Luận Văn Thạc Sĩ: Tách Dòng Và Giải Trình Tự Gene Mã Hóa Enzyme Nattokinase Từ B. Subtilis

• Tác giả: Phạm Thế Anh
• Người hướng dẫn: TS. Dƣơng Văn Cƣờng
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trƣờng Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme Nattokinase từ B. subtilis
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHOÁ LUẬN
• DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHOÁ LUẬN
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Nguồn gốc thực vật của Nattokinase
• 2.2. Đặc điểm, cấu trúc của Nattokinase
• 2.2.1. Đặc điểm
• 2.2.2. Cấu trúc phân tử Nattokinase
• 2.3. Hoạt tính của Nattokinase
• 2.4. So sánh các tác nhân tiêu sợi
• 2.4.1. Urokinase
• 2.4.2. Streptokinase
• 2.4.3. Bromelain
• 2.4.4. Tỏi
• 2.4.5. Nhân sâm
• 2.5. Tác dụng của Nattokinase
• 2.5.1. Khả năng làm tan cục máu đông
• 2.5.2. Đề phòng, hỗ trợ các bệnh liên quan đến tim mạch
• 2.5.3. Giảm huyết áp, giúp lưu thông máu
• 2.5.4. Các lợi ích khác
• 2.6. Các phương pháp sản xuất Nattokinase
• 2.6.1. Phương pháp lên men dịch thể
• 2.6.2. Phương pháp sản xuất từ vi sinh vật
• 2.6.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase trong và ngoài nước
• 2.6.3.1. Trên thế giới
• 2.6.3.2. Tình hình trong nước
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị sử dụng
• 3.3. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Quy trình tách dòng, xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B.
• 3.5.2. Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc
• 3.5.3. Phương pháp thu cặn tế bào vi khuẩn
• 3.5.4. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 3.5.5. Phương pháp PCR. Điện di sản phẩm trên gel agarose
• 3.5.6. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel
• 3.5.7. Phương pháp gắn nối gene đã khuếch đại vào vetor tách dòng pTUAF
• 3.5.8. Phương pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.
• 3.5.9. Phương pháp tách chiết DNA plasmid bằng bộ Kit thương mại
• 3.5.10. Phương pháp cắt kiểm tra các dòng plasmid với enzyme cắt giới hạn
• 3.5.11. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của Sanger và các cộng sự
• 3.5.12. Phương pháp so sánh trình tự gene aprE đã tách dòng với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene thế giới – Ngân hàng Gen bank
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn B.
• 4.2. Kết quả nhân gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis bằng phương pháp PCR
• 4.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận lại DNA từ gel agarose
• 4.4. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối
• 4.5. Kết quả chọn lọc dòng
• 4.6. Kết quả sàng lọc dòng bằng điện di so sánh kích thước plasmid
• 4.7. Kết quả chọn lọc dòng bằng PCR
• 4.8. Kết quả chọn lọc dòng plasmid bằng lập bản đồ giới hạn
• 4.9. Kết quả giải trình tự gene
• 4.10. Kết quả phân tích các thành phần của gene aprE sau khi giải trình tự
• 4.11. Kết quả dịch mã của gene aprE
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• appendix.1. Tài liệu trong nước
• appendix.2. Tài liệu nước ngoài

I. Mở đầu

Đề tài 'Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme nattokinase từ B. subtilis' được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu và phát triển công nghệ sản xuất enzyme nattokinase, một enzyme có khả năng phân hủy huyết khối hiệu quả. Nattokinase, được mã hóa bởi gene aprE, có nguồn gốc từ vi khuẩn B. subtilis, đã được chứng minh là có tác dụng tích cực trong việc điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch. Việc tách dòng và giải trình tự gene này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme mà còn mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất nattokinase tái tổ hợp trong công nghiệp dược phẩm. Theo thống kê của WHO, hàng triệu người tử vong hàng năm do bệnh tim mạch, điều này càng làm nổi bật tầm quan trọng của nghiên cứu này.

