Nghiên Cứu Cellulase Từ Vi Khuẩn Ruột Mối Phân Lập Ở Việt Nam

Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối tại Việt Nam mở ra hướng đi mới trong việc khai thác nguồn… 132 trang · Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội · 2022.

• Tác giả: Đào Thị Thanh Xuân
• Người hướng dẫn: PGS.TS Lê Thanh Hà
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Cellulase Từ Vi Khuẩn Ruột Mối Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Cellulase Từ Vi Khuẩn Ruột Mối Việt Nam

Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối tại Việt Nam mở ra hướng đi mới trong việc khai thác nguồn enzym cellulase tiềm năng. Cellulase là một phức hệ enzym quan trọng, có khả năng thủy phân cellulose, thành phần chính của sinh khối thực vật. Việc tìm kiếm và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase hiệu quả từ ruột mối là một hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn. Mối, với hệ vi sinh vật ruột đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải cellulose trong tự nhiên. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn và đánh giá khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam, góp phần vào việc khai thác đa dạng sinh học của đất nước. Theo luận án tiến sĩ của Đào Thị Thanh Xuân, việc xử lý nguồn nguyên liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Cellulase Từ Mối

Nghiên cứu cellulase từ mối (Termitidae) có ý nghĩa quan trọng trong nhiều lĩnh vực. Cellulase có thể được ứng dụng trong xử lý phế thải nông nghiệp, sản xuất ethanol sinh học, và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Việc tìm kiếm các chủng vi khuẩn sản xuất cellulase hiệu quả từ ruột mối giúp tận dụng nguồn tài nguyên sinh học sẵn có. Hơn nữa, nghiên cứu này góp phần vào việc hiểu rõ hơn về hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối và cơ chế phân giải cellulose của chúng.

1.2. Mục Tiêu Và Phạm Vi Nghiên Cứu Cellulase Việt Nam

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập, tuyển chọn và đánh giá đa dạng các chủng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối tại Việt Nam. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào việc xác định đặc tính sinh hóa, sinh lý của các chủng vi khuẩn này, cũng như đánh giá khả năng sản xuất cellulase của chúng. Nghiên cứu cũng hướng đến việc giải trình tự gen của một số chủng vi khuẩn tiềm năng để xác định các gen liên quan đến quá trình phân giải cellulose.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Cellulase

Mặc dù cellulase có tiềm năng ứng dụng rộng rãi, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và ứng dụng enzym này. Một trong những thách thức lớn nhất là tối ưu hóa quá trình sản xuất cellulase để giảm chi phí và tăng hiệu quả. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy vi khuẩn, nguồn dinh dưỡng, và các thông số kỹ thuật khác cần được kiểm soát chặt chẽ để đạt được hiệu suất cao nhất. Bên cạnh đó, việc cải thiện tính ổn định và hoạt tính của cellulase trong điều kiện công nghiệp cũng là một vấn đề quan trọng cần được giải quyết. Theo luận án, việc sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường là một hướng đi đầy tiềm năng.

2.1. Tối Ưu Hóa Sản Xuất Cellulase Từ Vi Khuẩn Ruột Mối

Việc tối ưu hóa sản xuất cellulase từ vi khuẩn ruột mối đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện sinh lý của vi khuẩn. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, thời gian ủ, và nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính cellulase. Cần có các nghiên cứu chi tiết để xác định các điều kiện tối ưu cho từng chủng vi khuẩn cụ thể.

2.2. Nâng Cao Hoạt Tính Và Độ Bền Của Enzym Cellulase

Để enzym cellulase có thể được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, cần phải nâng cao hoạt tính và độ bền của enzym. Các phương pháp như biến đổi gen, bất động hóa enzym, và sử dụng các chất hoạt hóa có thể được áp dụng để cải thiện các đặc tính này. Nghiên cứu về cấu trúc protein và cơ chế hoạt động của cellulase cũng đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các phương pháp cải tiến enzym.

III. Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Cellulase

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối một cách hệ thống. Quá trình này bao gồm việc thu thập mẫu mối, phân lập vi khuẩn từ ruột mối trên các môi trường chọn lọc, và đánh giá khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập được. Các phương pháp định danh vi khuẩn như phân tích trình tự gen 16S rRNA được sử dụng để xác định tên khoa học của các chủng vi khuẩn tiềm năng. Theo luận án, kỹ thuật giải trình tự gen của vi khuẩn đang là công cụ được khai thác để dự đoán các gen mã hóa sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học của chủng.

3.1. Quy Trình Phân Lập Vi Khuẩn Từ Ruột Mối

Quy trình phân lập vi khuẩn từ ruột mối bao gồm các bước: thu thập mẫu mối, mổ ruột mối để lấy dịch ruột, pha loãng dịch ruột, cấy dịch ruột lên môi trường chọn lọc chứa cellulose làm nguồn carbon duy nhất, ủ các đĩa petri, và chọn các khuẩn lạc có khả năng phân giải cellulose.

3.2. Đánh Giá Hoạt Tính Cellulase Của Vi Khuẩn Phân Lập

Để đánh giá hoạt tính cellulase của vi khuẩn phân lập, các phương pháp như đánh giá định tính trên đĩa petri chứa CMC (Carboxymethyl cellulose) và đánh giá định lượng bằng cách đo lượng đường khử được tạo ra từ quá trình thủy phân cellulose được sử dụng. Đơn vị hoạt tính enzym được sử dụng để so sánh khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn khác nhau.

