MỞ ĐẦU Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế vật liệu cellulose và hemicellulose còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người.
Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn. Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường, các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose. Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả lignocellulose. Mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác.
Hệ vi sinh vật trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong quá trình phân giải cellulose. Có rất nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều loài mối khác nhau. Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu.
Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam” Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình và phân tích hệ gen vi khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối. 1 Mục tiêu của đề tài - Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam - Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam 2.
Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối (2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối (3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn (4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính CMCase của chế phẩm (5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam. (2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối (3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng. (4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm Ý nghĩa thực tiễn (1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối (2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này.
2 Đóng góp mới của đề tài - Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phân lập và thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối. - Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thông qua đó dự đoán tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose 3 Chƣơng 1. Phân loại cellulase Cellulase là một phức hệ enzym thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4 glucoside hay phá vỡ liên kết hydro trong phân tử cellulose. Cellulase có thể được chia thành 3 enzym chính dựa trên cơ chế hoạt động, trình tự axit amin và cấu trúc của chúng Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.4) Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.4) còn có tên gọi khác nhau là Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-glucanase, β-1,4-Endoglucan hydrolase, cellulase A, cellulosin AP, celludextrinase, carboxymethylcellulase…cơ chế hoạt động của enzym này là tấn công cellulose một cách ngẫu nhiên tại các vị trí bên trong phân tử cellulose và phân cắt chuỗi polysaccharid bằng việc chèn các phân tử nước vào giữa các liên kết β-1,4 glucosid.
Kết quả tạo ra các chuỗi glucan có độ dài khác nhau. Enzym này có thể thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của các cơ chất cellulose, lignin và các β-D-glucan của ngũ cốc [1].91) enzym này còn có tên gọi khác như Exo-β-1,4- glucanase, cellobiohydrolase, Exo-cellobiohydrolase, Exo- β-1,4-glucan cellobiohydrolase, cellobiose, C1 cellulase… bắt đầu bằng việc tấn công vào đầu khử hoặc không khử của chuỗi polysacharid và giải phóng các β-cellobiose. Exoglucanse có thể hoạt động lên các cellulose dạng tinh thể, lên lớp vỏ bên ngoài chuỗi cellulose của cấu trúc tinh thể. Đặc điểm hình học có ý nghĩa nhất của phần xúc tác của CBHs là cấu trúc hình ống được tạo ra hai lớp bề mặt.
Cấu trúc hình ống này có thể toàn bộ hoặc một phần của trung tâm hoạt động. Dạng hình ống của trung tâm hoạt động có thể là hình dáng duy nhất của exoglucanase. CBHs là exoglucanse thường gặp nhất. Các CBHs khác nhau được sinh tổng hợp bởi các vi khuẩn hoặc nấm mốc với các trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 5,6,7,9,48 và 74.
CBHs nấm mốc thuộc họ 6, 7 và 48, CBHs vi khuẩn hiếu khí thuộc họ 6 và 48, CBHs của vi khuẩn kỵ khí thuộc họ 9 và họ 48 [1].21) có tên gọi khác như β-1,4-glucosidase hoạt động đặc biệt lên các cellobiose disaccharid tạo ra sản phẩm cuối glucose. Enzym này thủy phân gốc β-D-glucosid không khử ở đầu tận cùng để giái phóng glucose. β-D- glucosidase (BGs) là enzym thủy phân các cellodextrin hòa tan và các cellobiose. Hoạt tính của BGs lên các cellulose không hòa tan là không đáng kể, chúng chủ yếu 4 thủy phân cellobiose.
Các BG khác nhau được thu nhận từ các vi khuẩn, nấm mốc, động vật và thực vật khác nhau với trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 1,3 hoặc 9. Dựa trên các dữ liệu phân tích cấu trúc tương đồng, cấu trúc lập thể hóa học của họ 1 và 3 BGs thuộc loại duy trì, trong khi họ 9 thuộc loại đảo ngược. BGs có trung tâm hoạt động dạng túi, nơi chúng được liên kết với các đầu gluocse không khử và ghim các glucose từ cellobiose và cellodextrin [1].1 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [2] Trong hầu hết các cách phân loại cơ bản thì thì cellulase thuộc nhóm enzym đơn chức năng được xác định đó là các cellobiohydrolase (CBHs, exo-β-(1,4)-d glucanases), endoglucanase (EGs, endo β-(1,4)-glucanase) và β-d-glucosidase. CBHs là enzym thủy phân cellulose từ đầu chuỗi, trong khi EGs là loại enzym thủy phân cellulose một cách ngẫu nhiên từ bên trong chuỗi.
Cellobiase thủy phân các cellobiose, sản phẩm cuối cùng của CBHs là glucose do vậy mà ngăn cản được sản phẩm cuối kìm hãm enzym [3]. EGs có khả năng tạo ra các cellulose chuỗi ngắn hơn để thuận tiện cho quá trình thủy phân bởi enzym. Sự kết hợp hoạt tính của EG và CBHs giải phóng một lượng lớn các cellodextrin hòa tan và các cellobiose. β-d-glucosidase thủy phân các dimer glucose thành glucose .2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4] 1.
Nguồn thu nhận cellulase Cellulase được sinh tổng hợp trong tự nhiên bởi một số loài vi sinh vật và cả một số động vật và côn trùng. Các vi sinh vật sinh cellulase có mặt ở nhiều nơi, những vi sinh vật này đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các polysacharid phức tạp thành các đường đơn giản mà chúng có thể đồng hóa được. Các vi sinh vật có khả năng sinh cellulase trong tự nhiên bao gồm cả xạ khuẩn, nấm mốc và vi khuẩn. Các vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose có cả vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, cả chủng ưa ấm và chịu nhiệt.
Môi trường mà chúng có mặt rất đa dạng bao gồm cả những nơi có nhiệt độ, áp suất cao tới những nơi có pH khắc nghiệt [5]. Vi khuẩn sinh cellulase đã từng được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như dạ cỏ ở các động vật nhai lại (Hungater, 1957), đất (Black et al., 1985) phân (Madden, 1982), chất thải đô thị (Stutzenberger et al., 1970), nước cống (Muray et al., 1984), suối nước nóng (Sissons et al., 1987) [6] Côn trùng là động vật được quan tâm nhiều nhất về nhóm vi sinh vật cộng sinh trong đường ruột và sự đa dạng sinh học của chúng. Có khoảng hơn 20% côn trùng có liên quan tới vi sinh vật cộng sinh. Vai trò của các vi sinh vật cộng sinh này là khả năng sinh cellulase giúp cho các côn trùng có thể chuyển hóa các nguồn thức ăn có nguồn gốc là lignocellulose (Morrison et al,2009) [7].
Từ những năm 1992 Hethener và cộng sự đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột của mối ăn gỗ Nasutitermes lujae. Kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn yếm khí Clostridium termitidis sp đồng thời nghiên cứu quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng. Đến nay đã có rất nhiều vi khuẩn từ ruột mối được chứng minh có khả năng sinh cellulase như chủng MX5T được phân lập từ ruột mối Mastotermes ở Autrialia được xác định là có khả năng sinh cellulase và xylanase, với kỹ thuật định tên bằng 16S rDNA chủng MX5T được xác định là Cellulosimicrobium variable [8].
