CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cellulose và vai trò của cellulose trong sinh giới Cellulose là một polysaccharide mạch thẳng, chiếm 40-60% vách tế bào thực vật, được coi là nguồn sinh khối phong phú trên Trái Đất. Cellulose được cấu thành bởi các đơn phân glucose bằng liên kết β-1,4-glycosidic, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n. Trong đó, n là số lượng phân tử glucose trong khoảng từ 100-15000 phụ thuộc vào loại mô tế bào của từng loài thực vật khác nhau [14, 15]. Mỗi chuỗi cellulose đơn bao gồm một đầu không khử (C4-OH) và một đầu khử (C1-OH).
Trong tế bào thực vật, cellulose tồn tại ở nhiều dạng khác nhau: chuỗi cellulose đơn, sợi cơ sở (bao gồm khoảng 10 chuỗi cellulose đơn), và vi sợi (khoảng 40 sợi cơ sở với đường kính 10-20 nm). Trong đó, các chuỗi cellulase đơn trong sợ cơ sở và vi sợi được gắn kết với nhau bằng liên kết hydro [16]. Hiện nay, một số phương pháp thường được sử dụng để tách chiết và thu nhận cellulose như sử dụng acid hoặc kiềm mạnh (akaline extration, acid hydrolysis), tẩy trắng (bleaching treatment), hoặc hơi nước (steam exploision),… Mục đích chính của các phương pháp này là để loại bỏ các thành phần khác có trong vách tế bào thực vật như hemicellulose và lignin để thu nhận cellulose tinh khiết [17]. Trong tự nhiên, cellulose cùng với hemicellulose và lignin giúp duy trì hình dạng và độ cứng của vách tế bào thực vật, bảo vệ chúng khỏi những bất lợi từ môi trường sống và nhiều loài sinh vật gây hại.
Ngoài ra, cellulose còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng cho thực vật [18]. Ở một số loài vi sinh vật, cellulose là nguồn cung cấp năng lượng và dinh dưỡng rất quan trọng. Nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc sử dụng cellulose như nguồn thức ăn nhờ khả năng sản xuất cellulase ngoại bào. Bên cạnh đó, vi khuẩn cộng sinh với hệ tiêu hóa của trâu, bò, cườu,… cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulase để giúp các loài động vật nhai lại này hấp thụ các chất dinh dưỡng từ thực vật [19].
6 Trong đời sống, cây gỗ lâu năm có thành phần chính là cellulose được dùng làm vật liệu để xây dựng nhà cửa, sản xuất các vật dụng như bàn, ghế, giường, tủ, dụng cụ nấu ăn…để phục vụ cho nhu cầu sinh sống và làm việc của con người. Bên cạnh đó, cellulose cũng có trong chất xơ của nhiều loại rau, củ, quả…ở dạng vi sợi, cấu trúc này giúp cellulose có thể lưu giữ nước, dầu, hấp thu glucose và cholesterol. Từ đó, con người có thể phòng ngừa các bệnh như tiểu đường, béo phì, ung thư và một số bệnh đường tiêu hóa [20, 21]. Hơn nữa, cellulose với các đặc tính không độc hại, có khả năng phân hủy sinh học và độ bền cao được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau như công nghệ nano, dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, dệt may, bột giấy,… Ngoài ra, cellulase còn được nghiên cứu như một hệ thống vận chuyển thuốc trong điều trị ung thư và một số bệnh ở đường tiêu hóa trong những năm gần đây [17].
Từ những dẫn chứng trên cho thấy, cellulose có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên và đời sống. Tuy nhiên, việc phân giải các vật liệu cellulose bằng enzyme cellulase cũng mang lại lợi ích kinh tế cao trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Một trong những mối quan tâm hiện nay là sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch đã khiến nguồn tài nguyên này đang dần cạn kiệt. Vì vậy, việc sản xuất nhiên liệu sinh học đang nhận được sự quan tâm nghiên cứu và phát triển rộng rãi.
Cellulose có nguồn cung cấp dồi dào được xem như một nguồn năng lượng bền vững và có thể tái tạo. Nguồn nguyên liệu này được cellulase chuyển đổi thành glucose để phụ vụ cho quá trình lên men nhằm mục đích thu nhận nhiên liệu sinh học như ethanol [16].2 Tổng quan về Bacillus subtilis 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis là một trong những loài vi khuẩn Gram dương điển hình và có tỉ lệ G+C thấp. Loài vi khuẩn này được phát hiện lần đầu vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg và được đặt tên là Vibrio bacillus. Đến năm 1872, Ferdinand Cohn đã đổi tên loài này thành Bacillus subtilis sau khi công bố thí nghiệm chứng minh loài này có khả năng hình thành bào tử và chịu được nhiệt độ cao [22].
subtilis 7 có tế bào hình que với chiều dài 2,0-6,0 micromet (µm), đường kính dưới 1,0 µm và thể tích khi tế bào ở pha cân bằng khoảng 4,6 fL [23, 24]. Cấu trúc vách tế bào của B. subtilis bao gồm màng tế bào chất, bao bọc bên ngoài bởi vách peptidoglycan dày và không có màng ngoài như các loài vi khuẩn Gram âm [25]. subtilis di chuyển trong môi trường sống nhờ vận động quay tròn của tiên mao thông qua “hook” và “basal body” [26, 27].
Trong đó, basal body có vai trò là nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình vận động, trong khi hook tồn tại như một “khớp nối” làm thay đổi góc quay của tiên mao [27]. Cấu tạo này đã tạo nên hai phương thức di động chính của B. subtilis: di động riêng lẻ trong môi trường chất lỏng và di động theo nhóm trên các bề mặt rắn [28-30]. Ngoài ra, loài vi khuẩn này còn được ghi nhận có khả năng hình thành nội bào tử để chống chịu với các điều kiện bất lợi trong quá trình sinh trưởng và phát triển như tia UV, nhiệt độ cao, chất hóa học (peroxide, hypochlorite), … [31].