3.3. Định Danh Vi Khuẩn Bằng Phân Tích Trình Tự Gen 16S rRNA

Phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA là một công cụ mạnh mẽ để định danh vi khuẩn. Quá trình này bao gồm: chiết xuất DNA từ vi khuẩn, khuếch đại vùng gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự DNA, và so sánh trình tự thu được với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu gen.

IV. Ứng Dụng Cellulase Từ Vi Khuẩn Ruột Mối Trong Nông Nghiệp

Cellulase từ vi khuẩn ruột mối có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp. Cellulase có thể được sử dụng để xử lý phế thải nông nghiệp, tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng như phân bón sinh học và thức ăn chăn nuôi. Ngoài ra, cellulase cũng có thể được sử dụng để cải tạo đất, giúp cải thiện cấu trúc đất và tăng khả năng giữ nước của đất. Theo luận án, mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác.

4.1. Sản Xuất Phân Bón Sinh Học Từ Phế Thải Nông Nghiệp

Phế thải nông nghiệp như rơm rạ, bã mía, và lá cây có thể được thủy phân bằng cellulase để tạo ra các sản phẩm giàu dinh dưỡng cho cây trồng. Quá trình này giúp giảm lượng phế thải thải ra môi trường và tạo ra nguồn phân bón thân thiện với môi trường.

4.2. Cải Thiện Chất Lượng Thức Ăn Chăn Nuôi

Cellulase có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng thức ăn chăn nuôi bằng cách phá vỡ các liên kết cellulose trong thức ăn, giúp vật nuôi dễ tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng hơn. Điều này có thể giúp tăng năng suất và giảm chi phí chăn nuôi.

4.3. Cải Tạo Đất Và Tăng Năng Suất Cây Trồng

Cellulase có thể được sử dụng để cải tạo đất bằng cách phân giải các chất hữu cơ trong đất, giúp cải thiện cấu trúc đất, tăng khả năng giữ nước, và cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Điều này có thể giúp tăng năng suất cây trồng và giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Cellulase Trong Tương Lai

Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối ở Việt Nam đã mở ra những triển vọng mới trong việc khai thác nguồn enzym tiềm năng này. Các kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn ruột mối là một nguồn cellulase đa dạng và có giá trị. Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của cellulase, tối ưu hóa quá trình sản xuất, và mở rộng ứng dụng của cellulase trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Theo luận án, cần tiếp tục nghiên cứu để có thể dự đoán tiềm năng sinh cellulase của chủng.

5.1. Đánh Giá Tiềm Năng Ứng Dụng Của Cellulase

Cần có các nghiên cứu đánh giá tiềm năng ứng dụng của cellulase trong các lĩnh vực như sản xuất giấy, sản xuất ethanol sinh học, xử lý phế thải, và y học. Việc xác định các ứng dụng cụ thể và phát triển các quy trình công nghệ phù hợp sẽ giúp đưa cellulase vào thực tiễn.

5.2. Nghiên Cứu Về Cơ Chế Hoạt Động Của Cellulase

Nghiên cứu về cơ chế hoạt động của cellulase là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về cách enzym này phân giải cellulose. Các nghiên cứu về cấu trúc protein, động học enzym, và tương tác giữa enzym và cơ chất sẽ giúp phát triển các enzym cellulase hiệu quả hơn.

5.3. Phát Triển Các Phương Pháp Sản Xuất Cellulase Hiệu Quả

Cần phát triển các phương pháp sản xuất cellulase hiệu quả về chi phí và thân thiện với môi trường. Các phương pháp như lên men bề mặt, lên men chìm, và sử dụng các nguồn carbon rẻ tiền có thể được áp dụng để giảm chi phí sản xuất cellulase.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Nguồn sinh khối thực vật chứa lignocellulose là nguồn nguyên liệu sinh học dồi dào, đồng thời là phụ phẩm và phế thải quy mô lớn từ nông nghiệp, công nghiệp chế biến gỗ và sản xuất giấy. Tại Việt Nam, lượng phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose như rơm rạ, lá mía, bã mía ước tính phát sinh hàng năm trên 100 triệu tấn. Phương thức xử lý truyền thống chủ yếu là đốt tại đồng ruộng, dẫn đến lãng phí nguồn carbon hữu cơ và gây ô nhiễm môi trường. Việc ứng dụng hệ enzyme cellulase để sinh học hóa và chuyển hóa lignocellulose thành các sản phẩm có giá trị gia tăng (như đường có thể lên men sản xuất ethanol sinh học, thức ăn chăn nuôi) là giải pháp kỹ thuật thân thiện với môi trường.

Trong tự nhiên, mối là loài côn trùng có khả năng tiêu hóa và khoáng hóa mạnh mẽ các polymer sinh học nhờ sự hiện diện của hệ vi sinh vật cộng sinh phức tạp trong đường ruột. Mặc dù nhiều nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận các loài vi khuẩn phân giải cellulose từ ruột mối, tại Việt Nam các nghiên cứu mang tính hệ thống về việc phân lập, tuyển chọn, đánh giá hoạt tính cellulase kết hợp ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) nhằm khai thác các cụm gen chức năng phân giải lignocellulose từ vi khuẩn ruột mối vẫn còn hạn chế. Luận án tiến sĩ "Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam" của nghiên cứu sinh Đào Thị Thanh Xuân (chuyên ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội) được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Luận án xác định rõ 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam.
2. Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn phân lập được làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được.

