.

Bề mặt của virion có những gai lồi 6-8 nm, là thành phần có tính chất bảo vệ hạt vi rút. Bộ gen của vi rút là một chuỗi đơn ARN có độ dài 12KB. Vi rút có 2 glycoprotein E155 và E146 KD ở trên bề mặt và một nucleocapside protein 36KD. Hệ số sa lắng là 140s – 180s (Nguyễn Bá Hiên & Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2012).

5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc vi rút DTL Nguồn: Nguyễn Ngọc Hải (2007) 2. Phân loại vi rút Năm 1939, Geiger đã kết luận rằng không có sự khác nhau cơ bản nào về tính kháng nguyên để sắp xếp các chủng vi rút DTL vào nhiều type vi rút khác nhau.