Nghiên cứu enzyme cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập tại Việt Nam

Luận án tiến sĩ nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam, ứng dụng trong công nghệ sinh học và xử lý sinh khối.

• Tác giả: Đào Thị Thanh Xuân
• Người hướng dẫn: PGS. TS Lê Thanh Hà
• Trường học: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Phân loại cellulase
• 1.2. Nguồn thu nhận cellulase
• 1.3. Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn
• 1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
• 1.3.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
• 1.4. Đặc tính của enzyme cellulase từ vi khuẩn
• 1.4.1. pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym
• 1.4.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất phụ gia đến hoạt độ enzym
• 1.5. Tổng quan về mối
• 1.5.1. Phân loại Mối
• 1.5.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối
• 1.5.3. Vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối
• 1.6. Ứng dụng của cellulase trong xử lý lignocellulose
• 1.6.1. Thành phần của lignocelluloses
• 1.6.2. Hệ enzym phân giải Lignocellulose
• 1.6.3. Sự phối hợp tác động giữa các enzym
• 1.6.4. Ứng dụng cellulase trong quá trình thủy phân lignocellulose
• 1.7. Ứng dụng giải trình tự genome phát hiện tiềm năng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase trong phân giải lignocellulose
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Các chủng vi khuẩn
• 2.2. Thiết bị và hóa chất
• 2.3. Các môi trường nuôi cấy
• 2.3.1. Môi trường làm giàu vi khuẩn sinh cellulase
• 2.3.2. Môi trường giữ giống, nhân giống và phân lập
• 2.3.3. Môi trường sinh tổng hợp enzym
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp cellulase
• 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối
• 2.4.1.2. Xác định định tính khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập
• 2.4.1.3. Xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn sinh cellulase
• 2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp cellulase
• 2.4.2.1. Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 2.4.2.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến sinh tổng hợp enzym
• 2.4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận
• 2.4.2.4. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy
• 2.4.2.5. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm tối ưu môi trường sinh tổng hợp CMCase cho Bacillus subtilis G4 sử dụng phần mềm Design Expert 7
• 2.4.3. Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Bacillus subtilis G4
• 2.4.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase từ vi khuẩn
• 2.4.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase thu nhận
• 2.4.4. Khảo sát khả năng thủy phân rơm sử dụng cellulase thu nhận từ vi khuẩn
• 2.4.4.1. Phương pháp tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose
• 2.4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất đường hóa lignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1
• 2.4.5. Phương pháp định tên vi khuẩn thông qua giải trình tự 16S rDNA
• 2.4.6. Phương pháp giải trình tự hệ genom của Cellulosimicrobium cellulans MP1 và dự đoán gen chức năng
• 2.4.6.1. Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn
• 2.4.6.2. Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina
• 2.4.6.3. Lắp ráp de novo hệ gen và đánh giá chất lượng lắp ráp
• 2.4.6.4. Dự đoán gen và chú giải hệ gen
• 2.4.7. Các phương pháp phân tích
• 2.4.7.1. Xác định hoạt độ các enzym
• 2.4.7.2. Xác định hàm lượng protein
• 2.4.7.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu
• 2.4.7.4. Xác định hàm lượng cellulose
• 2.4.7.5. Xác định hàm lượng lignin
• 2.4.7.6. Phương pháp xác định lượng đường trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao
• 3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng lựa chọn
• 3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa
• 3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối
• 3.3. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G4
• 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase
• 3.3.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase
• 3.3.1.2. Ảnh hưởng của các thông số lên men đến hoạt độ CMCase
• 3.3.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase
• 3.3.2. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chế phẩm
• 3.3.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4
• 3.3.2.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. subtilis G4
• 3.3.3. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose
• 3.4. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium MP1
• 3.4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1
• 3.4.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase
• 3.4.1.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật nuôi cấy tới sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn MP1
• 3.4.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase
• 3.4.1.3.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ
• 3.4.1.3.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon
• 3.4.1.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellulase
• 3.4.2. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol
• 3.4.3. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp.
• 3.4.4. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp.
• 3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của chủng C. cellulans MP1
• 3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1
• 3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1
• 3.5.3. So sánh COG toàn bộ genome và các enzyme liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate
• 3.5.4. Khai thác các enzyme thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng C. cellulans MP1
• 3.6. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ MP1
• 3.6.1. Xác định thành phần nguyên liệu rơm
• 3.6.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân
• 3.6.3. Ảnh hưởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu enzyme cellulase từ vi khuẩn ruột mối

Nghiên cứu enzyme cellulase từ vi khuẩn ruột mối tại Việt Nam là một đề tài quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Cellulase là một enzyme có khả năng thủy phân cellulose, thành phần chính của sinh khối thực vật. Việc khai thác enzyme này từ vi khuẩn ruột mối mở ra tiềm năng lớn trong xử lý phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, và bã mía. Luận án tiến sĩ này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase từ ruột mối tại Việt Nam.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập và đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối. Ngoài ra, nghiên cứu còn hướng đến việc giải trình tự và phân tích hệ gen của các chủng vi khuẩn này để đánh giá tiềm năng phân giải cellulose. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần vào việc phát triển các ứng dụng thực tiễn trong xử lý lignocellulose và sản xuất nhiên liệu sinh học.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học lớn khi cung cấp dữ liệu về sự đa dạng của vi khuẩn ruột mối và khả năng sinh tổng hợp cellulase của chúng. Về mặt thực tiễn, kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong các lĩnh vực như xử lý phế phẩm nông nghiệp, sản xuất ethanol, và thức ăn gia súc. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen để phân tích tiềm năng của vi khuẩn trong phân hủy lignocellulose.

II. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập vi khuẩn từ ruột mối, tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao, và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme. Các chủng vi khuẩn được định danh và đánh giá đặc tính sinh lý, hóa sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase và tiềm năng ứng dụng của chúng trong thủy phân lignocellulose.

2.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

Quá trình phân lập vi khuẩn từ ruột mối được thực hiện thông qua các môi trường nuôi cấy đặc hiệu. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase cao được tuyển chọn và đánh giá về khả năng sinh tổng hợp enzyme. Kết quả cho thấy sự hiện diện của nhiều chủng vi khuẩn có tiềm năng trong việc thủy phân cellulose.

2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp cellulase

Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, và nguồn dinh dưỡng để tăng cường khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy rằng các điều kiện tối ưu có thể cải thiện đáng kể hoạt tính enzyme, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

III. Ứng dụng và triển vọng

Nghiên cứu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn. Cellulase enzyme từ vi khuẩn ruột mối có thể được sử dụng trong xử lý phế phẩm nông nghiệp, sản xuất ethanol, và thức ăn gia súc. Kết quả nghiên cứu cũng góp phần vào việc phát triển các công nghệ sinh học bền vững tại Việt Nam.

3.1. Ứng dụng trong xử lý lignocellulose

Cellulase từ vi khuẩn ruột mối có tiềm năng lớn trong việc thủy phân lignocellulose, một thành phần chính của phế phẩm nông nghiệp. Ứng dụng này có thể giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra các sản phẩm có giá trị từ phế phẩm.

3.2. Triển vọng trong sản xuất nhiên liệu sinh học

Việc sử dụng cellulase trong thủy phân lignocellulose có thể mở ra hướng đi mới trong sản xuất nhiên liệu sinh học. Đây là một giải pháp bền vững để thay thế nhiên liệu hóa thạch, góp phần vào việc bảo vệ môi trường và phát triển kinh tế.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 9420201) của nghiên cứu sinh Đào Thị Thanh Xuân, với đề tài "Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam", được thực hiện tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Lê Thanh Hà và PGS. TS. Phí Quyết Tiến (bảo vệ năm 2021).

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, tác giả trình bày rằng cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật và là nguồn nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Tại Việt Nam, nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu cellulose (rơm, rạ, lá mía, bã mía) ước tính thải ra hàng năm lên tới 50 triệu tấn; biện pháp xử lý chủ yếu hiện nay vẫn là đốt ngoài đồng ruộng, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng. Việc chuyển hóa nguồn lignocellulose phế thải này thành đường lên men phục vụ công nghiệp giấy, thức ăn gia súc và sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai đòi hỏi hệ enzyme phân giải hiệu quả. Trong tự nhiên, mối đóng vai trò quan trọng trong việc khoáng hóa sinh khối gỗ và vật liệu thực vật nhờ hệ vi sinh vật cộng sinh đường ruột, vốn đảm nhiệm tới trên 70% quá trình thủy phân cellulose trong các đoạn ruột. Mặc dù Việt Nam đã ghi nhận hơn 100 loài mối khác nhau, việc phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột mối nhằm khai thác enzyme cellulase cũng như phân tích hệ gen phục vụ phân giải lignocellulose trước đây chưa được nghiên cứu hệ thống.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định rõ gồm hai nội dung chính:

1. Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam.
2. Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối thu thập tại Việt Nam, trong đó tập trung sâu vào hai chủng tuyển chọn có hoạt tính cao là Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1. Phạm vi không gian lấy mẫu bao gồm tỉnh Nghệ An (huyện Thanh Chương, huyện Nghi Lộc, núi Quyết thuộc thành phố Vinh) và thành phố Hà Nội (khuôn viên Trường Đại học Bách khoa Hà Nội). Phạm vi thời gian thu thập mẫu thực địa kéo dài từ tháng 9/2014 đến tháng 9/2016.

Nội dung nghiên cứu của luận án được chia thành 6 nhiệm vụ cụ thể:

1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối.
2. Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối.
3. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn.
4. Thu nhận cellulase từ hai chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính carboxymethylcellulase (CMCase) của chế phẩm.
5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (Cellulosimicrobium cellulans MP1).
6. Sử dụng dịch enzyme thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose (rơm).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong chương tổng quan, tác giả hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến cấu trúc lignocellulose, phức hệ enzyme cellulase, hệ vi sinh vật ruột mối và ứng dụng hệ gen học:

Về cơ chế enzyme, cellulase là phức hệ gồm ba enzyme chính tác động hiệp đồng:

• Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.4, thường gọi là endoglucanase, EG hoặc CMCase): thủy phân ngẫu nhiên các liên kết nội mạch β-1,4-glucosidic trong vùng vô định hình của cellulose.
• Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.91, cellobiohydrolase, CBH): tấn công vào đầu khử hoặc không khử của mạch cellulose tinh thể, giải phóng cellobiose disaccharide.
• β-D-glucosidase (EC 3.2.1.21, BG): thủy phân cellobiose và cellodextrin tan thành monomer glucose. Hệ enzyme phân giải lignocellulose còn kết hợp chặt chẽ với hemicellulase (endoxylanase EC 3.2.1.8, β-D-xylosidase EC 3.2.1.37) và được phân loại theo cơ sở dữ liệu CAZy thành các họ Glycoside Hydrolases (GHs - 133 họ), Polysaccharide Lyases (PLs), Carbohydrate Esterases (CEs), Auxiliary Activities (AAs) và các mô-đun gắn kết carbohydrate (CBMs - 68 họ).

