MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ sinh học phân tử đã phát triển nhanh chóng, đạt được những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn. Sự phát triển không ngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sở khoa học một số bệnh nan y, tìm ra các loại thuốc giúp cho con người chống lại các bênh tật và nâng cao sức khỏe đời sống. Thành tựu công nghệ sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp đặc biệt là các sản phẩm chức năng. Xã hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm.
Do đó các sản phẩm chức năng không ngừng được cải tiến nâng cao chất lượng. Và khi những thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh lý học và dinh dưỡng học được cải tiến thì những thực phẩm chức năng, thực phẩm điều trị bệnh được sản xuất nhiều hơn. Ngày nay, thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quan tâm vì đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp nhưng trong đó có chứa rất nhiều tác dụng. Trong nhóm thực phẩm người ta quan tâm khá nhiều đến đường chức năng.
Có rất nhiều loại đường chức năng như: đường Maltitol, đường Fructooligosaccharide, đường Sorbitol, đường Trehalose…Trong số đó đường Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người béo phì, những người mắc bệnh tiểu đường, sâu răng,… Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzyme ứng dụng trong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng Trehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điều chỉnh quá trình đông lạnh, ngăn ngừa quá trình kết tinh, cung cấp giá trị dinh dưỡng. Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzyme được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhu cầu cần thiết. Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao. Khoa Công Nghệ Sinh Học 1 Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme Trehalase không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị kinh tế xã hội.
Từ những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu sau: “Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme” Mục tiêu của đề tài: 1. Biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E. Tách và tinh chế enzyme. Xác định các đặc tính của enzyme 4.
Ứng dụng enzyme để tổng hợp Trehalose. Khoa Công Nghệ Sinh Học 2 Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp Kỹ thuật di truyền là thuật ngữ chung cho nhiều kỹ thuật cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Thuật ngữ kỹ thuật gen còn gọi công nghệ gen hay kỹ thuật gen vấn đề cốt lõi của sinh học hiện đại. Năm 1983 Rudleg và Sediel: kỹ thuật di truyền là các kỹ thuật dẫn đến khả năng biến đổi định hướng gen, tần số kiểu gen của một quần thể, hoặc làm tăng căn bản khả năng sinh sản của một số cá thể để nâng cao vốn gen và tăng số lượng hợp tử của quần thể.
Kỹ thuật gen được bắt đầu năm 1977, bao gồm các thao tác kỹ thuật trên gen, nhằm điều chỉnh và biến đổi gen hoặc tạo ra các gen mới từ đó tạo ra các cá thể mới. Kỹ thuật gen bao gồm một số kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật DNA tái tổ hợp, phân lập gen, chuyển ghép gen, dung hợp gen vi thao tác gen. DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA được gép nối từ các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong loài, hoặc các loài khác nhau gọi DNA tái tổ hợp.
Nguyên tắc chung của công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm một số bước sau. Trước hết genome mục tiêu và DNA chuyển tải (vector) được tinh chế và cắt thành từng đoạn nhờ một loại Enzyme hạn chế. Trong nhiều trường hợp (đặc biệt đối với sinh vật bậc cao) DNA gen nome được thay thế bằng DNA tương bù (cDNA) củ mRNA thành thục. DNA này được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin nhờ xúc tác của enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase, rna-dependent DNA-polymerase).
DNA vector có thể là một plasmid hoặc phage (nếu vật mang dòng hóa gen là vi khuẩn), plasmid Ti của vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens (nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào thực vật), là Vius (retrovirus hoặc andovirus không gây bệnh, nếu vật mang dòng hóa gen là tế bào động vật). Bước thứ hai là chuyển vận DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết suất và tinh chế) sản phẩm mục tiêu. Khoa Công Nghệ Sinh Học 3 Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme đầu dính) các đoạn DNA mục tiêu và các đoạn DNA vector (chỉ cắt tại một điểm của mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành liên kết hidro tương bù ở các đầu dính, rồi được ligase hàn gắn các đầu khác. Kết quả trong hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp của vector với một hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm không mong muốn như vector tự khép vòng, các vector tự tái tổ hợp với nhau và các mảnh DNA không tái tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp).
