Nghiên Cứu Sản Xuất Vắc Xin Dịch Tả Lợn Trên Tế Bào Bằng Công Nghệ Microcarrier

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ microcarrier tại công, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Đặng Thùy Chinh
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bá Hiên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Sản Xuất Vắc Xin Nhược Độc Dịch Tả Lợn Bằng Công Nghệ Microcarrier Tại Công Ty Hanvet
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
• 2.2. Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam
• 2.3. Bệnh dịch tả lợn
• 2.4. Vi rút dịch tả lợn
• 2.4.1. Nguồn gốc vi rút Dịch Tả Lợn
• 2.4.2. Phân loại vi rút
• 2.4.3. Hình thái cấu trúc của vi rút
• 2.5. Tổng quan về sản xuất vắc xin
• 2.5.1. Lịch sử hình thành và phát triển vắc xin
• 2.5.2. Sơ lược về các loại vắc xin hiện nay trên thế giới
• 2.5.3. Một số loại vắc xin DTL
• 2.6. Tổng quan nuôi cấy tế bào
• 2.6.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
• 2.6.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào
• 2.6.3. Điều kiện nuôi cấy tế bào
• 2.6.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
• 2.6.5. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy
• 2.7. Hệ thống Microcarrier
• 2.7.1. Lý do lựa chọn phương pháp nuôi cấy trên Microcarrier
• 2.7.2. Sự phát triển của các hạt chất mang
• 2.7.3. Một số ứng dụng của Microcarrier
• 3. NỘI DUNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 3.3. Nghiên cứu xây dựng quy trình gây nhiễm Vi rút trên tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier
• 3.4. Đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau khi thu hoạch
• 3.5. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.5.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.5.3. Địa điểm nghiên cứu
• 3.5.4. Thời gian nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 3.6.2. Phương pháp gây nhiễm
• 3.6.3. Phương pháp đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau đông khô
• 3.6.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 4.1.1. Nghiên cứu tốc độ khuấy và lưu lượng khí
• 4.1.2. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào
• 4.1.3. Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 4.1.4. Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
• 4.2. Nghiên cứu quy trình gây nhiễm vi rút dịch tả lợn trên Microcarrier
• 4.2.1. Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút và pH của môi trường duy trì
• 4.2.2. Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL
• 4.2.3. Xác định đường cong sinh trưởng của vi rút DTL
• 4.3. Đánh giá một số chỉ tiêu vắc xin dịch tả lợn sau đông khô
• 4.3.1. Tính an toàn vắc xin trên lợn
• 4.3.2. Xác định tính sinh miễn dịch của vắc xin DTL
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Vắc Xin Dịch Tả Lợn Châu Phi ASFV

Bệnh dịch tả lợn là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh ở loài lợn, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi. Việc nghiên cứu và sản xuất vắc xin phòng bệnh là vô cùng cấp thiết. Hiện nay, có nhiều loại vắc xin dịch tả lợn châu phi được nhập khẩu và sản xuất trong nước, nhưng giá thành còn cao và hiệu quả chưa ổn định. Nghiên cứu này tập trung vào việc sản xuất vắc xin nhược độc trên tế bào PK-15 bằng công nghệ microcarrier tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, nhằm nâng cao hiệu quả và giảm giá thành sản phẩm. Mục tiêu là xây dựng quy trình chuẩn để sản xuất vắc xin quy mô công nghiệp, đáp ứng nhu cầu phòng bệnh ngày càng tăng. Nghiên cứu này hứa hẹn mang lại giải pháp hiệu quả, góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi lợn khỏi dịch bệnh nguy hiểm này.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Vắc Xin Dịch Tả Lợn Trong Chăn Nuôi

Bệnh dịch tả lợn gây ra những thiệt hại to lớn cho ngành chăn nuôi, ảnh hưởng đến kinh tế và an ninh lương thực. Vắc xin là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất, giúp bảo vệ đàn lợn khỏi nguy cơ lây nhiễm. Việc phát triển vắc xin hiệu quả, an toàn và có giá thành hợp lý là ưu tiên hàng đầu. Nghiên cứu này hướng đến mục tiêu đó, bằng cách áp dụng công nghệ microcarrier tiên tiến trong sản xuất vắc xin. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, việc sử dụng vắc xin đúng cách có thể giảm thiểu đáng kể thiệt hại do dịch tả lợn gây ra.

