CHƯƠNG I: TÔNG QUAN Luận văn Thạc sĩ khóa 2012 HVTH: Tran Thị Linh Giang 1.1 Enzyme cố định [9, 11, 19] Enzyme là những protein có cau tạo phức tap và đóng vai trò xúc tac sinh học, có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiêu hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thé sống.1 Khái niệm enzyme cố định Enzyme có định (hay enzyme không tan) là enzyme có sự tham gia hoạt động trong một không gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của enzyme băng cách gắn enzyme vào một pha cách ly tách rời khỏi pha lỏng tự do và ở đó enzyme vẫn có khả năng tiếp xúc với các phân từ cơ chất. Pha gắn enzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước. Loi ích của việc sử dụng enzyme cô định: Giảm giá thành do enzyme được sử dụng lặp lại nhiều lần với cùng một kiểu phản ứng xúc tác, chế phẩm bên hơn trong các điều kiện pH, nhiệt độ, áp suất thấm thấu tối uu, tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động hóa cao.
Tạo enzyme cô định tương đối dễ, đầu tư vào xây dựng và sản xuất tương đối ít, sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme (chỉ một số ít bị rửa trôi theo dòng chảy của tác nhân), có thé dễ dàng tô chức sản xuất các sản phẩm lên men bang enzyme ngoại bao như: ethanol, acid hữu co, aminoacid, vitamin. Từ hai đặc điểm trên cho thay, sử dung enzyme không hòa tan có ý nghĩa kinh tế hon sử dung enzyme hòa tan nhiều lần.2 Đặc điểm của enzyme cố định Khi gắn enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme này có những đặc điểm khác hắn enzyme hòa tan Hoạt tính của enzyme không hòa tan thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme hòa tan cùng loại. Enzyme không hòa tan có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại vì đã được bảo vệ bởi chất mang. Enzyme không hòa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan chứ không trùng với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại.
Enzyme không hòa tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme cùng loại. Luận văn Thạc sĩ khóa 2012 HVTH: Tran Thị Linh Giang - _ Ta có thé tái sử dụng enzyme không hòa tan nhiêu lần. Trong khi đó, enzyme hòa tan chỉ có thể sử dụng một lần. Đặc điểm này rất có ý nghĩa về kinh tế khi ta tiến hành các phản ứng theo quy mô công nghiệp.3 Các phương pháp cô định enzyme Các phương pháp cô định enzyme | | ắ Các Iphương Các phươn pháp chow pháp cho enzyme hòa tan enzyme không oa tan l Phương pháp a ~ Phuong phap tạo liên kết Tạo dân xuât nhôt enzyme = Nhốt enzyme Tao lién két Tao lién két 4 Khong dẫn xuất trong gel chéo chất mang |_| Nhốt enzyme trong hệ sợi - âp phụ vật lý lên két ion ién két kim loai —¬ Tạo màng boc lên kết đồng hóa 1 Hình 1.1: Các phương pháp cô định enzyme Luận văn Thạc sĩ khóa 2012 HVTH: Tran Thị Linh Giang 1.2 Có định enzyme băng phương pháp cross-linking enzyme ageregates (CLEA) 1.1 Phuong pháp cross-linking enzyme aggregates ( CLEA) * Định nghĩa phương pháp CLEA [43] Sản phẩm của phương pháp CLEA là các enzyme được gan kết lại với nhau bởi những liên kết chéo với tác nhân gan nhị chức dialdehyde, sau khi đã được tập hợp lại gan nhau, và có thé tái sử dụng được.