Tác giả điểm lại các mốc phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ tự nhiên: Hungate (1957) phân lập từ dạ cỏ động vật nhai lại; Black và cộng sự (1985) từ đất; Madden (1982) từ phân động vật; Stutzenberger và cộng sự (1970) từ rác thải đô thị; Murray và cộng sự (1984) từ nước thải cống; Sissons và cộng sự (1987) từ suối nước nóng.

Đối với vi khuẩn ruột mối, Hethener và cộng sự (1992) đã phân lập chủng kỵ khí Clostridium termitidis từ loài mối ăn gỗ Nasutitermes lujae. Wenzel và cộng sự (2001) phân lập 119 chủng từ mối bậc thấp Zootermopsis angusticollis, thuộc các chi Cellulomonas, Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Microbacterium, Kocuria, Agrobacterium/Rhizobium. Chen và cộng sự phân lập từ Heterotermes và Odontotermes các chủng Bacillus, Staphylococcus, Enterobacter, ghi nhận Bacillus cereus có hoạt độ endoglucanase 5,06 U/mg, FPase 2,52 U/mg và β-glucosidase 6,01 U/mg. Tại Indonesia, Ferbiyanto phân lập Bacillus megaterium và Paracoccus yeei từ Macrotermes gilvus. Tại Ai Cập, các loài Paenibacillus lactis, Lysinibacillus macrolides, Stenotrophomonas maltophilia được tìm thấy từ Psammotermes hypostoma.

Về phương pháp không qua nuôi cấy, Hongoh và cộng sự (2006) và Husseneder và cộng sự chứng minh tính đa dạng cao của vi khuẩn ruột mối qua phân tích 16S rRNA với hơn 1.500 phylotype thuộc 24 ngành. Tại Việt Nam, Nguyễn Thanh Ngọc và cộng sự đã ứng dụng metagenomics trên loài mối Coptotermes gestroi, chỉ ra các ngành Firmicutes, Proteobacteria và Spirochaetes chiếm ưu thế. Các nghiên cứu tiếp theo của Đỗ Thị Huyền và Nguyễn Thị Thảo khảo sát gen cellulase từ hệ vi sinh vật ruột mối ở Việt Nam.

Về ứng dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen (whole-genome sequencing), các công trình của Pasari và cộng sự trên Paenibacillus polymyxa A18 (4.608 gen), Zheng và cộng sự trên Cellulosimicrobium sp. TH-20, công bố về Parvularcula flava NH6-79T (3.465 gen với 96 gen GH), An và cộng sự (2021) trên Micromonospora sp. CP22 (63 CAZymes), Li và cộng sự (2020) trên Bacillus velezensis LC1 (31 gen phân giải lignocellulose) và Tartar và cộng sự trên cDNA ruột mối Reticulitermes flavipes cho thấy giải trình tự genome là công cụ quan trọng để giải mã tiềm năng enzyme phân giải sinh khối.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: kết hợp phân lập vi khuẩn hiếu khí/vi hiếu khí từ ruột các mẫu mối thu thập ở Việt Nam, khảo sát đặc tính sinh hóa, tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp enzyme, giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng Cellulosimicrobium cellulans MP1 để lập danh mục các gen CAZymes, đồng thời đánh giá khả năng thủy phân sinh khối rơm lúa thực tế.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh lý chuyển hóa carbohydrate của vi sinh vật, cấu trúc phân tử lignocellulose, cơ chế xúc tác thủy phân của các họ enzyme glycoside hydrolase và phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm thống kê.

Nguồn tư liệu và mẫu vật nghiên cứu

Mẫu mối được thu thập từ 8 nhóm điểm lấy mẫu thực tế:

Ký hiệu mẫu	Dạng tổ hoặc giá thể	Địa điểm lấy mẫu	Thời gian	Cơ chất làm giàu	Ký hiệu chủng phân lập
01	Thân gỗ mục	Núi Quyết, TP. Vinh, Nghệ An	09/2014	CMC, Giấy lọc	GC, GP
02	Thân gỗ mục	Xã Thanh Mỹ, Thanh Chương, Nghệ An	09/2014	CMC, Giấy lọc	TC, TP
03	Cây xoài	Trường Đại học Vinh, Nghệ An	06/2015	CMC, Giấy lọc	HC, HP
04	Thân mía mục	Xã Thanh Mỹ, Thanh Chương, Nghệ An	09/2016	CMC, Giấy lọc	MC, MP
05	Cây bằng lăng	Trường ĐH Bách khoa Hà Nội	10/2014	CMC	T
06	Cây phượng	Trường ĐH Bách khoa Hà Nội	06/2015	CMC	TM
07	Đất	Trường ĐH Bách khoa Hà Nội	08/2015	CMC, Cám gạo	D, CG
08	Cây sấu	Trường ĐH Bách khoa Hà Nội	06/2015	CMC, Giấy lọc	CM, G