1.2. Giới Thiệu Công Nghệ Microcarrier Trong Sản Xuất Vắc Xin

Công nghệ microcarrier là một phương pháp nuôi cấy tế bào tiên tiến, cho phép tăng mật độ tế bào và hiệu suất sản xuất vắc xin. Phương pháp này sử dụng các hạt nhỏ làm giá thể cho tế bào bám dính và phát triển, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhân lên của virus dịch tả lợn. So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, công nghệ microcarrier mang lại nhiều ưu điểm vượt trội, như tăng năng suất, giảm chi phí và dễ dàng kiểm soát quy trình. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy tế bào PK-15 trên microcarrier để sản xuất vắc xin dịch tả lợn hiệu quả.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất Vắc Xin Dịch Tả Lợn Hiện Nay

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong việc sản xuất vắc xin dịch tả lợn, vẫn còn tồn tại nhiều thách thức. Các loại vắc xin hiện có thường có giá thành cao, hiệu quả bảo vệ chưa tối ưu, và quy trình sản xuất còn phức tạp. Việc đảm bảo an toàn và tính ổn định của vắc xin cũng là một vấn đề quan trọng. Ngoài ra, sự biến đổi liên tục của virus dịch tả lợn đòi hỏi phải liên tục cải tiến và phát triển các loại vắc xin mới. Nghiên cứu này nhằm giải quyết những thách thức này bằng cách áp dụng công nghệ microcarrier và tối ưu hóa quy trình sản xuất, từ đó tạo ra vắc xin dịch tả lợn hiệu quả, an toàn và có giá thành hợp lý.

2.1. Giá Thành Cao Của Vắc Xin Dịch Tả Lợn Nhập Khẩu

Một trong những rào cản lớn nhất đối với việc phòng bệnh dịch tả lợn là giá thành cao của vắc xin nhập khẩu. Điều này gây khó khăn cho người chăn nuôi, đặc biệt là các hộ gia đình nhỏ lẻ. Việc sản xuất vắc xin trong nước với giá thành cạnh tranh là rất cần thiết. Công nghệ microcarrier có tiềm năng giảm chi phí sản xuất nhờ tăng năng suất và giảm thiểu các công đoạn phức tạp. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất để giảm giá thành vắc xin, giúp người chăn nuôi dễ dàng tiếp cận và sử dụng.

2.2. Tính Ổn Định Và An Toàn Của Vắc Xin Dịch Tả Lợn

Tính ổn định và an toàn là những yếu tố quan trọng hàng đầu đối với bất kỳ loại vắc xin nào. Vắc xin dịch tả lợn cần phải đảm bảo không gây ra tác dụng phụ cho lợn và có khả năng bảo vệ đàn lợn khỏi bệnh trong thời gian dài. Nghiên cứu này sẽ tiến hành các thử nghiệm nghiêm ngặt để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vắc xin được sản xuất bằng công nghệ microcarrier. Các chỉ tiêu như độc lực, tính sinh miễn dịch và khả năng bảo vệ sẽ được kiểm tra kỹ lưỡng để đảm bảo chất lượng vắc xin.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Nuôi Cấy Tế Bào PK 15 Trên Microcarrier

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào PK-15 trên microcarrier để sản xuất virus dịch tả lợn. Tế bào PK-15 là một dòng tế bào thận lợn, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vắc xin. Microcarrier cung cấp bề mặt lớn cho tế bào bám dính và phát triển, giúp tăng mật độ tế bào và hiệu suất sản xuất virus. Quy trình nuôi cấy bao gồm nhiều giai đoạn, từ chuẩn bị tế bào, cấy tế bào lên microcarrier, nuôi cấy trong hệ thống bioreactor, đến thu hoạch virus và tinh chế vắc xin. Các thông số như tốc độ khuấy, lưu lượng khí, pH, nhiệt độ và môi trường nuôi cấy sẽ được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất cao nhất.

3.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Nuôi Cấy Tế Bào PK 15 Trên Microcarrier

Để đạt được hiệu suất sản xuất vắc xin cao nhất, quy trình nuôi cấy tế bào PK-15 trên microcarrier cần được tối ưu hóa. Các yếu tố như tốc độ khuấy, lưu lượng khí, pH, nhiệt độ và môi trường nuôi cấy sẽ được điều chỉnh để tạo điều kiện tốt nhất cho tế bào phát triển. Các thí nghiệm sẽ được thực hiện để xác định các thông số tối ưu cho từng giai đoạn của quy trình nuôi cấy. Kết quả sẽ được phân tích và đánh giá để đưa ra quy trình nuôi cấy tế bào PK-15 trên microcarrier hiệu quả nhất.