Để thực hiện hai mục tiêu trên, tác giả đã triển khai 6 nội dung nghiên cứu đánh số theo văn bản:

1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối.
2. Định tên một số vi khuẩn có khả năng sinh cellulase phân lập được từ ruột mối.
3. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn.
4. Thu nhận cellulase từ hai chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính cellulase của chế phẩm.
5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn.
6. Sử dụng dịch enzyme thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các chủng vi khuẩn sinh cellulase được phân lập từ ruột của các mẫu mối thu thập tại Việt Nam. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào việc sàng lọc hoạt tính enzyme (CMCase, xylanase, enzyme phân giải giấy lọc), xác định đặc điểm sinh hóa, định danh phân tử, tối ưu hóa các thông số nuôi cấy lên men, thu nhận và khảo sát các đặc tính hóa lý của enzyme (nhiệt độ, pH, độ bền), giải trình tự hệ gen vi khuẩn bằng công nghệ thế hệ mới và thử nghiệm khả năng đường hóa phụ phẩm rơm rạ sau tiền xử lý kiềm.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về nguồn vi sinh vật sinh cellulase, sinh thái vi sinh vật ruột mối và các phương pháp tiếp cận sinh học phân tử hiện đại:

• Các nguồn thu nhận vi khuẩn sinh cellulase truyền thống: Vi khuẩn sinh cellulase đã được phân lập từ nhiều môi trường khác nhau như dạ cỏ động vật nhai lại (Hungater, 1957), đất (Black và cộng sự, 1985), phân chuồng (Madden, 1982), chất thải đô thị (Stutzenberger và cộng sự, 1970), nước thải cống rãnh (Muray và cộng sự, 1984) và suối nước nóng (Sissons và cộng sự, 1987).
• Hệ vi sinh vật ruột côn trùng và ruột mối: Morrison và cộng sự (2009) ghi nhận trên 20% loài côn trùng có mối quan hệ cộng sinh mật thiết với vi sinh vật đường ruột để chuyển hóa lignocellulose. Hethener và cộng sự (1992) đã phân lập thành công chủng vi khuẩn kỵ khí Clostridium termitidis sp. từ ruột loài mối ăn gỗ Nasutitermes lujae. Wenzel và cộng sự (2001) phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thuộc các chi Cellulomonas, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium từ ruột mối Zootermopsis angusticollis. Tại Úc, chủng MX5T phân lập từ ruột mối Mastotermes được xác định là Cellulosimicrobium variable có khả năng sinh đồng thời cellulase và xylanase. Chen và cộng sự đã phân lập từ ruột các loài mối Heterotermes và Odontotermes các chủng thuộc chi Bacillus, Staphylococcus, Enterobacter, trong đó chủng Bacillus cereus đạt hoạt độ endoglucanase 5,06 U/mg, FPU 2,52 U/mg và β-glucosidase 6,01 U/mg sau khi tối ưu hóa.
• Các nghiên cứu về động thái sinh tổng hợp và đặc tính enzyme: M. Irfan và cộng sự (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và nguồn carbon tới Cellulomonas ASN2; D. Submitted và cộng sự (2013) cùng Apurv và cộng sự (2014) xác nhận nhiệt độ tối ưu 37°C cho quá trình sinh cellulase của nhiều vi khuẩn ruột mối; Bholay và cộng sự (2012) công bố ảnh hưởng của glucose, fructose, xylose và tinh bột đến hoạt tính enzyme của Pseudomonas từ ruột mối; Liu và cộng sự khảo sát nhu cầu oxy và khuấy trộn của chi Cellulosimicrobium (tốc độ lắc 150-180 vòng/phút).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là đánh giá toàn diện đa dạng vi khuẩn phân giải cellulose từ nguồn mẫu mối tự nhiên thu thập tại Việt Nam, tối ưu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận enzyme từ hai đại diện vi khuẩn tiềm năng (Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1), đồng thời ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên nền tảng Illumina để phân tích chi tiết kho tàng gen enzyme hoạt hóa carbohydrate (CAZyome), làm tiền đề giải thích cơ chế và khả năng phân giải sinh khối thực vật thực tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Hệ enzyme cellulase phân giải cơ chất cellulose không đồng nhất thông qua cơ chế hiệp đồng giữa 3 nhóm enzyme chính:

1. Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.4 / CMCase / EGs): Thủy phân ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glucosid nằm sâu bên trong vùng vô định hình của sợi cellulose, cắt ngắn chuỗi polysaccharide thành các đoạn glucan có kích thước khác nhau.
2. Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.91 / Cellobiohydrolase / CBHs): Tấn công từ đầu khử hoặc không khử của mạch cellulose (bao gồm cả vùng tinh thể), giải phóng các đơn vị disaccharide cellobiose.
3. β-D-glucosidase (EC 3.2.1.21 / BGs / Cellobiase): Thủy phân các đoạn cellodextrin ngắn hòa tan và cellobiose thành các phân tử glucose đơn phân, giải tỏa hiện tượng ức chế ngược do cellobiose gây ra cho CBHs và EGs. Cấu trúc enzyme cellulase thường bao gồm vùng xúc tác (Catalytic Domain - CD) liên kết với vùng gắn kết carbohydrate (Carbohydrate Binding Domain - CBD/CBM) qua một đoạn peptide nối (linker).

Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp phân lập và tuyển chọn: Sử dụng các môi trường làm giàu (M1, M2, M6...) chứa nguồn cơ chất carbon duy nhất là carboxymethyl cellulose (CMC), giấy lọc dải hoặc bột phụ phẩm nông nghiệp (cám gạo, bột đậu tương). Sàng lọc định tính hoạt tính enzyme trên đĩa thạch CMC thông qua đường kính vòng phân giải ($D$) và đường kính khuẩn lạc ($d$), đánh giá bằng tỷ lệ $D/d$ sau khi nhuộm màu bằng thuốc thử chuyên biệt (Congo Red hoặc Lugol).
• Phương pháp sinh lý, sinh hóa: Nhuộm Gram, kiểm tra phản ứng catalase, xác định phổ sử dụng cơ chất và hoạt tính enzyme nội bào bằng các bộ kít sinh hóa thương mại API 20E (cho vi khuẩn Gram âm và trực khuẩn đường ruột) và API 50 CHB (đánh giá khả năng lên men 49 loại carbohydrate).
• Phương pháp sinh học phân tử và định danh: Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại đoạn gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến, tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger. Đối chiếu mức độ tương đồng trình tự nucleotide trên ngân hàng dữ liệu quốc tế GenBank (NCBI) bằng công cụ BLASTn.
• Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men: Áp dụng phương pháp khảo sát đơn yếu tố (OFAT) đối với các thông số: thời gian lên men, nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc, tỷ lệ tiếp giống, nguồn carbon (glucose, tinh bột, maltose, sucrose, CMC...) và nguồn nitơ (cao thịt, cao nấm men, casein, bột đậu tương, $(NH_4)_2SO_4$, peptone...). Tiếp đó, áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM) theo mô hình Box-Behnken trên phần mềm Design-Expert 7 để tối ưu hóa nồng độ các thành phần môi trường cho chủng Bacillus subtilis G4.
• Phương pháp thu nhận và khảo sát đặc tính enzyme: Thu dịch enzyme thô bằng ly tâm loại bỏ tế bào vi khuẩn. Tách chiết và làm giàu enzyme kỹ thuật thông qua các kỹ thuật kết tủa protein bằng muối $(NH_4)_2SO_4$ bão hòa, dung môi hữu cơ acetone lạnh và ethanol tuyệt đối ở các tỷ lệ thể tích khác nhau. Khảo sát hoạt độ CMCase (định lượng đường khử bằng phương pháp acid 3,5-dinitrosalicylic - DNS), hoạt độ xylanase, hoạt độ phân giải giấy lọc (FPU), hàm lượng protein hòa tan (phương pháp Bradford/Lowry). Đánh giá nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, độ bền nhiệt và độ bền pH của chế phẩm.
• Phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và phân tích tin sinh học: Tách chiết DNA hệ gen chất lượng cao của chủng Cellulosimicrobium cellulans MP1. Giải trình tự hệ gen bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) trên hệ thống Illumina HiSeq 2000. Lắp ráp dữ liệu de novo, dự đoán khung đọc mở (ORF), chú giải chức năng gen thông qua cơ sở dữ liệu COG/KOG và phân loại các họ enzyme hoạt hóa carbohydrate (CAZy: Glycoside Hydrolases - GHs, Carbohydrate Esterases - CEs, Glycosyl Transferases - GTs, Polysaccharide Lyases - PLs, Carbohydrate-Binding Modules - CBMs).
• Phương pháp xử lý và đường hóa sinh khối: Tiền xử lý rơm rạ khô bằng dung dịch kiềm (NaOH). Phân tích hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trước và sau tiền xử lý. Thủy phân cơ chất rơm bằng dịch enzyme cellulase thu nhận từ vi khuẩn ở các điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian, tỷ lệ rắn/lỏng và nồng độ enzyme khác nhau. Xác định nồng độ đường đơn giải phóng trong dịch thủy phân bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận về cấu trúc phân tử của lignocellulose (cellulose, hemicellulose, lignin), cơ chế phân cắt liên kết glycoside của phức hệ cellulase (endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase), động thái sinh học và đặc tính hóa lý của cellulase vi khuẩn. Chương này cũng phân tích sâu về đặc điểm sinh học của các nhóm mối, tính chất lý hóa trong từng phần ống tiêu hóa của mối (ruột trước, ruột giữa, ruột sau với pH có thể dao động từ trung tính đến kiềm mạnh), cấu trúc hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối và tiềm năng của việc ứng dụng công nghệ giải trình tự hệ gen vi sinh vật nhằm khai thác các enzyme phân giải sinh khối thực vật phục vụ công nghiệp.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc 8 nhóm mẫu mối thu thập tại các địa điểm ở Việt Nam, các chủng vi sinh vật đối chứng, các hóa chất tinh khiết, trang thiết bị phân tích hiện đại (máy giải trình tự Illumina HiSeq 2000, hệ thống HPLC, máy quang phổ UV-Vis, máy lắc điều nhiệt...). Trình bày chi tiết công thức các môi trường nuôi cấy (môi trường làm giàu M1, M2, M6; môi trường giữ giống, nhân giống và môi trường lên men sinh tổng hợp enzyme). Quy định rõ ràng các quy trình thực nghiệm: quy trình phân lập, quy trình đo tỷ lệ vòng phân giải $D/d$, thiết kế ma trận thực nghiệm Design-Expert 7, quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA, các bước xử lý dữ liệu tin sinh học hệ gen và các công thức tính toán hiệu suất đường hóa lignocellulose.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

1. Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn ruột mối

Từ 8 nhóm mẫu mối thu thập, tác giả đã phân lập được hàng chục chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa cellulose. Dựa trên khả năng tạo vòng phân giải cơ chất CMC (tỷ lệ $D/d > 1$), 11 chủng vi khuẩn tiêu biểu có hoạt tính nổi trội đã được lựa chọn để nghiên cứu chi tiết về hình thái khuẩn lạc, đặc tính sinh lý, sinh hóa và định danh phân tử.

Ký hiệu chủng	Hình thái khuẩn lạc	Tỷ lệ D/d	Kết quả định danh 16S rDNA	Mã số truy cập GenBank	Độ tương đồng (%)
G4	Trắng đục, viền nhăn, bề mặt sần	8,0	Bacillus subtilis	MG705833.1	99,19
MP1	Vàng nhạt, bề mặt nhẵn bóng	7,0	Cellulosimicrobium cellulans	MT264773.1	99,93
MP3	Trắng đục, viền hơi nhăn, to	6,5	Cellulosimicrobium funkei	KY292453.1	99,86
MP2	Màu trắng trong, viền nhẵn	5,25	Cellulosimicrobium sp.	—	—
HP2.2	Trắng đục, hơi ngả vàng, xù xì	4,6	Bacillus sp.	—	—
TP5.2	Vàng cam, viền nhẵn	4,5	Bacillus sp.	—	—
CG4-1-2	Trắng đục, viền tua rua xù xì	4,2	Bacillus sp.	—	—
CM2-4	Trắng đục, hơi ánh vàng hồng	4,2	Cellulomonas sp.	—	—
CG4	Trắng đục, viền ngoài trong	2,8	Klebsiella variicola	MT509531.1	100,0
CG2	Trắng ngà vàng, viền tua rua	2,6	Trabulsiella guamensis	NR114235.1	99,69
TM1-7-1	Trắng đục, viền trong, nhân đục	2,2	Pseudomonas aeruginosa	MT646431.1	99,90
T2-11	Hơi vàng ánh xanh, trơn bóng	8,0	Bacillus sonorensis	KT986188.1	100,0

Kết quả thử nghiệm sinh hóa bằng kít API 20E và API 50 CHB cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính catalase dương tính và khả năng đồng hóa đa dạng nhiều loại đường đơn, đường đôi và polysaccharide phức tạp. Hai chủng có hoạt lực sinh tổng hợp enzyme cao nhất là Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

2. Nghiên cứu sinh tổng hợp và đặc tính enzyme từ Bacillus subtilis G4

• Khảo sát đơn yếu tố: Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho B. subtilis G4 sinh tổng hợp CMCase cao nhất bao gồm: nhiệt độ nuôi cấy 37°C, pH ban đầu 7,0, tốc độ lắc 180 vòng/phút, tỷ lệ tiếp giống 2% (v/v), thời gian nuôi cấy tối ưu đạt đỉnh sau 48 giờ. Nguồn carbon bổ sung thích hợp nhất là tinh bột tan kết hợp bột đậu tương và casein là nguồn nitơ hữu hiệu.
• Tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm: Ứng dụng phần mềm Design-Expert 7 theo mô hình đáp ứng bề mặt RSM, phân tích phương sai hồi quy (ANOVA) đã xác định được sự tương tác có ý nghĩa thống kê giữa hàm lượng bột đậu tương, casein và tinh bột. Sau khi tối ưu, hoạt độ CMCase và mật độ tế bào của chủng G4 tăng rõ rệt so với môi trường cơ sở ban đầu.
• Thu nhận và đặc tính chế phẩm: Enzyme cellulase thô từ dịch nuôi cấy B. subtilis G4 được thu nhận hiệu quả bằng phương pháp kết tủa phân đoạn với muối amoni sunfat bão hòa và dung môi acetone lạnh. Chế phẩm cellulase kỹ thuật từ chủng G4 thể hiện hoạt tính tối ưu tại nhiệt độ 50°C và pH 6,0; enzyme giữ được độ bền nhiệt tương đối tốt ở dải nhiệt độ dưới 50°C và bền vững trong khoảng pH từ 5,5 đến 7,5.

3. Nghiên cứu sinh tổng hợp và đặc tính enzyme từ Cellulosimicrobium cellulans MP1

• Khảo sát điều kiện lên men: Chủng C. cellulans MP1 sinh trưởng và tích lũy CMCase tối đa sau 48-72 giờ nuôi cấy ở điều kiện 37°C, pH 7,5 và tốc độ lắc 150-180 vòng/phút. Nguồn nitơ hữu cơ (đặc biệt là bột đậu tương) và nguồn carbon thích hợp kích thích mạnh mẽ quá trình tổng hợp enzyme ngoại bào.
• Thu nhận và làm giàu chế phẩm: Chế phẩm cellulase từ chủng MP1 được kết tủa bằng dung môi ethanol tuyệt đối. Enzyme cellulase của chủng MP1 hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55°C, pH tối ưu 6,5; có độ bền pH rộng từ 6,0 đến 8,0 và độ bền nhiệt ổn định ở 50-60°C. Thử nghiệm khả năng phân giải giấy lọc (FPU) khẳng định chủng MP1 có hoạt tính phân giải cellulose tự nhiên cao.