Tất cả các sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn đều với các vật mang tạo dòng, sau đó các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có yếu tố chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với các tế bào động vật thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp Beta-galactosidase), nên chỉ những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó thì được chọn nuôi cấy tạo dòng. Bước tiếp theo là chọn những dòng tính trạng của gen mục tiêu hoặc những dòng gen mục tiêu (nhờ lai phân tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Westerm blot anlysis, Northern blot anlysis hoặc với các dò DNA hoặc RNA – southern blot anlysis, Norther blot anlysis), hoặc PCR.
Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật mang thỏa mãn các bước thử nghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu. Thực chất của công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật trên một gen, cải biến cấu trúc của gen, bộ gen tạo ra các gen mới trong bộ gen. Công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm các bước cơ bản sau. - Tách chiết DNA, RNA (phân lập gen) - Tạo vector tái tổ hợp (bao gồm chuẩn bị vector tách dòng) - Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng.
Khoa Công Nghệ Sinh Học 4 Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở - Sàng lọc, theo dõi hoạt động và biểu hiện của gen Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt bậc. Nhiều sản phẩm có ích đã được sản xuất từ các vi sinh vật tái tổ hợp hay vi sinh vật biến đổi gen (gentically modified organisms – GMO) như giống ngũ cốc đậu tương, hạt có dầu, bông,… mang gen chống sâu bệnh hoặc kháng thuốc chống cỏ dại hoặc có chất lượng sản phẩm nâng cao như khoai tây chứa nhiều Protein, lúa nhiều vitamin A và sắt,… Tạo ra được những vacxin tái tổ hợp có thể dễ sản xuất (dễ nuôi cấy trên lứa cấy tế bào hay phôi gà) và dễ sử dụng cho ăn uống, hoặc những động vật tái tổ hợp sản sinh những sản phẩm hữu ích như thuốc chữa bệnh, thậm chí tạo ra những đàn lợn mang kháng nguyên người, hy vọng là vật có thể cho tim hoặc nội tạng khác để điều trị những trường hợp người bệnh cần thay thế nội quan,… Tuy nhiên, kỹ thuật di truyền cũng đặt loài người vào tình trạng có thể phải đương đầu với những đe dọa mới liên quan tới sức khỏe của người và sinh thái – môi trường. Chưa thể chứng minh được tính vô hại của GMO thực phẩm đối với con người, cũng như chưa phủ nhận khả năng lan truyền gen kháng thuốc (của Plasmid vector) trong tập đoàn các vi khuẩn tự nhiên của cơ thể (ví dụ trong đường ruột) người và động vật. Chăm sóc những loại cây trồng đề kháng thuốc diệt cỏ và thuốc diệt sâu bệnh có thể dẫn đến lạm dụng nông dược và nếu thoái hóa trở thành cỏ dại thì thực vật kháng thuốc và kháng sâu bệnh sẽ là một nguy cơ mới đối với nông nghiệp.
Tương tự, nguy cơ những sinh vật GMO lấn át sinh vật tự nhiên sẽ là rất cao và có thể dẫn đến sự tuyệt diệt của nhiều loài sinh vật hiện có gây hậu quả nghiêm trọng đến môi trường sinh thái… I.2 Đại cương về vi khuẩn E.coli Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1973); Nguyễn Lân Dũng (1976), trực khuẩn Escherchia Coli có tên khoa học là Bacterium Coli Comunis bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột (ruột già và phần cuối của ruột non), ít khi có ở dạ dày hay phía trước ruột non của động vật (Nguyễn Vĩnh Phước,1978).coli ở kết tràng là 58.3%, manh tràng Khoa Công Nghệ Sinh Học 5 Vũ Thị Hằng - 0604 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở là 39.coli xuất hiện và sinh sống ở động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại đến khi con vật chết. Loài ăn tạp và ăn thịt thải nhiều E.coli hơn loài ăn cỏ. Theo Kefman những chủng E.coli thường gặp về huyết thanh được chia thành những Serotype riêng. Trong số này một số serotype đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh cho người và động vật.1 Đặc điểm hình thái E.coli là loài trực khuẩn hình gậy gắn, hai đầu tròn, có lông, di động được, không hình thành nha bào, giáp mô, bắt màu Gram âm, thường thẫm ở hai đầu ở giữa nhạt, kích thước vi khuẩn 2-3 uM x 0.Trong cơ thể gia súc, vi khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn.2 Đặc tính nuôi cấy E.