1.1. Mục tiêu đề tài

Mục tiêu chính của đề tài là phân lập gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis và xác định trình tự gene này để so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene. Việc này không chỉ giúp khẳng định tính chính xác của gene đã phân lập mà còn tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về sản xuất nattokinase. Nghiên cứu này cũng nhằm phát triển quy trình công nghệ sản xuất nattokinase với hoạt tính cao và ổn định, phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh lý tim mạch.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học quan trọng, cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về enzyme nattokinase. Về mặt thực tiễn, sản phẩm nghiên cứu mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất nattokinase trên quy mô công nghiệp, giúp rút ngắn thời gian sản xuất và giảm chi phí. Điều này không chỉ có lợi cho ngành dược phẩm mà còn góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là trong việc phòng ngừa và điều trị các bệnh lý liên quan đến huyết áp và tim mạch.

II. Tổng quan tài liệu

Nattokinase là một enzyme có nguồn gốc từ đậu tương lên men, được phát hiện lần đầu tiên tại Nhật Bản. Enzyme này có khả năng phân hủy fibrin, một thành phần chính trong cục máu đông, giúp cải thiện lưu thông máu và giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch. Nattokinase được mã hóa bởi gene aprE trong vi khuẩn B. subtilis, một vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này thông qua quá trình lên men. Nghiên cứu về nattokinase đã chỉ ra rằng enzyme này có hoạt tính cao hơn nhiều so với các enzyme tiêu sợi khác như plasmin. Việc sản xuất nattokinase từ B. subtilis không chỉ mang lại lợi ích về mặt sức khỏe mà còn mở ra cơ hội cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và dược phẩm.

2.1. Nguồn gốc thực vật của Nattokinase

Nattokinase có nguồn gốc từ một loại thực phẩm truyền thống của Nhật Bản gọi là natto, được làm từ đậu tương lên men. Quá trình lên men này diễn ra nhờ sự tác động của vi khuẩn B. subtilis, giúp tạo ra enzyme nattokinase với hoạt tính cao. Nghiên cứu cho thấy rằng natto không chỉ là nguồn cung cấp nattokinase mà còn có nhiều lợi ích sức khỏe khác, như giảm huyết áp và cải thiện chức năng tim mạch. Việc hiểu rõ nguồn gốc và quá trình sản xuất nattokinase từ natto sẽ giúp phát triển các phương pháp sản xuất enzyme này một cách hiệu quả hơn.

2.2. Đặc điểm và cấu trúc của Nattokinase

Nattokinase có cấu trúc phân tử đặc biệt, với chiều dài chuỗi acid amin là 275 aa và trọng lượng phân tử khoảng 28 kDalton. Enzyme này có tính tương đồng cao với các enzyme subtilisin, cho phép nó tác động hiệu quả lên fibrin. Hoạt tính của nattokinase không chỉ giúp phân hủy fibrin mà còn kích thích cơ thể sản xuất plasmin, một enzyme nội sinh có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu sợi. Điều này làm cho nattokinase trở thành một lựa chọn tiềm năng trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến huyết khối.

III. Vật liệu nội dung phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại trong công nghệ sinh học để tách dòng và giải trình tự gene aprE từ B. subtilis. Các bước thực hiện bao gồm nuôi cấy vi khuẩn, tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại gene, và cuối cùng là giải trình tự nucleotide. Quy trình này được thiết kế để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc thu nhận gene mã hóa nattokinase. Việc áp dụng các phương pháp này không chỉ giúp xác định trình tự gene mà còn tạo điều kiện cho việc sản xuất nattokinase tái tổ hợp trong E. coli, mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu và ứng dụng enzyme này trong thực tiễn.

