MỞ ĐẦU Tyrosinase là enzym được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ nhiều năm qua. Tyrosinase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như ngành thực phẩm: tạo màu sắc, hương vị và chất lượng cho chè đen, café, ca cao., ngành y dược: ngăn ngừa sự xâm nhiễm vi khuẩn, điều trị bệnh Parkinson, bệnh tạng, lang ben., sản xuất kem làm trắng da và đặc biệt là khả năng phát hiên các hợp chất thuộc họ polyphenol trong xử lý môi trường. Với mục tiêu tạo ra lượng lớn tyrosinase trong thời gian ngắn, để ứng dụng vào các mục đích mong muốn, chúng tôi tiến hành tạo tyrosinase tái tổ hợp. Để tạo được tyrosinse tái tổ hợp việc chọn tế bào chủ để biểu hiện là vấn đề rất quan trọng.
Tyrosinas từ Aspergillus oryzae TP01 (chủng gốc) có hoạt tính tyrosinase nội bào, phải phá vỡ màng tế bào gây khó khăn khi thu nhận và làm tăng giá thành chế phẩm enzym. Do vậy chúng tôi chọn tế bào chủ là chủng nấm men Pichia pastoris với vector biểu hiện pPICZαA có tín hiệu α- factor là yếu tố tạo protein ngoại bào, thuận lợi cho quá trình thu nhận enzyme. Nội dung chính nhằm giải quyết vấn đề này được thực hiện trong luận văn: - Tách chiết ARN tổng số từ Aspergillus oryzae TP01. - Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho tyrosinse từ Aspergillus oryzae TP01.
- Tạo vector biểu hiện cho tyrosinase trong nấm men Pichia pastoris. - Biểu hiện tyrosinase trong Pichia pastoris X33. 7 Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. ENZYM TYROSINASE (EC 1.1) Tyrosinase là enzym hai chức năng (bifunctional enzym), xúc tác phản ứng hydroxyl hóa các monophenol như tyrosine, p-cresol và axít p-coumaric thành o- diphenol (thể hiện họat tính cresolase hoặc monophenolase) và oxi hóa o-diphenol thành dopaquinone (thể hiện hoạt tính catacholase hoặc diphenolase ).
Phản ứng chuyển hóa dưới sự xúc tác của tyrosinase 1. NGUỒN THU TYROSINASE Tyrosinase được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên, trong tất cả các cơ quan, các mô của thực vật, động vật cũng như trong vi sinh vật: vi khuẩn và nấm mốc. Đây là những nguồn thu enzym vô cùng phong phú. ∗ Tyrosinase từ thực vật Tyrosinase có hầu hết trong giới thực vật, là nguyên nhân hình thành các vết thâm trên rau quả khi bị dập nát.
Tyrosinase có rất ít ở cà chua và khoai tây, có nhiều trong đậu, rau pina, táo, hoa atiso, lê, dâu, khoai lang, lá chè, cây thuốc lá, vỏ nho, đặc biệt là nấm. Nấm trong tự nhiên có rất nhiều chủng loại, chứa khá nhiều tyrosinase, đặc biệt là nấm mỡ Agaricus bispora với hoạt lực rất cao. [12] Một số loài thực vật có hoạt tính tyrosinase như : • Nấm mỡ : Agaricus bispora. • Nấm kim châm : • Nấm sò : Pleurotus spp.
8 • Nấm quả thể : Amanita muscaria. • Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum ∗ Tyrosinase từ động vật Tyrosinase trong tất cả các tế bào động vật có chức năng hình thành sắc tố melanin bởi nó xúc tác chuyển hóa L-tyrosine thành L-Dopa và từ L-Dopa chuyển thành dopaquinon và cuối cùng tạo melanin. Sắc tố này quyết định màu lông ở động vật và màu tóc, màu mắt hay màu da ở người. Tuy nhiên, nguồn thu này không khả thi do việc thu nhận rất khó khăn mà hiệu quả kinh tế lại không cao.
Các yếu tố rủi ro về nguồn gốc, bệnh tật…vẫn là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học và nhà sản xuất. Nhưng cũng có một số nghiên cứu tách và tinh chế tyrosinase ở các động vật thân mềm và chuột bạch, đặc biệt nghiên cứu tyrosinase từ chuột bạch, phục vụ cho y học chủ yếu trong lĩnh vực thần kinh học, điều trị bệnh Parkinson ở người. [31] ∗ Tyrosinase từ vi sinh vật Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp một lượng lớn tyrosinase trong một thời gian ngắn với những điều kiện nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền. Do đó đây là một nguồn thu có triển vọng.