Thông số đặc tính	Chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4	Chế phẩm cellulase từ C. cellulans MP1
Nhiệt độ tối ưu (°C)	50	55
pH tối ưu	6,0	6,5
Khoảng pH bền	5,5 – 7,5	6,0 – 8,0
Độ bền nhiệt (°C)	Bền ở $\le 50$	Bền ở $\le 55 - 60$
Tác nhân kết tủa tối ưu	$(NH_4)_2SO_4$ bão hòa / Acetone	Ethanol tuyệt đối
Thời gian sinh tổng hợp cực đại (giờ)	48	48 – 72

4. Phân tích hệ gen và kho tàng gen enzyme CAZy của Cellulosimicrobium cellulans MP1

Giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng MP1 bằng hệ thống Illumina HiSeq 2000 và lắp ráp de novo đã cung cấp bức tranh toàn diện về tiềm năng di truyền của vi khuẩn:

• Chú giải chức năng gen theo cơ sở dữ liệu COG cho thấy tỷ lệ lớn các gen liên quan đến quá trình vận chuyển và chuyển hóa carbohydrate (nhóm G).
• Khai thác cơ sở dữ liệu CAZy ghi nhận hệ thống phong phú các gen mã hóa enzyme thủy phân sinh khối thực vật, bao gồm:
  • Các họ Glycoside Hydrolase (GHs): Ghi nhận các enzyme endoglucanase thuộc họ GH5, GH12; cellobiohydrolase/exoglucanase thuộc họ GH6, GH48; β-glucosidase thuộc họ GH1, GH3; enzyme xylanase thuộc họ GH10, GH11; xylosidase và arabinofuranosidase.
  • Các họ Carbohydrate Esterase (CEs) và Polysaccharide Lyase (PLs) hỗ trợ cắt đứt các liên kết este acetyl và acid uronic trong hemicellulose và pectin.
  • Các module liên kết carbohydrate (CBMs/CBD) giúp enzyme bám dính đặc hiệu lên bề mặt cơ chất cellulose dạng tinh thể, gia tăng hiệu quả tiếp xúc và thủy phân.
• Kết quả so sánh hệ gen khẳng định chủng MP1 sở hữu tổ hợp gen hoàn chỉnh cho cả hai hệ thống phân giải cellulose và hemicellulose.

5. Thử nghiệm đường hóa rơm rạ

• Hiệu quả tiền xử lý kiềm: Rơm rạ sau khi xử lý bằng dung dịch NaOH đã loại bỏ phần lớn lignin và một phần hemicellulose, làm tăng tỷ lệ tiếp cận của cellulose đối với enzyme.

Thành phần (% chất khô)	Rơm thô trước tiền xử lý	Rơm sau tiền xử lý kiềm (NaOH)
Cellulose	38,45	62,18
Hemicellulose	24,12	16,35
Lignin	18,76	6,24
Thành phần khác (tro, ẩm, chất trích ly)	18,67	15,23

• Khảo sát quá trình đường hóa bằng enzyme từ chủng MP1:
  • Thời gian: Hiệu suất đường hóa tăng dần từ 12 giờ đến 48 giờ và đạt mức cân bằng sau 60-72 giờ.
  • Nhiệt độ: Hiệu suất đạt cao nhất tại 50°C.
  • pH: Môi trường đệm thích hợp nhất đạt hiệu suất tối ưu ở pH 6,0 - 6,5.
  • Tỷ lệ chất rắn/chất lỏng và nồng độ enzyme: Tỷ lệ cơ chất 5% (w/v) kết hợp nồng độ enzyme thích hợp cho hiệu suất chuyển hóa cellulose thành đường khử cao nhất.
  • Phân tích sản phẩm bằng HPLC: Dịch sau thủy phân chứa chủ yếu là glucose và cellobiose, cùng một lượng nhỏ xylose từ phần hemicellulose còn sót lại, chứng minh enzyme hoạt động hiệu quả trên sinh khối thực tế.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học

1. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về tính đa dạng và hoạt lực phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối bản địa, phân lập và định danh được các chủng thuộc chi Bacillus, Cellulosimicrobium, Klebsiella, Pseudomonas, Trabulsiella.
2. Lần đầu tiên công bố dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) của chủng Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối tại Việt Nam; giải mã chi tiết các cụm gen chức năng thuộc hệ CAZyome (các họ GH, CE, GT, CBM) liên quan trực tiếp đến cơ chế thủy phân phối hợp giữa cellulose và hemicellulose.
3. Xác định rõ ràng các thông số động học lên men và đặc tính lý hóa (pH, nhiệt độ, độ bền, tác nhân kết tủa) của chế phẩm cellulase từ hai chủng Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1.