3.1. Phương pháp tách chiết DNA

Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn B. subtilis được thực hiện bằng cách sử dụng bộ kit thương mại, giúp thu nhận DNA với độ tinh khiết cao. Quá trình này bao gồm các bước như ly giải tế bào, loại bỏ protein và tách DNA khỏi các tạp chất. Kết quả thu được sẽ được sử dụng trong các bước tiếp theo của nghiên cứu, bao gồm phản ứng PCR và giải trình tự gene. Việc tách chiết DNA hiệu quả là yếu tố quyết định đến thành công của toàn bộ quy trình nghiên cứu.

3.2. Phương pháp PCR

Phản ứng PCR được thực hiện để khuếch đại gene aprE từ DNA tổng số đã tách chiết. Các cặp mồi được thiết kế đặc biệt để đảm bảo tính chính xác trong việc khuếch đại đoạn gene mong muốn. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm sẽ được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose để xác định kích thước và độ tinh khiết. Phương pháp này không chỉ giúp thu nhận lượng lớn gene aprE mà còn tạo điều kiện cho việc phân tích và so sánh trình tự gene với các dữ liệu đã công bố trên ngân hàng gene.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy gene aprE đã được tách dòng thành công từ vi khuẩn B. subtilis và xác định trình tự nucleotide của gene này. So sánh với các trình tự đã công bố cho thấy sự tương đồng cao, khẳng định tính chính xác của gene đã phân lập. Kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất nattokinase tái tổ hợp trong E. coli, với tiềm năng ứng dụng cao trong ngành dược phẩm. Việc sản xuất nattokinase từ E. coli không chỉ giúp giảm chi phí mà còn đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm. Nghiên cứu này cũng góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế hoạt động của nattokinase và vai trò của nó trong việc điều trị các bệnh lý tim mạch.

4.1. Kết quả tách chiết DNA

Kết quả tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn B. subtilis cho thấy lượng DNA thu được đạt yêu cầu về độ tinh khiết và nồng độ. Phân tích bằng điện di gel agarose cho thấy DNA có kích thước phù hợp với mong đợi, cho thấy quy trình tách chiết đã được thực hiện thành công. Kết quả này là cơ sở cho các bước tiếp theo trong nghiên cứu, bao gồm phản ứng PCR và giải trình tự gene.

4.2. Kết quả giải trình tự gene

Kết quả giải trình tự gene aprE cho thấy sự tương đồng cao với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene. Phân tích cho thấy gene này có cấu trúc ổn định và có khả năng mã hóa enzyme nattokinase với hoạt tính cao. Việc xác định trình tự gene không chỉ giúp khẳng định tính chính xác của gene đã phân lập mà còn mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất nattokinase tái tổ hợp, phục vụ cho nhu cầu điều trị các bệnh lý tim mạch.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu 'Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme nattokinase từ B. subtilis' đã đạt được các mục tiêu đề ra, bao gồm phân lập gene aprE và xác định trình tự gene này. Kết quả nghiên cứu không chỉ khẳng định tính chính xác của gene đã phân lập mà còn mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất nattokinase tái tổ hợp trong E. coli. Đề tài này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ sản xuất enzyme nattokinase, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh lý tim mạch. Kiến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo là tiếp tục tối ưu hóa quy trình sản xuất nattokinase và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của enzyme này trong cơ thể.

5.1. Kiến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất nattokinase từ E. coli, nhằm nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất. Ngoài ra, việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của nattokinase trong cơ thể cũng rất cần thiết, giúp hiểu rõ hơn về tác dụng của enzyme này trong việc điều trị các bệnh lý tim mạch. Các nghiên cứu này sẽ góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của nattokinase trong thực tiễn.

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 17 triệu người tử vong do các bệnh lý tim mạch trên toàn cầu. Tại Việt Nam, số người mắc bệnh tăng huyết áp ước tính khoảng 10 triệu, nguyên nhân chủ yếu là do sự tắc nghẽn mạch máu bởi các cục máu đông. Điều này đặt ra thách thức lớn cho ngành y tế và các lĩnh vực khoa học liên quan, trong đó có công nghệ sinh học. Enzyme Nattokinase, được mã hóa bởi gene aprE từ vi khuẩn Bacillus subtilis, có khả năng phân hủy huyết khối hiệu quả, gấp 4 lần enzyme plasmin nội sinh, đồng thời an toàn khi hấp thụ qua đường tiêu hóa.