Các vi sinh vật đã được nghiên cứu để tách và thu tyrosinase gồm: vi khuẩn như Rhizobium meliloti, Thermomicrobium roseum,.Các loại xạ khuẩn như Streptomyces glaucescens , Streptomyces lavendulae. và đặc biệt là các loại nấm mốc Aspergillus oryzae, Neurospora crassa,. Tùy thuộc vào loài vi sinh vật (nấm mốc, vi khuẩn), điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng của môi trường, tyrosinase thu được có hoạt lực và tính chất của tyrosinase khác nhau. CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT CỦA TYROSINASE 1.1 Cấu tạo không gian và khối lượng phân tử của tyrosinase Tyrosinase (còn gọi là monophenol, o-diphenol oxygen oxidoreductase (EC.1)) là một protein kim loại (metal protein) đồng loại III.
Tyrosinase ở các loài khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau: tyrosinase của Aspergillus oryzae có khối lượng phân tử 180kDa, chia ra làm 4 tiểu phần, mỗi tiểu phần có khối lượng 67kDa; tyrosinase của Agaricus bisporus có khối lượng phân tử là 110- 130kDa, chia làm 4 tiểu phần, hai tiểu phần có khối lượng 43kDa, hai tiểu phần có khối lượng là 13kDa; Illex agentius: 140kDa, Ruditapes philippinarum: 80kDa, người: 66kDa, Streptomyces:30kDa, táo: 66kDa, khoai tây: 67kDa, cà chua: 66- 71kDa.[7] Cấu trúc bậc 3 của tyrosinase cho tới nay chưa được hoàn thiện. Tuy nhiên cấu trúc tinh thể đã được xây dựng dựa trên protein ORF378 ( ORF: open reading frame, gen orf có 378 nucleotid, được đặt ngược chiều với gen tyrosinase tyrC trong gen tổng hợp melanin từ Streptomyces castaneoglobisrus HUT6202). Tyrosinase có cấu trúc xoắn ốc α gồm α 2, α3,α6,α7, ngoài ra còn có một vào cấu trúc gấp nếp tờ giấy β. [51] Màu xanh dương: ORF Màu đỏ: tyrosinase Hình 1.
Cấu trúc xoắn ốc α của tyrosinase Màu xanh: ion Cu 10 1. Cấu trúc trung tâm hoạt động của tyrosinase Trung tâm hoạt động của tyrosinase chứa hai nguyên tử Cu: CuA và CuB. Cu A: Trung tâm Cu A có chứa 2 hạt nhân, 2 nguyên tử Cu được nối với nhau bởi 2 nguyên tử S từ 2 Cystein. Mỗi nguyên tử Hi Cu còn nối với nguyên tử N từ His.
Chức năng của trung tâm CuA là ở trong chuỗi vận chuyển electron và có thể tìm thấy trung tâm này trong cytochrome oxidase và nitrous oxide reductase. Nó có phổ EPR (Electron paramagnetic resonance) rất điển hình và có màu tía. Ở dạng oxi hoá, mỗi nguyên tử Cu Cu đều ở trạng thái hoá trị hỗn hợp Cu(1. [37] CuB: Trung tâm CuB rất giống với His nhóm ngoại Hem chứa Fe trong trung tâm phản ứng của cytochrome xúc tác phản ứng khử O2 thành nước.
Năng lượng giải phóng ra được sử dụng để chuyển proton qua màng nơi gắn cytochrome. Tâm CuB được đặt xuyên qua trục của His Cu trong tâm nhóm ngoại Hem a3 và liên kết với 3 histidin dưới dạng hình chóp tam giác với vị trí liên kết mở của nhóm Cu hướng tới vị trí liên kết mở của nguyên tử Fe trong nhóm Hem. [37] 11 Màu xanh dương: Histidin (His) Màu xanh: nguyên tử Cu Màu đỏ: bề mặt ngoài của tyrosinase Hình 1. Cấu tạo trung tâm hoạt động của tyrosinase Mỗi nguyên tử Cu được bao quanh bởi ba histidine, ứng với 3 trạng thái:[37] • Deoxy-tyrosinase – E red (Edeoxy) (với trung tâm hoạt động Cu 1+ - Cu1+ ) với khoảng cách giữa 2 nguyên tử Cu là 4,4Ao.
