Đặt vấn đề Hiện nay, trên thế giới mỗi năm, có hàng triệu bệnh nhân tử vong do các bệnh liên quan đến tim mạch và huyết áp. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu ngƣời tử vong do bệnh lý tim mạch .Tại Việt Nam, theo PGS.TS Phạm Nguyễn Vinh (Phó chủ tịch Hội Tim mạch TP.HCM), hiện nƣớc ta có khoảng 10 triệu ngƣời mắc bệnh tăng huyết áp. Nguyên nhân chủ yếu đó là sự tắc nghẽn mạch máu mà tác nhân chính là việc hình thành các cục máu đông hay còn gọi là sự tăng sợi huyết. Điều này đặt ra thách thức lớn cho không chỉ ngành Y tế mà còn là một áp lực không nhỏ đối với những ngành khoa học khác, trong đó có công nghệ sinh học.
Nattokinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy huyết khối một cách hiệu quả trong các loại enzyme hoạt huyết, gấp 4 lần Plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông, đồng thời an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đƣờng ăn uống (Yanagisawa, Chatake et al. 2010) Từ trƣớc đến nay, Nattokinase đƣợc thu nhận chủ yếu bằng con đƣờng lên men bán rắn chủng B. subtilis trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể (Sumi, Hamada et al. Thực tế, Nattokinase đƣợc ly trích từ cơ chất hay môi trƣờng lỏng thƣờng có hàm lƣợng không cao và hoạt tính ít ổn định.
Vì thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong tự nhiên ở B. subtilis khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn. Hay nói cách khác, cách tiếp cận trên thƣờng chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã đƣợc nghiên cứu tối ƣu hóa.Tuy nhiên các quy trình công nghệ này ít đƣợc công bố (Nguyen Sle, Quyen et al. Ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Trung Quốc và Việt Nam, ngƣời dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng.
Do vậy, việc tìm hiểu, thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase từ các chủng B. subtilis, xây dựng, phát triển hệ thống tái tổ hợp là cách tiếp cận mới mở ra triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dƣợc phẩm, thực phẩm chức e 2 năng. Nattokinase đƣợc mã hóa bởi gen aprE có trong hệ genenome của chủng vi khuẩn B. subtilis (Nakamura, Yamagata et al.Trong đề tài này thay vì sử dụng B.
subtilis tôi sử dụng E. coli DH5α để tạo dòng tái tổ hợp sản xuất Nattokinase. Sản phẩm Nattokinase sản xuất từ chủng E. coli DH5α tái tổ hợp có giá trị, chất lƣợng và độ an toàn nhƣ Nattokinase lên men tự nhiên.
Trong nƣớc, các doanh nghiệp dƣợc phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản, giá thành khá cao. Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hƣớng của nhiều công ty. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tôi thực hiện đề tài: “Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme Nattokinase từ B. subtilis” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất Nattokinase tái tổ hợp, trƣớc tiên là tạo chủng E.
coli tái tổ hợp. Mục tiêu đề tài - Phân lập gene aprE từ vi khuẩn B. subtilis - Xác định trình tự gene aprE đã phân lập và so sánh với trình tự trên ngân hàng gene (Gene bank). Yêu cầu của đề tài - Nắm đƣợc các nguyên lý, kĩ thuật và các phƣơng pháp thực hiện trong quá trình phân tích - Thành thạo các thao tác và thực hiện đƣợc quy trình phân lập, tách dòng gene.
- Nắm đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu cấu trúc và trình tự gene. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu kế tiếp có liên quan đến việc sản xuất Nattokinase sau này. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hƣớng nghiên cứu ứng dụng sản xuất Nattokinase trên quy mô công nghiệp, rút ngắn thời gian sản xuất.
e 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Nguồn gốc thực vật của Nattokinase Trong nhiề u nghiên cƣ́u về ngồ n gố c của Natto đã chỉ ra rằ ng Natto bắ t đầ u trở thàn h mô ̣t phầ n văn hóa của Nhâ ̣t vào khoảng cuố i của thời kỳ EDO (1600– 1868). Trong thời kỳ này , đâ ̣u tƣơng đƣơ ̣c gói trong rơm và chôn dƣới đấ t khoảng mô ̣t tuầ n. Mô ̣t loa ̣i vi khuẩ n có sẵn trong rơm giúp cho quá trình lên men đâ ̣u tƣơ ng mô ̣t cách tƣ̣ nhiên và ta ̣o ra natto.