Tuy nhiên, phương pháp thu nhận Nattokinase truyền thống từ quá trình lên men đậu nành có hàm lượng enzyme không cao và hoạt tính không ổn định. Do đó, nghiên cứu tách dòng và giải trình tự gene aprE nhằm phát triển hệ thống tái tổ hợp sản xuất Nattokinase trong vi khuẩn E. coli DH5α là hướng đi mới, mở ra triển vọng sản xuất enzyme với hoạt tính cao, ổn định và giá thành hợp lý. Mục tiêu cụ thể của luận văn là phân lập gene aprE từ B. subtilis, xác định trình tự gene và so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene quốc tế, nhằm cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất Nattokinase.

Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gene, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên trong khoảng thời gian từ tháng 12/2014 đến tháng 6/2015. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa khoa học trong việc làm rõ cấu trúc gene aprE và thực tiễn trong phát triển công nghệ sinh học sản xuất enzyme Nattokinase quy mô công nghiệp, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh tim mạch.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Lý thuyết về enzyme Nattokinase: Nattokinase là enzyme thủy phân protein có khả năng phân hủy fibrin, thành phần chính tạo nên cục máu đông. Enzyme này có cấu trúc tương đồng với subtilisin, trọng lượng phân tử khoảng 28 kDa, được mã hóa bởi gene aprE trong hệ gene của B. subtilis.

• Mô hình tái tổ hợp gene trong vi sinh vật: Sử dụng vector tách dòng pTUAF và vi khuẩn E. coli DH5α làm vật chủ để biểu hiện gene aprE, tận dụng hệ thống chọn lọc kháng sinh ampicilin và chỉ thị màu LacZ để phân biệt các dòng tái tổ hợp thành công.

• Khái niệm chính:

  • Gene aprE: gene mã hóa enzyme Nattokinase.
  • Vector tách dòng pTUAF: vector TA có đầu dính T, chứa gene kháng ampicilin và hệ thống chọn lọc LacZ.
  • Phản ứng PCR: kỹ thuật khuếch đại gene aprE từ DNA tổng số của B. subtilis.
  • Biến nạp: quá trình đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α.
  • Giải trình tự gene Sanger: phương pháp xác định trình tự nucleotide của gene aprE.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp từ Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên. DNA tổng số được tách chiết từ sinh khối vi khuẩn. Gene aprE được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên trình tự công bố.

• Phương pháp phân tích:

  • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB.
  • Khuếch đại gene aprE qua phản ứng PCR với chu trình nhiệt 35 chu kỳ.
  • Tinh sạch sản phẩm PCR bằng thu nhận DNA từ gel agarose.
  • Gắn nối gene aprE vào vector pTUAF bằng enzyme T4 DNA ligase.
  • Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.
  • Chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường LB-Agar chứa ampicilin, X-gal và IPTG.
  • Tách chiết plasmid từ các dòng khuẩn lạc trắng, kiểm tra bằng điện di gel agarose và cắt giới hạn với enzyme HindIII, EcoRI, BamHI, SacI.
  • Xác định trình tự nucleotide của gene aprE bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên máy Applied Biosystems.
  • So sánh trình tự gene aprE với trình tự công bố trên ngân hàng gene quốc tế bằng công cụ BLAST.

• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 6/2015, bao gồm các bước tách chiết DNA, PCR, gắn nối, biến nạp, chọn lọc, giải trình tự và phân tích dữ liệu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách chiết DNA tổng số thành công: 4 mẫu sinh khối B. subtilis được tách chiết DNA tổng số, sản phẩm có chất lượng cao, đủ để làm khuôn PCR (Hình ảnh điện di cho thấy băng DNA rõ nét).