Những năm gần đây, các nghiên cứu đã cho thay khả năng xúc tác rat mạnh của các enzyme liên kêt chéo này. XSNH —m 2 Cr il e} — A) aggregation «= pp |p | { cross limkimg [ex] e — Hình 1.2: Minh hoa các tiễn trình xảy ra trong cô định enzyme bằng ki thuật CLEA * Lich sử phát triển của kĩ thuật có định CLEA [42] Các phương pháp cô định enzyme có thé được chia thành ba loại: liên kết với chất mang, vi gói trong gel vô cơ hoặc hữu cơ và liên kết chéo giữa các phân tử enzyme. Liên kết với chất mang chắc chắn sẽ làm giảm hoạt động xúc tác của enzyme do một lượng lớn enzyme nam phía trong không tham gia xúc tácvì bị chất mang che khuất không tiếp xúc được với cơ chất. Dạng cô định này làm giảm năng suất sản phẩm.
tăng thời gian và không gian xử lý cơ chất với enzyme vì khả năng xúc tác của enzyme thấp hơn. Ngược lại, cố định enzyme qua liên kết chéo giữa các phân tử enzyme bởi tay gan nhị chức là một phương pháp cố định không cần chất mang và kết quả xúc tac đảm bảo gan như là 100% enzyme cô định đều hoạt động. Kĩ thuật liên kết chéo enzyme, thông qua phản ứng của tay gắn, ví dụ như glutaraldehyde với nhóm -NH; trên bề mặt enzyme, đã được phát triển cách đây 40 năm. Tuy nhiên, các enzyme liên kết chéo lại cho thấy khả năng duy trì hoạt động thấp, khả năng tái sử dụng kém và ôn định cơ học thấp, và vì bản Luận văn Thạc sĩ khóa 2012 HVTH: Tran Thị Linh Giang chất keo của enzyme có định này nên rất khó dé thao tác.
Do đó, phương pháp cô định enzyme liên kết với chất mang phố biến hơn phương pháp liên kết chéo. Sau đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng phương pháp CLEC (liên kết chéo giữa các tinh thể enzyme) như là một chất xúc tác công nghiệp, được phát triển vào đầu những năm 1990 và sau đó được thương mại hóa bởi Altus Biologics. Phương pháp này áp dụng đối với phố enzyme rộng và enzyme dạng CLEC thể hiện khả năng ôn định tốt với nhiệt độ, dung mồi hữu cơ và các quá trình phân giải enzyme hơn là enzyme hòa tan hoặc enzyme bột đông khô tương ứng. Chính vì khả năng ôn định hoạt động tốt, kích thước hạt dễ kiểm soát và dễ tái sử dụng, kết hợp với hoạt tính xúc tác cao và năng suất sản phẩm lớn, làm cho enzyme dang CLEC trở thành phương tiện chuyển hóa sinh học lý tưởng cho công nghiệp.
Nhưng điều kiện của phương pháp CLEC cần phải là enzyme tinh thé, một tiền trình rất mat thời gian và đòi hỏi enzyme phải có độ tinh khiết cao. Các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu và thay rằng, nếu như bố sung thêm mudi, dung môi hữu cơ hoặc polymer không ion vào dịch enzyme hòa tan dẫn đến hiện thượng tủa vật lý, các phân tử enzyme tập hợp lại với nhau bang liên kết không cộng hóa tri mà không làm ảnh hưởng đến cau trúc bậc 3 của enzyme. Điều này được lý giải răng liên kết chéo của các chất kết tủa vật lý sẽ làm cho enzyme vĩnh viễn không hòa tan trong khi vẫn duy tri được siêu cau trúc như ban dau, kế cả hoạt động xúc tác. Nghiên cứu này đã tạo tiền dé để phát triển một phương pháp cố định enzyme mới, đó là CLEA.
Chính vì phương pháp tủa thường được sử dụng để làm sạch enzyme, nên CLEA đã kết hợp được quá trình làm sạch và quá trình cố định vào một bước duy nhất. Nghiên cứu cô định penicillin G amidase (EC 3.11 ) bằng kĩ thuật CLEA được tiến hành, đây là một enzyme công nghiệp quan trọng được sử dụng trong quá trình sản xuất penicillin bán tổng hợp và kháng sinh cephalosporin. Các enzyme tự do bị giới hạn trong khả năng ôn định hoạt tính khi nhiệt độ thay đổi và khả năng chịu được dung môi hữu cơ thấp, vì thé enzyme nàylà một ứng cử viên lý tưởng cho nghiên cứu cô định bằng kĩ thuật CLEA .That vậy, penicillin G midase dạng CLEA (tủa với ammonium sulfate hoặc t- butanol) được chứng minh là chất xúc tác hiệu quả cho quá trình tổng hợp ampicillin. Dang chú ý là năng suất của enzyme CLEA thậm chí còn cao hơn SO với các enzyme tự do, và cao hơn đáng kê so với của CLEC.