3.2. Sử Dụng Hệ Thống Bioreactor Trong Sản Xuất Vắc Xin Dịch Tả Lợn

Hệ thống bioreactor là một thiết bị quan trọng trong sản xuất vắc xin bằng công nghệ microcarrier. Bioreactor cho phép kiểm soát chặt chẽ các thông số môi trường như nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và tốc độ khuấy, tạo điều kiện ổn định cho tế bào phát triển và virus nhân lên. Nghiên cứu này sẽ sử dụng hệ thống bioreactor để nuôi cấy tế bào PK-15 trên microcarrier và sản xuất virus dịch tả lợn. Các thông số của bioreactor sẽ được điều chỉnh và tối ưu hóa để đạt được hiệu suất sản xuất vắc xin cao nhất.

IV. Đánh Giá Hiệu Quả Vắc Xin Dịch Tả Lợn Sản Xuất Bằng Microcarrier

Sau khi sản xuất, vắc xin dịch tả lợn sẽ được đánh giá hiệu quả thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo. Các thử nghiệm in vitro sẽ đánh giá độc lực, tính sinh miễn dịch và khả năng trung hòa virus của vắc xin. Các thử nghiệm in vivo sẽ được thực hiện trên lợn để đánh giá tính an toàn và khả năng bảo vệ của vắc xin chống lại sự lây nhiễm virus dịch tả lợn. Các chỉ tiêu như tỷ lệ sống sót, mức độ giảm virus trong máu và sự phát triển của kháng thể sẽ được theo dõi và đánh giá. Kết quả sẽ được so sánh với các loại vắc xin hiện có để đánh giá ưu điểm của vắc xin được sản xuất bằng công nghệ microcarrier.

4.1. Thử Nghiệm In Vitro Đánh Giá Chất Lượng Vắc Xin Dịch Tả Lợn

Các thử nghiệm in vitro là bước đầu tiên để đánh giá chất lượng vắc xin dịch tả lợn. Các thử nghiệm này sẽ đánh giá các chỉ tiêu như độc lực, tính sinh miễn dịch và khả năng trung hòa virus của vắc xin. Độc lực của vắc xin cần phải được giảm thiểu để đảm bảo an toàn cho lợn. Tính sinh miễn dịch của vắc xin cần phải đủ mạnh để kích thích hệ miễn dịch của lợn tạo ra kháng thể bảo vệ. Khả năng trung hòa virus của vắc xin cần phải cao để ngăn chặn sự lây nhiễm virus dịch tả lợn. Kết quả của các thử nghiệm in vitro sẽ cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá tiềm năng của vắc xin.

4.2. Thử Nghiệm In Vivo Đánh Giá Tính An Toàn Và Hiệu Quả Vắc Xin

Các thử nghiệm in vivo trên lợn là bước quan trọng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vắc xin dịch tả lợn. Lợn sẽ được tiêm vắc xin và theo dõi các biểu hiện lâm sàng để đánh giá tính an toàn. Sau đó, lợn sẽ được thử thách với virus dịch tả lợn để đánh giá khả năng bảo vệ của vắc xin. Các chỉ tiêu như tỷ lệ sống sót, mức độ giảm virus trong máu và sự phát triển của kháng thể sẽ được theo dõi và đánh giá. Kết quả của các thử nghiệm in vivo sẽ cung cấp bằng chứng thuyết phục về tính an toàn và hiệu quả của vắc xin.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Vắc Xin Dịch Tả Lợn An Toàn Hiệu Quả

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng quy trình sản xuất vắc xin dịch tả lợn bằng công nghệ microcarrier tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Vắc xin được sản xuất có độc lực thấp, tính sinh miễn dịch cao và khả năng bảo vệ tốt. Các thử nghiệm in vivo trên lợn cho thấy vắc xin an toàn và có khả năng bảo vệ đàn lợn khỏi sự lây nhiễm virus dịch tả lợn. Kết quả này mở ra triển vọng lớn cho việc sản xuất vắc xin dịch tả lợn quy mô công nghiệp, góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi lợn khỏi dịch bệnh nguy hiểm này. Nghiên cứu này cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại vắc xin khác bằng công nghệ microcarrier.