Hệ thống môi trường nuôi cấy

• Môi trường làm giàu (M1 đến M6): M1 (NaNO3, KH2PO4, CaCl2, NaCl, MgSO4, CMC/giấy lọc); M2 (bổ sung KCl, Peptone); M3 (chứa K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, CaCl2, FeSO4, MgCl2); M4 (M3 + glucose 0,2 g/l); M5 (M3 + peptone 0,2 g/l); M6 (cám gạo 2%, bột đậu nành 1%, casein 1%, NaCl 0,5%).
• Môi trường giữ giống và phân lập: D5 (NaNO3 2 g/l, K2HPO4 1 g/l, MgSO4 2 g/l, KCl 1 g/l, Peptone 2 g/l, CMC 5 g/l, Agar 18 g/l, pH 7,0).
• Môi trường sinh tổng hợp enzyme: LB bổ sung CMC hoặc giấy lọc 5 g/l; môi trường M3; môi trường M6; môi trường D6 (Peptone 2 g/l, CMC 10 g/l, K2HPO4 4 g/l, MgSO4 0,06 g/l, (NH4)2SO4 0,5 g/l, Gelatin 0,4 g/l).

Phương pháp thực nghiệm

• Phân lập và sàng lọc: Ruột mối nghiền được hoạt hóa trong môi trường lỏng 3 ngày (với CMC) hoặc 14 ngày (với giấy lọc). Cấy trang trên thạch D5, ủ ở 30°C trong 2–7 ngày. Hoạt tính tạo vòng phân giải được kiểm tra bằng nhuộm Congo đỏ 1% trong 15 phút và rửa bằng NaCl 1M trong 20 phút. Năng lực thủy phân được tính bằng tỷ lệ $D/d$ ($D$: đường kính vòng phân giải; $d$: đường kính khuẩn lạc).
• Đặc tính sinh lý, sinh hóa và định danh: Nhuộm Gram, thử nghiệm KOH, phản ứng catalase, khả năng di động, sử dụng hệ kít sinh hóa API 20E, API 20NE và API 50 CHB (Biomerieux, Pháp). Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (JSM-5410, JEOL, Nhật Bản). Chiết tách DNA tổng số, khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492R (5'-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3'), giải trình tự trên máy ABI PRISM 3100-Avant, so sánh tương đồng qua BLAST và Clustal W.
• Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Khảo sát đơn yếu tố (tỷ lệ giống 5–15%, tốc độ lắc 0–250 vòng/phút, nhiệt độ 25–45°C, pH ban đầu 3–9, thời gian 24–96 giờ; các nguồn cacbon và nitơ). Tối ưu hóa đa yếu tố môi trường sinh CMCase cho Bacillus subtilis G4 bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) trên phần mềm Design-Expert 7.1, kiểm định bằng phân tích phương sai (ANOVA).
• Thu nhận và xác định tính chất enzyme: Tách tế bào bằng ly tâm lạnh 6.000 vòng/phút ở 4°C. Kết tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4, dung môi acetone hoặc ethanol tuyệt đối. Đánh giá nhiệt độ tối ưu (30–80°C), độ bền nhiệt (ủ 30 phút ở 30–90°C), pH tối ưu (3–10) và độ bền pH (3–11). Hoạt độ CMCase đo bằng phương pháp so màu DNS, xác định đường khử tại bước sóng 540 nm; hàm lượng protein đo theo phương pháp Bradford.
• Giải trình tự và phân tích hệ gen Cellulosimicrobium cellulans MP1: Tách chiết DNA hệ gen bằng kít PureLink Genomic DNA. Giải trình tự đa hệ gen trên hệ thống Illumina HiSeq2000. Lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải chức năng gen bằng các công cụ tin sinh học, phân loại theo COG và CAZy trên máy chủ 24 CPU Intel Xeon X5650, RAM 188 GB, Ubuntu 15.04.
• Thủy phân rơm rạ: Rơm cắt nhỏ, rửa sạch, sấy khô, nghiền mịn. Tiền xử lý bằng dung dịch NaOH 10% theo tỷ lệ rắn:lỏng 1:20 (w/v) ở 90°C trong 1 giờ, lọc rửa đến pH trung tính. Phản ứng thủy phân bằng enzyme khảo sát theo các biến số: thời gian (12–72 giờ), nhiệt độ (40–60°C), nồng độ cơ chất (1:100 đến 3:100 g/ml), liều lượng enzyme và pH (4,0–7,0). Thành phần đường khử phân tích định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, Agilent).

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu nêu rõ tầm quan trọng của nguồn sinh khối lignocellulose phế thải tại Việt Nam, sự suy thoái môi trường do đốt rơm rạ tự phát, vai trò sinh học của hệ vi sinh vật ruột mối trong phân giải chất xơ, xác lập 2 mục tiêu, 6 nội dung nghiên cứu, đối tượng và phạm vi thực hiện của luận án.