2. Khuếch đại gene aprE bằng PCR: Đoạn gene aprE có kích thước khoảng 825 bp được khuếch đại thành công với 35 chu kỳ PCR, sản phẩm thuần nhất, không có tạp nhiễm (Hình điện di sản phẩm PCR).

3. Tinh sạch sản phẩm PCR: Sau khi thu nhận DNA từ gel agarose, sản phẩm PCR chỉ còn một băng duy nhất 825 bp, loại bỏ hoàn toàn primer dimer và tạp chất, đảm bảo cho phản ứng gắn nối hiệu quả.

4. Biến nạp và chọn lọc dòng tái tổ hợp: Sau biến nạp vào E. coli DH5α, xuất hiện các khuẩn lạc trắng và xanh trên môi trường chọn lọc. 6 dòng khuẩn lạc trắng được chọn nuôi cấy, tách chiết plasmid và kiểm tra kích thước plasmid bằng điện di cho thấy 3 dòng có plasmid lớn hơn plasmid gốc, nghi ngờ mang gene aprE.

5. Kiểm tra PCR và cắt giới hạn: Phản ứng PCR trên plasmid của các dòng nghi ngờ cho kết quả băng 825 bp đúng kích thước gene aprE. Cắt plasmid bằng enzyme BamHI và SacI, cũng như EcoRI và HindIII, cho kết quả băng đúng kích thước dự kiến (825 bp và khoảng 705 bp), xác nhận gene aprE đã được gắn thành công vào vector pTUAF.

6. Giải trình tự gene aprE: Trình tự nucleotide dài 825 bp được xác định, có độ tương đồng 99% với trình tự gene aprE công bố trên Gen bank (mã AB 734700), với 7 điểm sai khác nucleotide nhưng không ảnh hưởng đến mã bộ ba mở đầu, kết thúc và không xuất hiện codon kết thúc sớm.

7. Dịch mã và so sánh peptide: Chuỗi peptide dịch mã từ gene aprE có độ tương đồng 99% với trình tự peptide công bố, chỉ sai khác 2 amino acid do tính thoái hóa của mã bộ ba, đảm bảo khả năng biểu hiện enzyme Nattokinase chức năng.

Thảo luận kết quả

Kết quả tách dòng và giải trình tự gene aprE từ B. subtilis cho thấy quy trình PCR, gắn nối, biến nạp và chọn lọc plasmid tái tổ hợp được thực hiện thành công với độ chính xác cao. Việc sử dụng vector pTUAF với hệ thống chọn lọc kép (kháng ampicilin và chỉ thị màu LacZ) giúp phân biệt rõ ràng các dòng tái tổ hợp, giảm thiểu sai sót trong chọn lọc.

Sự sai khác 1% nucleotide so với trình tự công bố có thể do biến dị tự nhiên giữa các chủng B. subtilis khác nhau, không ảnh hưởng đến chức năng enzyme. Kết quả dịch mã không xuất hiện codon kết thúc sớm, đảm bảo gene aprE có thể biểu hiện enzyme Nattokinase đầy đủ chức năng.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, việc sử dụng E. coli DH5α làm vật chủ tái tổ hợp giúp tăng hiệu suất sản xuất enzyme, rút ngắn thời gian và chi phí so với phương pháp lên men truyền thống. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh kích thước plasmid, hình ảnh điện di gel agarose và bảng so sánh trình tự nucleotide, peptide để minh họa tính chính xác và hiệu quả của quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Thiết kế vector biểu hiện gene aprE: Tiếp tục nghiên cứu xây dựng vector biểu hiện hiệu quả để tạo chủng E. coli tái tổ hợp sản xuất Nattokinase với năng suất cao, đảm bảo tính ổn định và hoạt tính enzyme.

2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và biểu hiện protein: Thực hiện các thí nghiệm điều chỉnh môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH và các yếu tố sinh trưởng nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme trong phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp.

3. Phát triển quy trình tinh sạch enzyme Nattokinase: Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch enzyme tái tổ hợp để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao, hoạt tính ổn định, đáp ứng yêu cầu dược phẩm và thực phẩm chức năng.