Về mặt di truyền, bộ gene của B. subtilis là DNA đơn dạng vòng, được giải mã toàn bộ vào năm 1997. Bộ gene này có tổng số 4 214 630 cặp base (43.5% GC) và mã hóa cho khoảng 4100 protein [32]. subtilis từng được phân loại vào nhóm hiếu khí bắt buộc khi oxi là chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào [33].
Tuy nhiên, Danchin và cộng sự (1995) đã chứng minh được sự đồng hóa nitrate trong hô hấp kỵ khí ở loài B. Do đó, loài này hiện tại được xem như một loài vi khuẩn hiếu khí tùy nghi. Bacillus subtilis nói riêng và những loài Bacillus nói chung được Food and Drug Administration (FDA) xếp vào nhóm sinh vật không gây hại cho người và động vật (Generally Regarded as Safe). Vi khuẩn này được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học do bộ gene dễ dàng chỉnh sửa có thể được sử dụng cho quá trình biểu hiện và sản xuất protein [26, 35].
subtilis có tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ dàng nuôi cấy và khả năng sản xuất đa dạng các loại enzyme ngoại bào nên loài này được xem là đối tượng tiềm năng để sản xuất các enzyme thương mại như amylase, protease, cellulase,. Theo ước tính, các loài thuộc chi Bacillus sản xuất khoảng 50-60% lượng enzyme thương mại trên toàn cầu, trong đó có B.2 Phân loại Theo Bergey, Bacillus subtilis được phân loại như sau [38]: Giới : Bacteria Ngành : Bacillota Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales Họ : Bacillaceae Chi : Bacillus Loài : Bacillus subtilis Đa số các loài thuộc chi Bacillus có danh pháp chính thức đã được phân vào các nhóm khác nhau. Dựa trên các đặc điểm giống nhau về kiểu gene và kiểu hình, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus pumilus là những loài đầu tiên được phân vào nhóm có tên chung Bacillus subtilis [39]. Trong những năm gần đây, nhiều loài mới thuộc nhóm B.
subtilis đã được phân lập và miêu tả đặc điểm hình thái vi thể, đại thể và sinh học phân tử như Bacillus atrophaeus [40], Bacillus mojavensis [41], Bacillus vallismortis [42], Bacillus sonorensis [43], Bacillus velezensis [44],… Hơn nữa, nhóm B. subtilis còn có loài phụ: B. Gần đây, nhiều phương pháp dựa trên trình tự bộ gene (complete & WGS) đã được sử dụng để phân biệt các loài thuộc nhóm B. Điều này nhằm giải quyết những khó khăn gặp phải trong quá trình xây dựng cây phát sinh loài do sự bảo tồn gene tự nhiên của nhóm B.3 Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên Trong tự nhiên, B.
subtilis được tìm thấy trong đất, rễ cây và môi trường nước. subtilis còn được tìm thấy trong ruột của các loài động vật nhai lại với vai trò 9 tiêu hóa cellulose. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào cho thấy B. subtilis gây hại đến vật chủ [26].
subtilis sinh trưởng chủ yếu ở vùng rễ cây và cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong việc kiểm soát sự sinh trưởng của thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) bằng các tác động trực tiếp và gián tiếp [47]. subtilis có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, β- glucosidase,… để phân hủy vách tế bào của các loài mốc gây hại đến thực vật [48]. subtilis còn tổng hợp một số lipopeptide như fengycin, surfactin và iturin. Những lipopeptide này có tác dụng hạn chế sự phát triển của các tác nhân làm giảm sự hấp thụ chất dinh dưỡng ở vùng rễ thực vật [49].
subtilis có khả năng tổng hợp 1-aminocyclopropan-1-carboxylate deaminase (ACC) để kích thích hệ thống miễn dịch của cây chống lại bệnh hại, tác nhân phi sinh học và duy trì sự phát triển bình thường của thực vật [50]. Hơn thế nữa, chủng B. subtilis SYST2 trong nghiên cứu của Tahir và cộng sự (2017) đã sinh tổng hợp một số hợp chất bay hơi (Volatile organic compounds) để điều hòa sự sản xuất hormone sinh trưởng ở thực vật [51]. Một số nghiên cứu khác cũng đã chứng minh B.
subtilis có khả năng duy trì sự phát triển bình thường của cây khi bị mất cân bằng áp suất thẩm thấu do nồng độ muối cao gây ra [52, 53] Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ từ 30 đến 35°C và pH 7,0 [24]. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn này vẫn có khả năng sinh trưởng trong các điều kiện nhiệt độ và pH khắc nghiệt hơn [54, 55]. subtilis là vi khuẩn dị dưỡng, hấp thụ trực tiếp dinh dưỡng từ môi trường và chuyển hóa thành năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống. Vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng và phát triển trên nhiều môi trường khác nhau nhờ khả năng phân hủy và sử dụng phần lớn các polysaccharides là thành phần của vách tế bào thực vật như cellulose, hemicellulose, raffinose,… [56].
subtilis cũng được ghi nhận có thể sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào khác như protease, amylase, chitinase…[57-59]. Trong các thí nghiệm in vitro, B. subtilis có thể sinh trưởng trên cả môi trường giàu dinh dưỡng và môi trường muối vô cơ với các nguồn carbon như glucose, malate, … và nguồn nitrogen là các muối ammonium và một số amino acid [60]. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chứng minh được B.
10 subtilis có khả năng sinh trưởng ở nồng độ NaCl cao lên đến 30% [61].