Chương 1: Tổng quan

Chương này tổng thuật 4 nội dung lớn:

• Khái niệm và phân loại cellulase: Cơ chế xúc tác của endoglucanase, exoglucanase (CBH I, CBH II) và β-glucosidase; các họ glycoside hydrolase và các mô-đun gắn carbohydrate (CBM).
• Sinh tổng hợp và đặc tính enzyme từ vi khuẩn: Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy lắc, nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ và cơ chất cảm ứng; tác động của ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+) và chất hoạt động bề mặt (SDS, Triton X-100, Tween 20). Tổng hợp các đặc tính bền nhiệt và bền pH của enzyme từ C. cellulans theo công bố của Song và Wei (2010):

Yếu tố khảo sát	Điều kiện	Hoạt độ tương đối còn lại sau 1 giờ (%)	Hoạt độ tương đối còn lại sau 6 giờ (%)
Nhiệt độ	30°C	94,91	80,92
Nhiệt độ	40°C	64,87	55,68
Nhiệt độ	50°C	25,13	10,13
Độ pH	pH 3,4	22,22	18,18
Độ pH	pH 5,0	50,65	34,39
Độ pH	pH 7,0	40,46	26,26

• Hệ vi sinh vật ruột mối: Phân loại mối bậc thấp và mối bậc cao, cấu trúc quần xã vi sinh vật phân giải chất xơ; vai trò của vi khuẩn thuộc các họ Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillaceae, Promicromonosporaceae; tổng kết các chủng vi khuẩn sinh cellulase đã công bố trên thế giới.
• Ứng dụng cellulase và giải trình tự hệ gen: Cấu tạo ba thành phần của lignocellulose (cellulose, hemicellulose, lignin); ứng dụng enzyme trong xử lý sinh khối sản xuất ethanol sinh học; điểm lại các công trình giải mã hệ gen vi khuẩn sinh cellulase (Paenibacillus polymyxa A18, Cellulosimicrobium sp. TH-20, Parvularcula flava NH6-79T, Bacillus velezensis LC1).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Trình bày chi tiết nguồn gốc 8 mẫu mối thu thập, hóa chất, thiết bị, quy trình pha chế các môi trường nuôi cấy (M1–M6, D5, D6, LB). Mô tả chi tiết kỹ thuật phân lập, sàng lọc bằng chỉ số $D/d$ qua nhuộm Congo đỏ; các phương pháp sinh hóa và quan sát kính hiển vi điện tử quét SEM; quy trình PCR khuếch đại 16S rDNA.

Mô tả thiết kế ma trận tối ưu hóa bề mặt đáp ứng Box-Behnken trên phần mềm Design-Expert 7.1 cho chủng Bacillus subtilis G4 với 3 biến số: nồng độ tinh bột ($X_1$), nồng độ casein ($X_2$) và nồng độ bột đậu tương ($X_3$) gồm 20 thí nghiệm:

Mẫu thí nghiệm	Nồng độ tinh bột (g/L)	Nồng độ casein (g/L)	Nồng độ bột đậu tương (g/L)
1	5	20	20
2, 3, 4, 8, 16, 17, 19	15	12,5	12,5
5	5	5	5
6	25	20	5
7	15	1,25	12,5
9	0	12,5	12,5
10	5	5	20
11	25	20	20
12	25	5	5
13	5	20	5
14	25	5	20
15	30	12,5	12,5
18	15	12,5	23,75
20	15	23,75	12,5

Mô tả kỹ thuật kết tủa protein enzyme bằng (NH4)2SO4, acetone và ethanol; các bước đo hoạt tính CMCase, xác định độ bền nhiệt, bền pH; quy trình giải trình tự toàn bộ hệ gen chủng MP1 trên máy Illumina HiSeq2000; quy trình tiền xử lý rơm bằng NaOH 10% ở 90°C trong 1 giờ và các điều kiện thực nghiệm đường hóa xác định qua HPLC.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận được triển khai qua 6 phần trọng tâm:

1. Phân lập và tuyển chọn: Thống kê số lượng chủng phân lập từ các môi trường làm giàu; chọn lọc được 11 chủng vi khuẩn thể hiện tỷ lệ $D/d$ cao trên thạch CMC. Đo hoạt độ enzyme CMCase và xylanase của các chủng.
2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và định danh: Mô tả đặc tính Gram, catalase, khả năng di động và kết quả phân tích kít API của 11 chủng tuyển chọn. Kết quả giải trình tự 16S rDNA định danh chính xác các chủng vi khuẩn từ ruột mối, trong đó chọn ra hai chủng nổi bật là Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1.
3. Nghiên cứu enzyme từ Bacillus subtilis G4: Đánh giá môi trường nuôi cấy phù hợp; khảo sát ảnh hưởng của thông số nuôi cấy (tỷ lệ giống, tốc độ lắc, nhiệt độ, pH ban đầu) và các nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ. Kết quả phân tích hồi quy ANOVA mô hình bề mặt đáp ứng Design-Expert 7.1 xác định nồng độ tối ưu của tinh bột, casein và bột đậu tương. Thu nhận enzyme kỹ thuật bằng kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate và acetone. Xác định nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, pH tối ưu, độ bền pH của CMCase G4 và phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC.
4. Nghiên cứu enzyme từ Cellulosimicrobium cellulans MP1: Xác định môi trường và thông số kỹ thuật thích hợp (thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ, lắc). Khảo sát tác động của nguồn nitơ, nguồn cacbon và nồng độ bột đậu tương đến hoạt tính CMCase. Thu nhận chế phẩm enzyme bằng kết tủa ethanol tuyệt đối; xác định đặc tính nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, pH tối ưu và độ bền pH của enzyme MP1. So sánh hoạt tính phân giải giấy lọc và cơ chất giữa enzyme từ B. subtilis G4 và C. cellulans MP1.
5. Đặc tính di truyền và hệ gen Cellulosimicrobium cellulans MP1: Trình bày dữ liệu giải trình tự de novo hệ gen bằng máy Illumina HiSeq2000. Phân loại các cụm gen chức năng theo cơ sở dữ liệu COG. Lập danh mục các gen mã hóa enzyme thủy phân carbohydrate (CAZymes), dự đoán biểu hiện của các cellulase và hemicellulase thuộc các họ glycoside hydrolase, làm sáng tỏ tiềm năng phân giải sinh khối thực vật từ hệ gen của chủng MP1.
6. Thủy phân cellulose của rơm rạ: Xác định thành phần hóa học (cellulose, hemicellulose, lignin) của rơm trước và sau khi tiền xử lý bằng kiềm (NaOH 10%, 90°C, 1 giờ). Đánh giá hiệu suất đường hóa theo thời gian phản ứng, nhiệt độ, tỷ lệ chất rắn/lỏng, liều lượng enzyme và giá trị pH. Phân tích thành phần đường đơn tạo thành bằng sắc ký lỏng HPLC.