Phƣơng pháp hiê ̣n đa ̣i chỉ mới đƣợc phát hiện lầ n đầ u tiên ở Sendai bằng cách tiêm vi khuẩ n giố ng tinh khiế t vào đâ ̣u tƣơng (Elahi, Choi et al. Ngày nay, natto đã phổ biế n ta ̣i Nhâ ̣t. Thông thƣờng nó đƣơ ̣c bán ta ̣i các cƣ̉a hiê ̣u ta ̣p hóa trong các túi nilon. Ở Nhật, natto đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng dƣới một số dạng nhƣ trô ̣n với lúa mì , cải bắ p , trƣ́ng hoă ̣c trô ̣n salát, hoặc nhƣ mô ̣t loa ̣i gia vi .̣ Trong một thƣ̉ nghiê ̣m kiể m chƣ́ng , natto đƣơ ̣c chuẩ n bi ̣bằ ng cách bổ sung B.
subtilis vào đậu tƣơng hấ p chín cho vào trong túi nylon rồ i để hỗn hơ ̣p lên men trong 24 giờ ở 37ºC. Vi khuẩ n natto ở da ̣ng bô ̣t sấ y khô đạt đƣợc mâ ̣t đô ̣ khoảng 10 tỷ tế bào/gam sản phẩm (Sumi 1999). Hình 1: Sản phẩm natto sau khi lên men e 4 2.2 Đặc điểm, cấu trúc của Nattokinase 2. Đặc điểm Bảng 1: Đặc điểm của Nattokinase (Kim, Gum et al.
2008) Tên enzyme Nattokinase Tên thay thế Cardiokinase Gene mã hoá aprE Vi sinh vật thao tác B. subtilis Danh pháp công bố 86029 [NCBI] Bacteria › Firmicutes › Bacillales › Thứ tự phân loại vi khuẩn B.subtilis Bacillaceae › Bacillus Chiều dài chuỗi acid amin 275 aa Trọng lƣợng phân tử 28 kDalton Điểm đẳng điện pI 6,79 Hoạt tính xúc tác Thủy phân protein. thuỷ phân petitde Dạng tiết protein thành phẩm Tiết ngoài 2.Cấu trúc phân tử Nattokinase Enzyme Nattokinase có tính tƣơng đồng cao với các enzyme subtilisin ở mức độ trình tự trên 99%. Cấu trúc của Nattokinase có đặc điểm cấu hình linh hoạt phù hợp với việc tác động lên cấu trúc fibrin, một tác nhân làm đông máu trong cơ thể (Suzuki, Kondo et al.
Hoạt tính của Nattokinase 2. Hoạt tính Không giống nhƣ aspirin và hầu hết các thuốc chống đông máu khác sẽ ức chế sản xuất fibrin, Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa những khu vực mà dòng máu lƣu thông bị cản trở không cần thiết. Bằng cách kích thích cơ thể tăng cƣờng sản xuất plasmin, Nattokinase không những giúp làm tan cục máu đông đã hình thành mà còn hoạt động nhƣ một thành phần chống cục máu đông hình thành. Nattokinase cũng ức chế Plasminogen Activator PAL -1 vốn là thành phần hạn chế hoạt động của plasmin trong cơ thể.
e 5 Cục máu đông có thể hình thành trong động mạch, tĩnh mạch, hoặc trong các buồng tim. Cục máu đông trong tĩnh mạch hình thành trong điều kiện dòng chảy thấp, bao gồm chủ yếu của các tế bào máu với vài tiểu cầu và chứa một lƣợng lớn các sợi fibrin xen kẽ. Các khối huyết này có thể vẫn còn tồn tại trong mạch máu. Tuy nhiên, cục máu đông cũng có thể di chuyể n hoặc bấ t đô ̣ng.