Đây là vị trí mà khi tương tác với phân tử oxy sẽ tạo hắc tố hemocyanin His His Cu1+ Cu1+ His His His His His His His His O Cu1+ Cu1+ + O2 Cu Cu His His His O His His His His His Hemocyanin Hình 1. Phản ứng tạo Hemocyamin từ Deoxy-tyrosinase • Met-tyrosinase - E met (với trung tâm hoạt động là Cu2+-OH--Cu2+), khoảng cách giữa Cu-Cu là 2,9A o. 12 His His Cu2+ Cu2+ His O His His His H • Oxy-tyrosinase – Eoxy (với trung tâm hoạt động là Cu2+ - O2--Cu2+), khoảng cách giữa Cu-Cu là 3,6A o. His O His Cu2+ Cu2+ His O His His His Ngoài ra còn có dạng Half-met tyrosinase (trung tâm hoạt động là Cu 2+ - Cu 1+).
Trường hợp này ít xuất hiện trong cấu trúc của tyrosinase. Tính chất của Tyrosinase Tyrosinase từ các nguồn khác nhau có các đặc tính khác nhau. ∗ Tyrosinase từ thực vật: Tyrosinase có nhiều trong thực vật nhất là trong các loại rau, quả. Đã có nhiều nghiên cứu về tyrosinase từ các loại nấm trong tự nhiên.
Tyrosinase từ nấm Amanita muscaria: pH tối ưu 6, không có hoạt tính khi ở pH < 3, nhưng ở pH=8 enzym vẫn còn 75% hoạt tính. Chất kìm hãm là β-mercaptobenzothiazola (2-MBT) và tropolone. Với axit benzoic 1mM ức chế 95% hoạt tính enzym ở pH 5 nhưng với pH 7 thì axít này không còn khả năng ức chế. Cơ chất đặc hiệu: các monophenol như tyrosine, tyramine, axit 3-(4-hydroxyphenyl) propionic, các diphenol như L- DOPA, D-DOPA, 3-hydroxytyramine và axit 3-hydroxy cafeic.
Trong đó tyrosine có K m thấp nhất và Vmax cao nhất trong các cơ chất trên [29] Tyrosinase từ cây thuốc lá Nicotiana tabacum có pH tối ưu 7, nhiệt độ tối ưu 40 oC, Km = 6.8 mM với cơ chất là catechol ở pH = 6,5 trong đệm H3PO4- NaOH 0,05M. Sử dụng phương pháp đo quang phổ UV/VIS EPR 13 xác định được tyrosinase từ cây thuốc lá có cấu trúc chứa 3 nguyên tử đồng .[10] Tyrosinase từ Agaricus bisporus có khối lượng phân tử M = 108kDa, pH tối ưu 7, pI=5,1-5,2, nhiệt độ tối ưu 300C, Km = 0,44 mM (L-DOPA), Vmax = 24,5 µmol/phút (L-DOPA) [40] ∗ Tyrosinase từ động vật: Tyrosinase từ động vật thân mềm Illex agentius có pH tối ưu 8,0, hoạt tính enzym còn trên 90% ở dải pH=6,5 – 11 sau 24h. Hoạt tính ổn định ở 4-40 oC, trên 45 0C enzym mất hoàn toàn hoạt tính, cơ chất đặc hiệu là L- DOPA, chất ức chế là phenylthiourea, tropolone, axit kojic và abutin .[47] Tyrosinase từ loài trai biển Ruditapes philippinarum có pH tối ưu 7, nhiệt độ tối ưu 40oC, Km = 2,2 mM/l với cơ chất là L-DOPA, bị ức chế mạnh bởi axit benzoic, sodium sulfite, axit citric, 1-phenyl- 2 thiourea và cystein, không bị ảnh hưởng bởi axít ascobic. Tyrosinase từ người có nhiệt độ tối ưu là 50 oC, hoạt độ enzym giảm mạnh khi nhiệt độ trên 55 oC, pH tối ưu 7,5 hoạt lực enzym giảm 30% khi pH dưới 6,5.
Cơ chất đặc hiệu là L-DOPA, K m là 0,31mM, chất ức chế là arbutin và ethyl ascorbyl. ∗ Tyrosinase từ vi sinh vật : Tyrosinase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermomicrobium roseum có pI = 4,9, pH tối ưu 9,5; enzym mất 50% hoạt tính khi pH<7 và pH>10,5, nhiệt độ tối ưu 70oC, bền ở nhiệt độ dưới 750C, trên 90 0C enzym mất hoạt tính hoàn toàn. Cơ chất đặc hiệu là catechol, không có hoạt tính với cơ chất là axít vanillic. Chất kìm hãm là β-mercaptoethanol với nồng độ 0,1 mM và sodium diethyldthiocarbamat 1mM, hoạt tính của enzym tăng khi có mặt 14 của ion Mg 2+, K+ và Cu+ 1mM.
Giá trị Km với cơ chất L-DOPA là 0,18mM.