Đóng góp về mặt thực tiễn

1. Tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn ruột mối (B. subtilis G4 và C. cellulans MP1) có tốc độ sinh trưởng nhanh, thời gian lên men ngắn (48-72 giờ), enzyme ngoại bào có độ bền nhiệt và bền pH tốt.
2. Xây dựng môi trường nuôi cấy tối ưu ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM (Design-Expert 7) sử dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có, giá thành thấp (tinh bột, bột đậu tương).
3. Thiết lập quy trình tiền xử lý kiềm và thủy phân rơm rạ tạo dịch đường khử giàu glucose phục vụ cho các quá trình lên men sinh học tiếp theo (sản xuất cồn sinh học hoặc hóa chất cơ bản).

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất ứng dụng chế phẩm enzyme cellulase thô từ vi khuẩn ruột mối trong việc xử lý phụ phẩm nông nghiệp sau thu hoạch tại chỗ nhằm giảm thiểu tình trạng đốt rơm rạ.
• Kiến nghị tiếp tục khai thác các gen mã hóa cellulase họ GH5, GH6, GH48 từ dữ liệu genome chủng MP1 để nghiên cứu biểu hiện tái tổ hợp quy mô lớn trên các sinh vật chủ công nghiệp như Escherichia coli hoặc Pichia pastoris.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác và mẻ lên men nhỏ); đối tượng sinh khối thực nghiệm chủ yếu tập trung vào rơm rạ; chưa tiến hành tinh sạch enzyme đến độ đồng thể hoàn toàn để xác định cấu trúc không gian bậc 3; chưa tiến hành biểu hiện tái tổ hợp thực nghiệm đối với từng gen GH riêng lẻ được dự đoán từ dữ liệu hệ gen.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng thử nghiệm lên men sinh tổng hợp enzyme trên hệ thống bioreactor quy mô pilot (bán công nghiệp) có kiểm soát tự động pH, oxy hòa tan và nhiệt độ.
  • Thử nghiệm khả năng thủy phân của phức hệ enzyme trên nhiều nguồn phụ phẩm lignocellulose khác như bã mía, thân cây ngô, vỏ trấu, mùn cưa.
  • Kỹ thuật di truyền biểu hiện các gen cellulase tiềm năng của chủng MP1 trong các vector biểu hiện nhằm nâng cao hoạt tính xúc tác và hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị cao đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Công nghệ thực phẩm, Kỹ thuật môi trường và Năng lượng tái tạo; cung cấp tài liệu tham khảo về quy trình phân lập vi sinh vật từ côn trùng, quy trình thiết kế thực nghiệm tối ưu hóa RSM bằng Design-Expert 7 và quy trình giải trình tự gen 16S rDNA.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực tin sinh học và enzyme học: Cung cấp phương pháp luận và số liệu thực tế về việc xử lý dữ liệu WGS từ hệ thống Illumina HiSeq 2000, chú giải hệ gen chức năng theo cơ sở dữ liệu COG và phân loại chi tiết các họ enzyme CAZy.
• Các doanh nghiệp và cơ sở sản xuất: Tham khảo quy trình công nghệ thu nhận enzyme cellulase kỹ thuật bằng kết tủa dung môi và quy trình xử lý rơm rạ bằng kiềm kết hợp đường hóa sinh học trong định hướng sản xuất nhiên liệu sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã định danh được các loài vi khuẩn ruột mối tiêu biểu nào bằng giải trình tự 16S rDNA?
Luận án đã định danh thành công các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam gồm: Bacillus subtilis G4 (độ tương đồng 99,19%), Cellulosimicrobium cellulans MP1 (99,93%), Cellulosimicrobium funkei MP3 (99,86%), Bacillus sonorensis T2-11 (100%), Klebsiella variicola CG4 (100%), Trabulsiella guamensis CG2 (99,69%) và Pseudomonas aeruginosa TM1-7-1 (99,90%).

2. Điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm cellulase từ hai chủng G4 và MP1 khác nhau như thế nào?
Chế phẩm cellulase từ chủng B. subtilis G4 hoạt động tối ưu ở 50°C và pH 6,0, bền ở nhiệt độ $\le 50^\circ\text{C}$ và khoảng pH 5,5-7,5. Trong khi đó, chế phẩm từ C. cellulans MP1 có hoạt tính tối ưu ở 55°C và pH 6,5, có khả năng chịu nhiệt và bền pH rộng hơn (bền ở nhiệt độ $\le 55-60^\circ\text{C}$ và pH 6,0-8,0).

3. Phương pháp nào được sử dụng để tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cho chủng G4?
Tác giả đã kết hợp phương pháp khảo sát đơn yếu tố (OFAT) để chọn nguồn carbon (tinh bột) và nitơ (casein, bột đậu tương), sau đó áp dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) theo mô hình Box-Behnken trên phần mềm Design-Expert 7 để tối ưu hóa nồng độ các thành phần dinh dưỡng, được kiểm chứng bằng phân tích phương sai ANOVA.

4. Dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) của chủng C. cellulans MP1 đã phát hiện những nhóm gen chức năng nào?
Dữ liệu WGS từ máy Illumina HiSeq 2000 phân tích qua cơ sở dữ liệu COG và CAZy đã chỉ ra chủng MP1 sở hữu các họ Glycoside Hydrolase đa dạng gồm GH5, GH12 (endoglucanase), GH6, GH48 (cellobiohydrolase/exoglucanase), GH1, GH3 (β-glucosidase), các họ xylanase GH10, GH11, các họ Carbohydrate Esterase (CEs) và module gắn kết carbohydrate (CBMs), chứng minh khả năng phân giải hoàn chỉnh phức hệ lignocellulose.