4. Nghiên cứu tác động sinh học và ứng dụng lâm sàng: Phân tích chi tiết cơ chế tác động của Nattokinase đối với hệ tuần hoàn, đánh giá hiệu quả và an toàn khi sử dụng trong phòng ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, huyết áp.

5. Hợp tác với doanh nghiệp dược phẩm: Đẩy mạnh chuyển giao công nghệ, hợp tác nghiên cứu phát triển sản phẩm Nattokinase nội địa với giá thành cạnh tranh, đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước và xuất khẩu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Có thể ứng dụng quy trình tách dòng và giải trình tự gene aprE để phát triển các nghiên cứu tiếp theo về biểu hiện protein tái tổ hợp và cải tiến công nghệ sản xuất enzyme.

2. Doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng: Tham khảo để phát triển sản phẩm Nattokinase nội địa với chi phí hợp lý, nâng cao chất lượng và đa dạng hóa sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch.

3. Giảng viên và sinh viên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử: Sử dụng làm tài liệu tham khảo về kỹ thuật PCR, biến nạp, giải trình tự gene và ứng dụng trong nghiên cứu enzyme tái tổ hợp.

4. Chuyên gia y tế và nhà quản lý y tế: Hiểu rõ cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của Nattokinase trong phòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến huyết khối, từ đó đề xuất chính sách và hướng phát triển sản phẩm y sinh phù hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. Gene aprE có vai trò gì trong sản xuất Nattokinase?
   Gene aprE mã hóa enzyme Nattokinase, có khả năng phân hủy fibrin trong cục máu đông, giúp làm tan huyết khối hiệu quả. Việc tách dòng và giải trình tự gene aprE là bước đầu để sản xuất enzyme tái tổ hợp.

2. Tại sao chọn E. coli DH5α làm vật chủ tái tổ hợp?
   E. coli DH5α dễ nuôi cấy, có bộ gene đơn giản, khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp cao và an toàn, giúp tăng hiệu quả sản xuất enzyme so với phương pháp lên men truyền thống.

3. Phương pháp PCR được sử dụng như thế nào trong nghiên cứu?
   PCR được dùng để khuếch đại gene aprE từ DNA tổng số của B. subtilis với cặp mồi đặc hiệu, tạo ra sản phẩm DNA có kích thước 825 bp để gắn vào vector biểu hiện.

4. Làm thế nào để xác định gene aprE đã được gắn thành công vào vector?
   Sử dụng chọn lọc khuẩn lạc trắng trên môi trường chứa X-gal và IPTG, kiểm tra kích thước plasmid bằng điện di gel agarose, cắt giới hạn bằng enzyme và PCR kiểm tra gene aprE trên plasmid.

5. Sự sai khác 1% nucleotide trong trình tự gene aprE có ảnh hưởng gì không?
   Sự sai khác này có thể do biến dị tự nhiên giữa các chủng vi khuẩn, không ảnh hưởng đến chức năng enzyme vì không làm thay đổi mã bộ ba mở đầu, kết thúc và không tạo codon kết thúc sớm.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tách dòng gene aprE dài 825 bp từ vi khuẩn Bacillus subtilis bằng phương pháp PCR và gắn vào vector pTUAF.
• Đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α và chọn lọc được các dòng khuẩn lạc mang gene aprE.
• Trình tự gene aprE được xác định với độ tương đồng 99% so với trình tự công bố trên ngân hàng gene quốc tế, đảm bảo tính chính xác và khả năng biểu hiện enzyme.
• Kết quả nghiên cứu tạo nền tảng cho việc phát triển các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất Nattokinase với năng suất cao và ổn định.
• Đề xuất các bước tiếp theo bao gồm thiết kế vector biểu hiện, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, tinh sạch enzyme và nghiên cứu ứng dụng lâm sàng.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác phát triển công nghệ sản xuất Nattokinase nội địa, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và phát triển ngành công nghệ sinh học Việt Nam.