5.1. Quy Trình Sản Xuất Vắc Xin Dịch Tả Lợn Tối Ưu Hóa

Nghiên cứu đã xác định được quy trình sản xuất vắc xin dịch tả lợn tối ưu hóa bằng công nghệ microcarrier. Quy trình này bao gồm các bước như chuẩn bị tế bào PK-15, cấy tế bào lên microcarrier, nuôi cấy trong hệ thống bioreactor, thu hoạch virus, tinh chế vắc xin và kiểm tra chất lượng. Các thông số như tốc độ khuấy, lưu lượng khí, pH, nhiệt độ và môi trường nuôi cấy đã được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất sản xuất vắc xin cao nhất. Quy trình này có thể được áp dụng để sản xuất vắc xin dịch tả lợn quy mô công nghiệp.

5.2. Khả Năng Ứng Dụng Thực Tế Của Vắc Xin Dịch Tả Lợn

Vắc xin dịch tả lợn được sản xuất bằng công nghệ microcarrier có tiềm năng ứng dụng thực tế rất lớn. Vắc xin có thể được sử dụng để tiêm phòng cho lợn ở các trang trại và hộ gia đình, giúp bảo vệ đàn lợn khỏi sự lây nhiễm virus dịch tả lợn. Vắc xin cũng có thể được sử dụng để kiểm soát dịch bệnh trong trường hợp có ổ dịch xảy ra. Việc sản xuất vắc xin trong nước sẽ giúp giảm giá thành và tăng khả năng tiếp cận vắc xin cho người chăn nuôi. Điều này sẽ góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi lợn và đảm bảo an ninh lương thực.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Vắc Xin Dịch Tả Lợn

Nghiên cứu này đã đạt được những kết quả quan trọng trong việc sản xuất vắc xin dịch tả lợn bằng công nghệ microcarrier. Vắc xin được sản xuất có chất lượng tốt, an toàn và hiệu quả. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất vắc xin dịch tả lợn quy mô công nghiệp. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải tiến quy trình sản xuất, giảm giá thành và nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Nghiên cứu cũng cần tập trung vào việc phát triển các loại vắc xin mới có khả năng chống lại các chủng virus dịch tả lợn biến đổi. Sự hợp tác giữa các nhà khoa học, nhà sản xuất và người chăn nuôi là rất quan trọng để đạt được những thành công trong việc phòng chống dịch tả lợn.

6.1. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Vắc Xin Dịch Tả Lợn

Để tiếp tục cải tiến và phát triển vắc xin dịch tả lợn, cần tập trung vào các hướng nghiên cứu sau: Nghiên cứu về các chủng virus dịch tả lợn biến đổi để phát triển các loại vắc xin có khả năng chống lại các chủng virus này. Nghiên cứu về các phương pháp tăng cường tính sinh miễn dịch của vắc xin để kéo dài thời gian bảo vệ. Nghiên cứu về các phương pháp giảm giá thành sản xuất vắc xin để tăng khả năng tiếp cận vắc xin cho người chăn nuôi. Nghiên cứu về các phương pháp bảo quản vắc xin để đảm bảo chất lượng vắc xin trong quá trình vận chuyển và sử dụng.