Tương tự, các Luận văn Thạc sĩ khóa 2012 HVTH: Tran Thị Linh Giang enzyme CLEA penicillin G amidase cũng duy trì hoạt tính cao trong dung môi hữu cơ hơn là enzyme CLEC tương ứng. Glutaraldehyde được sử dụng là tay gan trong phương pháp cố định enzyme băng liên kết chéo vì hợp chất này rẻ tiền và có sẵn trong thương mại với số lượng lớn. Tuy nhiên, với một SỐ enzyme, ví dụ nitrilase, đôi khi nhận được kết quả là hoạt tính rất thấp hoặc không còn hoạt động khi dùng glutaraldehyde làm tay gắn. Các nhà khoa học cho rang điều này có thé là do phản ứng của tay gắn với amino acid là rất quan trọng cho hoạt động của enzyme.
Chính vì một lý do đặc biệt và có ảnh hưởng rất nghiêm trọng của glutaraldehyde là có khả năng phản ứng rất mạnh và kích thước lại nhỏ, glutaraldehyde có thé chen vào trong cấu trúc nội tại của enzyme làm anh hưởng tới trung tâm hoạt động. Để khắc phục van dé này, polyaldehyde công kênh đã được sử dụng để thay thế glutaraldehyde, hợp chất này được thu nhận từ quá trình oxy hóa periodate dextran, tiếp theo cho tác dụng với natri borohydride dé tạo thành mối liên kết amin không thé đảo ngược. Việc thay thế này giúp khối CLEA đem lại kết quả cao hơn nhiều so với khi thử nghiệm tay gan glutaraldehyde. Kết quả thu được cũng 4n tượng khi ứng dụng với nitrilase khác.
Liên kết chéo với glutaraldehyde tạo thành khối CLEA hoàn toàn không hoạt động trong khi với dextran polyaldehyde thì duy trì được hoạt tính khoảng 50-60% (chưa tôi ưu).2 Liên kết giữa glutaraldehyde với enzyme 1. Giới thiệu về glutaraldehyde [29, 30] % Đặc điểm — Cong thức phân tử: CsHgQO>. — Khối lượng phân tử: 100,12 g/mol. — Thành phan nguyên t6:C:59,98%; H: 8,05%; O: 31,07%.
— Danh pháp IUPAC: Pentane- [,5-dial. — lên khác: Pentanedial, glutardialdehyde, glutaric acid dialdehyde, glutaric aldehyde, glutaric dialdehyde, | ,5-pentanedial. * Tinh chat * Tính chat vật ly — Là chất lỏng màu vàng. — Có mùi đặc trưng.
— Tan nhiều trong nước. — Ty trọng: 1,06 g/ml. Luận văn Thạc sĩ khóa 2012 HVTH: Tran Thi Linh Giang — Điểm nóng chảy: -14°C, 259K, 7°F — Điểm sôi: 187°C, 460K, 369°F + Tinh chất hóa hoc Tính chất hóa học của glutaraldehyde do nhóm chức aldehyde quyết định. Tính chất của nhóm aldehyde bao gồm những phản ứng đặc trưng sau: w Phản ứng cộng với hydro Aldehyde tác dụng với hydro, dưới điều kiện xúc tác và nhiệt độ thích hợp tạo thành alcol bậc nhất.
R-CHO+H,— R-CH;OH v. Phản ứng với các amin bậc | Aldehyde tác dụng với amin bậc | cho ra sản phẩm là imine và nước.