Nếu cục máu đông di chuyển từ một mạch ngoa ̣i biên đến phổi , kết quả là một sự tắc nghẽn phổi.Tƣơng tự nhƣ vậy , nếu một cục máu đông di chuyển từ tim hoặc động mạch cảnh lên não, nó gây ra đột quỵ. Và, cuối cùng, nếu cục máu đông di chuyển tƣ̀ một vị trí đế n biṭ kiń động mạch vành, nó gây ra một cơn đau tim. Thông thƣờng, trong những trƣờng hợp trên thì trong cơ thể sẽ xuấ t hiê ̣n các enzym huyết khối làm tan các cục máu đông đƣợc tạo ra trong các tế bào nội mô của mạch máu. Khi con ngƣời già đi , viê ̣c sản xuất các enzym này chậm lại và máu dễ bị làm đông hơn.
Tuy nhiên, cục máu đông có thể hình thành ở bất cứ độ tuổi nào .Vì vậy, viê ̣c phòng ngừa nên đƣơc ƣu tiên ngay cả đối với những ngƣời trẻ tuổ i và việc sử dụng một sản phẩm có chứa thành phần Nattokinase để phòng ngừa sẽ giúp hõ trợ một phần cho việc phòng ngừa và điều trị. Đáng chú ý, fibrinolysis (hiệu ứng sinh lý chính của Nattokinase) là một quá trình sinh lý tự nhiên. Fibrin, một thành phần làm đông máu nhanh đƣợc thủy phân thành các sản phẩm an toàn hơn cho hệ mạch trong quá trình fib rinolysis. Khi fibrin bi ̣thủy phân , thời gian đông máu chậm lại.
Nattokinase thủy phân sợi tơ fibrin và cơ chất của plasmin mô ̣t cách trực tiếp Trong quá trình điều chỉnh đông máu, prourokinase đƣợc chuyển đổi thành urokinase, quá trình này đƣợc xúc tác bởi Nattokinase. Bằng cách làm giảm sự hình thành huyết khối, Nattokinase giảm tốc độ tiến triển của sự hình thành mảng bám và hạn chế việc làm tổn thƣơng động mạch (Toki, Sumi et al. So sánh các tác nhân tiêu sợi 2.1 Urokinase Trong bệnh viện, Urokinase đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là một enzyme tiêu sợi huyết để xử lý các cục máu đông buồng tim tâm nhĩ , trong cơn đau tim và e 6 đột quỵ do ngheñ ma ̣ch. Nó đƣợc chỉ định để hòa tan huyết khối trong tim, mạch máu, hoặc phổi .Urokinase có chi phí giá thành cao hơn so với Nattokinase nhƣng hoạt lực cũng chỉ tƣơng đƣơng với hiệu quả của 100 gam Natto.
Nattokinase duy trì hoạt động trong thời gian 4-6 giờ, thời gian tác du ̣ ng lâu hơn so với Urokinase.2 Streptokinase Đây cũng là một enzyme đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân tan huyết khối trong các trƣờng hơ ̣p chăm sóc khẩn cấp. Nó có giá thành thấp hơn so với Urokinase trong mỗi lần điều trị. Streptokinase đƣợc chỉ định để điều trị nhồi máu cơ tim sớm, đặc biệt là nhồi máu cơ tim cấp tính trong vòng 6 giờ trƣớc khi bắt đầu đau đớn dẫn đến nhập viện.3 Bromelain Bromelain đƣợc sử dụng nhƣ một nhân tố tham gia vào quá trình chống đông máu hiệu quả có khả năng hoạt hóa trong quá trình fibrinolysis thông qua việc kích thích sản xuất plasmin.