Kết quả và những đóng góp mới

Theo công bố trong luận án, tác giả nêu các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn như sau:

Về mặt khoa học:

• Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam thực hiện phân lập, sàng lọc và nghiên cứu thu nhận enzyme cellulase từ các chủng vi khuẩn sống trong ruột mối bản địa.
• Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (Illumina HiSeq2000) đối với chủng vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối tại Việt Nam, phân tích chi tiết hệ thống gen mã hóa enzyme phân giải lignocellulose (cellulase và hemicellulase), cung cấp dữ liệu di truyền chứng minh tiềm năng phân giải sinh khối thực vật của loài này.
• Cung cấp các số liệu thực nghiệm có hệ thống về điều kiện sinh tổng hợp, đặc tính hóa lý (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, độ bền nhiệt và độ bền pH) của chế phẩm cellulase thu từ hai chủng đại diện Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1.

Về mặt thực tiễn:

• Thiết lập quy trình tối ưu hóa môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp CMCase cho chủng Bacillus subtilis G4 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm RSM (Design-Expert 7.1) sử dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có như tinh bột, casein và bột đậu tương.
• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng dịch enzyme cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn ruột mối để thủy phân rơm rạ đã qua tiền xử lý bằng kiềm, tạo ra dung dịch đường khử phục vụ các quá trình lên men sinh học tiếp theo.
• Kết quả nghiên cứu cung cấp nguồn cơ sở dữ liệu vi sinh vật và di truyền tin cậy phục vụ công tác giảng dạy, nghiên cứu chuyên sâu về enzyme học và công nghệ sinh học xử lý phế phẩm nông nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Nghiên cứu chỉ tập trung phân lập và khảo sát các chủng vi khuẩn hiếu khí và vi hiếu khí có khả năng nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo trong phòng thí nghiệm; các nhóm vi sinh vật yếm khí nghiêm ngặt trong ruột mối chưa được phân lập do giới hạn về điều kiện mô phỏng môi trường ruột mối in vivo.
• Dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen mới chỉ thực hiện trên một chủng vi khuẩn đại diện (Cellulosimicrobium cellulans MP1), chưa bao quát toàn bộ các chủng phân lập được.
• Quá trình thủy phân lignocellulose thực tế mới tiến hành khảo sát trên cơ chất rơm rạ sau tiền xử lý hóa học ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác thể tích 100 ml), chưa thử nghiệm đa dạng các loại phế phẩm nông nghiệp khác (bã mía, vỏ trấu, lõi ngô) và chưa triển khai quy mô bán công nghiệp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Hoàn thiện điều kiện nuôi cấy kỵ khí để phân lập và khai thác thêm các nhóm vi khuẩn phân giải cellulose chuyên biệt khác từ ruột mối.
• Khai thác sâu các gen mã hóa glycoside hydrolase tiềm năng từ hệ gen của Cellulosimicrobium cellulans MP1 thông qua kỹ thuật dòng hóa và biểu hiện gen dị bào trên các vật chủ biểu hiện công nghiệp.
• Mở rộng khảo sát phối hợp enzyme cellulase từ các chủng vi khuẩn này với các phức hệ enzyme khác nhằm nâng cao hiệu suất đường hóa trên nhiều nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp khác nhau.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cho:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Hóa sinh học: Tham khảo phương pháp phân lập vi khuẩn đường ruột côn trùng, quy trình sàng lọc enzyme bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ và xác định chỉ số $D/d$.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu công nghệ enzyme: Tham khảo cách thiết kế quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa môi trường lên men bằng mô hình đáp ứng bề mặt (RSM) trên phần mềm Design-Expert 7.1; phương pháp thu nhận và đánh giá động học enzyme (độ bền nhiệt, độ bền pH).
• Cán bộ nghiên cứu tin sinh học và hệ gen học vi sinh vật: Tham khảo quy trình giải trình tự genome thế hệ mới (Illumina HiSeq2000), lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải các họ enzyme CAZymes/GHs liên quan đến chuyển hóa carbohydrate.
• Các nhà kỹ thuật và đơn vị phát triển công nghệ xử lý sinh khối: Tham khảo thông số thực nghiệm tiền xử lý rơm lúa bằng kiềm (NaOH 10%, 90°C) kết hợp thủy phân bằng enzyme thô để thu hồi đường khử.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu mối trong nghiên cứu được thu thập tại những khu vực nào và trên những giá thể gì?