6.2. Tầm Quan Trọng Của Hợp Tác Trong Nghiên Cứu Vắc Xin

Sự hợp tác giữa các nhà khoa học, nhà sản xuất và người chăn nuôi là rất quan trọng để đạt được những thành công trong việc phòng chống dịch tả lợn. Các nhà khoa học cần cung cấp kiến thức khoa học và công nghệ mới. Các nhà sản xuất cần áp dụng các công nghệ tiên tiến để sản xuất vắc xin chất lượng cao. Người chăn nuôi cần cung cấp thông tin về tình hình dịch bệnh và nhu cầu sử dụng vắc xin. Sự hợp tác chặt chẽ giữa các bên sẽ giúp phát triển các loại vắc xin dịch tả lợn hiệu quả, an toàn và phù hợp với thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG THÙY CHINH NGHIÊN CỨU SẢN SUẤT VẮC XIN NHƯỢC ĐỘC DỊCH TẢ LỢN TRÊN TẾ BÀO BẰNG CÔNG NGHỆ MICROCARRIER TẠI CÔNG TY HANVET Ngành: Thú y Mã số: 8 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2020 c LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận văn Đặng Thùy Chinh i c LỜI CẢM ƠN Cho đến nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các thầy, cô giáo. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất của mình đến thầy cô hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bá Hiên bộ môn Vi sinh vật và truyền nhiễm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em bạn bè đồng nghiệp công ty TNHH Dược Hanvet đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Cuối cùng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các anh, chị em những người luôn động viên, giúp đỡ tôi để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2020 Tác giả luận văn Đặng Thùy Chinh ii c MỤC LỤC Lời cam đoan . ii Mục lục . iii Danh mục chữ viết tắt . vi Danh mục bảng . vii Danh mục hình . ix Trích yếu luận văn . Mục đích nghiên cứu . Tổng quan tài liệu . Tình hình dịch bệnh trên thế giới và trong nước . Tình hình dịch bệnh trên thế giới . Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam . Bệnh dịch tả lợn . Vi rút dịch tả lợn . Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh DTL . Triệu chứng và bệnh tích bệnh DTL. Tổng quan về sản xuất vắc xin . Lịch sử hình thành và phát triển vắc xin. Sơ lược về các loại vắc xin hiện nay trên thế giới . Một số loại vắc xin DTL. Tổng quan nuôi cấy tế bào . Một số đặc điểm của tế bào động vật . Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào . Điều kiện nuôi cấy tế bào . Sự tạp nhiễm và cách hạn chế. Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy . Hệ thống Microcarrier . Lý do lựa chọn phương pháp nuôi cấy trên Microcarrier . Sự phát triển của các hạt chất mang . Một số ứng dụng của Microcarrier . Nội dung - vật liệu - phương pháp nghiên cứu . Nội dung nghiên cứu . Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier . Nghiên cứu xây dựng quy trình gây nhiễm Vi rút trên tế bào PK 15 hệ thống Microcarrier . Đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau khi thu hoạch . Đối tượng và vật liệu nghiên cứu . Đối tượng nghiên cứu . Vật liệu nghiên cứu . Địa điểm nghiên cứu . Thời gian nghiên cứu . Phương pháp nghiên cứu . Phương pháp nuôi cấy tế bào . Phương pháp gây nhiễm . Phương pháp đánh giá 1 số chỉ tiêu của vắc xin DTL sau đông khô. Phương pháp xử lý số liệu . Kết quả và thảo luận . Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier . Nghiên cứu tốc độ khuấy và lưu lượng khí. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào . Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier . Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier . Nghiên cứu quy trình gây nhiễm vi rút dịch tả lợn trên Microcarrier . Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm vi rút và pH của môi trường duy trì . Xác định liều gây nhiễm (MOI) cho vi rút DTL . Xác định đường cong sinh trưởng của vi rút DTL . Đánh giá một số chỉ tiêu vắc xin dịch tả lợn sau đông khô . Tính an toàn vắc xin trên lợn . Xác định tính sinh miễn dịch của vắc xin DTL . Kết luận và kiến nghị . 68 Tài liệu tham khảo . 69 v c DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt CPE Cyto Pathogenic Effect CSF Classical Swine Fever CSFV Classical Swine Fever Vi rút DMEM Dulbecco’s Modified MEM Medium DO Dissolved Oxygen DTL Dịch Tả Lợn EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum KS Kháng sinh LH Lactalbumin Hydrolysate M199 Medium 199 MEM Minimum essential medium MOI Multiplicity of infection NSSS Năng suất sinh sản PBS Phosphate Buffered Saline pH Hydrogen power PK 15 Pig Kidney 15 TB Tế bào TCID 50 50% Tisue culture infective dose TE Trypsin – EDTA vi c DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Kiểm tra độc lực của vi rút DTL . Một số ứng dụng Microcarrier trong ngành sản xuất vắc xin . Bố trí thí nghiệm nghiên cứu lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp . Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ khuấy thích hợp . Bố trí thí nghiệm xác định lưu lượng khí trong bình nuôi. Bố trí thí nghiệm xác định lượng tế bào tối ưu cho nuôi cấy . Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy . Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy . Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy . Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy . Bố trí thí nghiệm xác định liều gây nhiễm thích hợp . Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính an toàn của vắc xin DTL trên lợn . Bố trí thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch của vắc xin DTL . Kết quả theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy . Mức độ bám tế bào PK 15 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau . Kết quả theo dõi năng suất sinh sản của tế bào sau 48h nuôi cấy . Kết quả điều chỉnh lưu lượng khí cấp vào môi trường nuôi . Kết quả xác định số lượng tế bào PK 15 thích hợp cho nuôi cấy . Khả năng bám và phát triển tế bào PK 15 trên các loại môi trường. Bảng năng suất tế bào PK 15 trên các loại môi trường tại thời điểm 72h nuôi cấy. Kết quả xác định tỉ lệ hạt có tế bào bám sau khi nuôi cấy 24h với các điều kiện pH khác nhau . Kết quả xác định điều kiện pH thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 tại thời điểm 72h nuôi cấy . Kết quả số lượng tế bào PK 15 theo thời gian nuôi cấy trên Microcarrier . Kết quả xác định hiệu giá vi rút DTL trên các loại môi trường nhiễm . Kết quả hiệu giá vi rút Dịch tả lợn ở các điều kiện pH khác nhau . Kết quả hiệu giá vi rút của các liều gây nhiễm (MOI) . Kết quả hiệu giá vi rút DTL qua các thời điểm thu hoạch . Biểu hiện lâm sàng của lợn sau khi tiêm vắc xin DTL nhược độc . Biến động kháng thể của lợn được tiêm vi rút DTL nhược độc xác định bằng ELISA . Hiệu giá kháng thể trung hòa của lợn được tiêm vắc xin DTL nhược độc . 64 viii c DANH MỤC HÌNH Hình 2. Cấu trúc vi rút DTL. Hình ảnh quá trình tế bào tách biệt với sản phẩm tiết. Hệ thống Bioreactor – Bioflo 320. Mô hình nhân số lượng tế bào cho nuôi cấy trên Microcarrier. Buồng đếm tế bào . (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt . Lấy mẫu theo dõi năng suất nhân tế bào PK 15 . Năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị OD khác nhau . Hệ thống khí đi vào hệ thống Microcarrier . Năng suất sinh sản của tế bào PK 15 theo mật độ tế bào đầu vào khác nhau . Hình ảnh tế bào PK 15 trên Microcarrier. Năng suất sinh sản của tế bào trên các môi trường nuôi. Năng suất sinh sản của tế bào khi nuôi cấy ở các pH khác nhau . Đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier . Đồ thị thể hiện hiệu giá trung bình (3 lô) của 4 loại môi trường duy trì . Hiệu giá vi rút theo các liều gây nhiễm khác nhau . Đường cong sinh trưởng của vi rút DTL . Hình ảnh nhuộm IFA của vi rút DTL . So sánh hiệu suất nuôi cấy vi rút trên hệ thống Microcarrier và T- flask . Đồ thị biến động kháng thể của lợn được tiêm vi rút DTL. Biến động kháng thể trung hòa của lợn sau khi tiêm vắc xin DTL trên tế bào . Bệnh tích của lợn khi công cường độc. 67 ix c TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đặng Thùy Chinh Tên luận văn:“Nghiên cứu sản xuất vắc xin nhược độc Dịch tả lợn trên tế bào bằng công nghệ Microcarrier tại công ty Hanvet” Ngành: Thú y Mã số: 8 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng được quy trình chuẩn sản xuất vi rút Dịch tả lợn nhược độc trên Microcarrier. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp hồi nuôi cấy tế bào PK 15 và phân lập vi rút DTL theo TCVN 5273:2010. Lấy mẫu và đếm số tế bào theo TCVN 4884-2:2015. Phương pháp kiểm tra độ an toàn của vắc xin theoTCVN 8685-8:2011. Phương pháp xác định chỉ số TCID50 theo phương pháp Spearman và Karber. Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 và Minitap 16. Kết quả chính và kết luận 1. Quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier thích hợp với các thông số sau: Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90-100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất,lưu lượng khí cấp vào trong bình nuôi cấy PK 15 thích hợp là 0,6 lít/phút, thời gian ổn định DO dao động từ 8-9h ; môi trường MEM bổ sung 5% FBS+ kháng sinh, pH môi trường = 7,0; mật độ tế bào PK 15 cấy vào Microcarrier là 1,5 x 105 tế bào/ml. Sản xuất vi rút DTL trên hệ thống Microcarrier sử dụng với MOI=0,001; môi trường nhiễm là MEM 1% FBS + 0,1% kháng sinh+ 1% hepes; pH= 7,2; vi rút đạt hiệu giá cao nhất sau khoảng 72 giờ sau gây nhiễm đạt 107.