5. Hiệu quả của bước tiền xử lý kiềm đối với thành phần rơm rạ và quá trình đường hóa bằng enzyme ra sao?
Tiền xử lý rơm rạ bằng dung dịch NaOH đã làm giảm hàm lượng lignin từ 18,76% xuống còn 6,24% và giảm hemicellulose từ 24,12% xuống 16,35%, qua đó làm tăng tỷ lệ cellulose khả dụng từ 38,45% lên 62,18%. Dịch thủy phân rơm sau tiền xử lý bởi enzyme từ chủng MP1 thu được dịch đường giàu glucose và cellobiose khi phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đào Thị Thanh Xuân là công trình nghiên cứu toàn diện và có hệ thống về hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối tại Việt Nam. Công trình đã phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa thành công điều kiện sản xuất enzyme từ hai chủng triển vọng Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1. Việc giải mã toàn bộ hệ gen của chủng MP1 đã làm sáng tỏ tiềm năng di truyền và cấu trúc các họ enzyme CAZy tham gia phân giải sinh khối thực vật. Kết quả thử nghiệm đường hóa rơm rạ sau tiền xử lý kiềm khẳng định tính khả thi của việc ứng dụng phức hệ enzyme vi khuẩn ruột mối trong chuyển hóa phụ phẩm nông nghiệp thành nguồn nguyên liệu sinh học hữu ích.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Lignocellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế chúng còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp, công nghiệp gỗ, công nghiệp giấy và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến hơn 100 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người.

Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn. Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường, các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose. Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả lignocellulose. Mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác.

Hệ vi sinh vật trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong quá trình phân giải cellulose. Do vậy mối được xem là đối tượng tiềm năng để phân lập vi khuẩn sinh cellulase. Có rất nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều loài mối khác nhau ở Malaysia, Nepal, Ấn Độ, Úc. Kỹ thuật giải trình tự gen của vi khuẩn đang là công cụ được khai thác để dự đoán các gen mã hóa sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học của chủng.

Cho đến nay đã có các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật metagenomics để đánh giá đa dạng sinh học hệ vi khuẩn trong ruột mối, khai thác các chủng vi sinh vật chịu kiềm, dự đoán các gen mã hóa sinh tổng hợp enzym…. Tuy nhiên, việc phân lập, thu nhận các vi sinh vật có khả năng sinh cellulase từ ruột mối cũng như giải trình tự hệ gen của chủng phân lập được để có thể dự đoán tiềm năng sinh cellulase của chủng đến nay chưa được nghiên cứu đầy đủ, có hệ thống. Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam” với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn để có thể dự đoán các gen liên quan đến mã hóa các enzym phân giải 1 luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep cellulose và hemicellulose, từ đó đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu giàu cellulose của chủng.

Mục tiêu của đề tài - Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam - Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn phân lập được làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam 2. Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối (2) Định tên một số vi khuẩn có khả năng sinh cellulase phân lập được từ ruột mối (3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn (4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính cellulase của chế phẩm (5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam.

(2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối (3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans MP1 và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng. (4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm Ý nghĩa thực tiễn (1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối 2 luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep (2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này. Đóng góp mới của đề tài - Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống về phân lập và thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối. - Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thông qua đó dự đoán tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose.

3 luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep do an to nghiep docx 123docz luan van hay luan van tot nghiep Chƣơng 1. Phân loại cellulase Cellulase là một phức hệ enzym thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4 glucoside hay phá vỡ liên kết hydro trong phân tử cellulose. Cellulase có thể được chia thành 3 enzym chính dựa trên cơ chế hoạt động, trình tự axit amin và cấu trúc của chúng Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.4) Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.4) còn có tên gọi khác nhau là Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-glucanase, β-1,4-Endoglucan hydrolase, cellulase A, cellulosin AP, celludextrinase, carboxymethylcellulase…cơ chế hoạt động của enzym này là tấn công cellulose một cách ngẫu nhiên tại các vị trí bên trong phân tử cellulose và phân cắt chuỗi polysaccharid bằng việc chèn các phân tử nước vào giữa các liên kết β-1,4 glucosid. Kết quả tạo ra các chuỗi glucan có độ dài khác nhau.

Enzym này có thể thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của các cơ chất cellulose, lignin và các β-D-glucan của ngũ cốc [1].91) enzym này còn có tên gọi khác như Exo-β-1,4- glucanase, cellobiohydrolase, Exo-cellobiohydrolase, Exo- β-1,4-glucan cellobiohydrolase, cellobiose, C1 cellulase… bắt đầu bằng việc tấn công vào đầu khử hoặc không khử của chuỗi polysacharid và giải phóng các β-cellobiose. Exoglucanse có thể hoạt động lên các cellulose dạng tinh thể, lên lớp vỏ bên ngoài chuỗi cellulose của cấu trúc tinh thể. Đặc điểm hình học có ý nghĩa nhất của phần xúc tác của CBHs là cấu trúc hình ống được tạo ra hai lớp bề mặt. Cấu trúc hình ống này có thể toàn bộ hoặc một phần của trung tâm hoạt động.

Dạng hình ống của trung tâm hoạt động có thể là hình dáng duy nhất của exoglucanase. CBHs là exoglucanse thường gặp nhất.