Mẫu mối được thu thập trong giai đoạn từ tháng 9/2014 đến tháng 9/2016 tại hai địa phương: tỉnh Nghệ An (thân gỗ mục tại Núi Quyết - TP. Vinh; thân gỗ mục và thân mía mục tại xã Thanh Mỹ - huyện Thanh Chương; cây xoài tại Trường Đại học Vinh) và Hà Nội (khuôn viên Trường Đại học Bách khoa Hà Nội trên cây bằng lăng, cây phượng, cây sấu và tổ mối đất).

2. Hai chủng vi khuẩn nào được tác giả lựa chọn để nghiên cứu chuyên sâu về cellulase?

Hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn qua vòng thủy phân CMC cao và xác định danh tính qua giải trình tự gen 16S rDNA là Bacillus subtilis G4 và Cellulosimicrobium cellulans MP1.

3. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm nào được dùng để tối ưu hóa quá trình sinh enzyme của chủng Bacillus subtilis G4?

Tác giả sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) với thiết kế thực nghiệm gồm 20 mẫu thí nghiệm trên phần mềm Design-Expert 7.1; ba yếu tố khảo sát chính là nồng độ tinh bột ($X_1$), nồng độ casein ($X_2$) và nồng độ bột đậu tương ($X_3$); số liệu được kiểm định thống kê qua phân tích phương sai ANOVA.

4. Hệ gen của chủng vi khuẩn nào được giải trình tự toàn bộ và sử dụng nền tảng giải trình tự gì?

Toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối trên thân mía mục đã được giải trình tự de novo bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới trên máy Illumina HiSeq2000, sau đó phân tích các cụm gen chức năng COG và danh mục enzyme CAZy.

5. Quá trình tiền xử lý rơm rạ trước khi thủy phân bằng enzyme được thực hiện như thế nào?

Rơm nguyên liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô, nghiền trong 10 phút, sau đó xử lý bằng dung dịch NaOH 10% theo tỷ lệ rắn:lỏng 1:20 (w/v), gia nhiệt ở 90°C trong thời gian 1 giờ; sau đó được lọc, rửa bằng nước cho đến khi đạt pH trung tính và sấy khô làm cơ chất cho phản ứng enzyme.

Kết luận

Luận án của Đào Thị Thanh Xuân đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn sinh cellulase từ nguồn ruột mối thu thập tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam. Công trình ghi nhận dấu mốc học thuật khi lần đầu tiên tại Việt Nam giải mã toàn bộ hệ gen của chủng Cellulosimicrobium cellulans MP1 bằng công nghệ giải trình tự Illumina HiSeq2000, xác lập hệ thống các gen mã hóa enzyme phân giải carbohydrate phức tạp. Đồng thời, nghiên cứu đã chuẩn hóa điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Bacillus subtilis G4 qua phần mềm Design-Expert 7.1 và chứng minh khả năng đường hóa rơm rạ bằng enzyme cellulase thu nhận, mở ra triển vọng ứng dụng vi khuẩn ruột mối trong công nghệ chuyển hóa sinh khối nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế vật liệu cellulose và hemicellulose còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người.

Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn. Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường, các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose. Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả lignocellulose. Mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác.

Hệ vi sinh vật trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong quá trình phân giải cellulose. Có rất nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều loài mối khác nhau. Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu.

Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam” Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình và phân tích hệ gen vi khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối. 1 Mục tiêu của đề tài - Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam - Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam 2.

Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối (2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối (3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn (4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính CMCase của chế phẩm (5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam. (2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối (3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng. (4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm Ý nghĩa thực tiễn (1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối (2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này.

2 Đóng góp mới của đề tài - Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phân lập và thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối. - Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thông qua đó dự đoán tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose 3 Chƣơng 1. Phân loại cellulase Cellulase là một phức hệ enzym thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4 glucoside hay phá vỡ liên kết hydro trong phân tử cellulose. Cellulase có thể được chia thành 3 enzym chính dựa trên cơ chế hoạt động, trình tự axit amin và cấu trúc của chúng Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.4) Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.4) còn có tên gọi khác nhau là Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-glucanase, β-1,4-Endoglucan hydrolase, cellulase A, cellulosin AP, celludextrinase, carboxymethylcellulase…cơ chế hoạt động của enzym này là tấn công cellulose một cách ngẫu nhiên tại các vị trí bên trong phân tử cellulose và phân cắt chuỗi polysaccharid bằng việc chèn các phân tử nước vào giữa các liên kết β-1,4 glucosid.

Kết quả tạo ra các chuỗi glucan có độ dài khác nhau. Enzym này có thể thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của các cơ chất cellulose, lignin và các β-D-glucan của ngũ cốc [1].91) enzym này còn có tên gọi khác như Exo-β-1,4- glucanase, cellobiohydrolase, Exo-cellobiohydrolase, Exo- β-1,4-glucan cellobiohydrolase, cellobiose, C1 cellulase… bắt đầu bằng việc tấn công vào đầu khử hoặc không khử của chuỗi polysacharid và giải phóng các β-cellobiose. Exoglucanse có thể hoạt động lên các cellulose dạng tinh thể, lên lớp vỏ bên ngoài chuỗi cellulose của cấu trúc tinh thể. Đặc điểm hình học có ý nghĩa nhất của phần xúc tác của CBHs là cấu trúc hình ống được tạo ra hai lớp bề mặt.

Cấu trúc hình ống này có thể toàn bộ hoặc một phần của trung tâm hoạt động. Dạng hình ống của trung tâm hoạt động có thể là hình dáng duy nhất của exoglucanase. CBHs là exoglucanse thường gặp nhất. Các CBHs khác nhau được sinh tổng hợp bởi các vi khuẩn hoặc nấm mốc với các trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 5,6,7,9,48 và 74.

CBHs nấm mốc thuộc họ 6, 7 và 48, CBHs vi khuẩn hiếu khí thuộc họ 6 và 48, CBHs của vi khuẩn kỵ khí thuộc họ 9 và họ 48 [1].21) có tên gọi khác như β-1,4-glucosidase hoạt động đặc biệt lên các cellobiose disaccharid tạo ra sản phẩm cuối glucose. Enzym này thủy phân gốc β-D-glucosid không khử ở đầu tận cùng để giái phóng glucose. β-D- glucosidase (BGs) là enzym thủy phân các cellodextrin hòa tan và các cellobiose. Hoạt tính của BGs lên các cellulose không hòa tan là không đáng kể, chúng chủ yếu 4 thủy phân cellobiose.

Các BG khác nhau được thu nhận từ các vi khuẩn, nấm mốc, động vật và thực vật khác nhau với trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 1,3 hoặc 9. Dựa trên các dữ liệu phân tích cấu trúc tương đồng, cấu trúc lập thể hóa học của họ 1 và 3 BGs thuộc loại duy trì, trong khi họ 9 thuộc loại đảo ngược. BGs có trung tâm hoạt động dạng túi, nơi chúng được liên kết với các đầu gluocse không khử và ghim các glucose từ cellobiose và cellodextrin [1].1 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [2] Trong hầu hết các cách phân loại cơ bản thì thì cellulase thuộc nhóm enzym đơn chức năng được xác định đó là các cellobiohydrolase (CBHs, exo-β-(1,4)-d glucanases), endoglucanase (EGs, endo β-(1,4)-glucanase) và β-d-glucosidase. CBHs là enzym thủy phân cellulose từ đầu chuỗi, trong khi EGs là loại enzym thủy phân cellulose một cách ngẫu nhiên từ bên trong chuỗi.

Cellobiase thủy phân các cellobiose, sản phẩm cuối cùng của CBHs là glucose do vậy mà ngăn cản được sản phẩm cuối kìm hãm enzym [3]. EGs có khả năng tạo ra các cellulose chuỗi ngắn hơn để thuận tiện cho quá trình thủy phân bởi enzym. Sự kết hợp hoạt tính của EG và CBHs giải phóng một lượng lớn các cellodextrin hòa tan và các cellobiose. β-d-glucosidase thủy phân các dimer glucose thành glucose .2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4] 1.

Nguồn thu nhận cellulase Cellulase được sinh tổng hợp trong tự nhiên bởi một số loài vi sinh vật và cả một số động vật và côn trùng. Các vi sinh vật sinh cellulase có mặt ở nhiều nơi, những vi sinh vật này đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các polysacharid phức tạp thành các đường đơn giản mà chúng có thể đồng hóa được. Các vi sinh vật có khả năng sinh cellulase trong tự nhiên bao gồm cả xạ khuẩn, nấm mốc và vi khuẩn. Các vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose có cả vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, cả chủng ưa ấm và chịu nhiệt.

Môi trường mà chúng có mặt rất đa dạng bao gồm cả những nơi có nhiệt độ, áp suất cao tới những nơi có pH khắc nghiệt [5]. Vi khuẩn sinh cellulase đã từng được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như dạ cỏ ở các động vật nhai lại (Hungater, 1957), đất (Black et al., 1985) phân (Madden, 1982), chất thải đô thị (Stutzenberger et al., 1970), nước cống (Muray et al., 1984), suối nước nóng (Sissons et al., 1987) [6] Côn trùng là động vật được quan tâm nhiều nhất về nhóm vi sinh vật cộng sinh trong đường ruột và sự đa dạng sinh học của chúng. Có khoảng hơn 20% côn trùng có liên quan tới vi sinh vật cộng sinh. Vai trò của các vi sinh vật cộng sinh này là khả năng sinh cellulase giúp cho các côn trùng có thể chuyển hóa các nguồn thức ăn có nguồn gốc là lignocellulose (Morrison et al,2009) [7].

Từ những năm 1992 Hethener và cộng sự đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột của mối ăn gỗ Nasutitermes lujae. Kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn yếm khí Clostridium termitidis sp đồng thời nghiên cứu quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng. Đến nay đã có rất nhiều vi khuẩn từ ruột mối được chứng minh có khả năng sinh cellulase như chủng MX5T được phân lập từ ruột mối Mastotermes ở Autrialia được xác định là có khả năng sinh cellulase và xylanase, với kỹ thuật định tên bằng 16S rDNA chủng MX5T được xác định là Cellulosimicrobium variable [8].