PHẦN MỞ ĐẦU 1/ Lý do chọn đề tài: Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật. Ðó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm.Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men. Cho đến nữa đầu thế kỷ XIX các nhà khoa học đã khái quát được quá trình lên men là hiện tượng phổ biến trong sự sống và vai trò qua trọng của enzyme trong chuyển hoá các chất trong quá trình lên men. Đến nay việc nghiên cứu enzyme đã bước vào một giai đoạn mới với sự kết hợp nhiều ngành khoa học khác nhau: hoá học protein, lý sinh phân tử, sinh học phân tử…Trong nghiên cứu cũng như thu nhận, tinh chế enzyme, hay thiết kế định hướng những phân tử enzyme ưu việt hơn dạng tự nhiên.
Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lãnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… Do vậy, quá trình thu nhận và tinh sạch protein/enzyme giữ vai trò cực kỳ quan trọng và không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất để phụ vụ cho con người. 2/ Mục đích nghiên cứu: Hiểu và nắm rõ các phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh, phương pháp kiểm tra độ tinh sạch cũng như hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật để ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy, sản xuất các loại enzyme phục vụ cho các lĩnh vực khác. Biết được phương pháp để đánh giá độ tinh sạch của enzyme từ vi sinh vật, cũng như lựa chọn các loại dịch chiets có độ tinh sạch phù hợp với mục đích nghiên cứu 3/ Nội dung: 1/ Giới thiệu chung về enzyme 1.2/ Tính chất của enzyme 2/ Thu nhận enzyme từ vi sinh vật 2.1/ Thu nhận enzyme thô 2.2/Các phương pháp thu nhận enzyme thô Tieu luan 2.1/ Pháp pháp cơ học 2.2/ Phương pháp cô đặc 2.3/ Phương pháp siêu lọc 2.3/ Các phương pháp tinh sạch enzyme 2.1/ Phương pháp kết tinh 2.2/ Phương pháp điện di 2.3/ Phương pháp sắc ký 3/ Các phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của enzyme từ vi sinh vật 4/ Hoạt tính của enzyme từ vi sinh vật 5/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme lipase 6/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme amylase 7/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme pecrinase 8/ Quy trình sản xuất, phương pháp kiểm tra độ hoạt tính của enzyme protease 4/ Kết quả nghiên cứu - Nắm được các quy trình thu nhận , tinh sạch , kiểm tra hoạt tính các loại enzyme vi sinh vật. Từ đó, lựa chọn giống vi sinh vật phù hợp với mục đích nghiên cứu.
- Hiểu các quy trình thu nhận, tinh sạch, kiểm tra hoạt tính các loại enzyme lipase, amylase, pectinase, protease từ nguồn vi sinh vật. Ứng dụng nghiên cứu nhân giống vi sinh vật, sản xuất enzyme vi sinh vật với quy mô công nghiệp, làm giảm giá thành sử dụng. Tieu luan PHẦN NỘI DUNG 1/ GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 1.1/ Định nghĩa: - Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho những phản ứng hóa học với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp - Trong phản ứng enzyme xúc tác các phân tử lúc ban đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzyme biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau. Enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn các chất xúc tác hữu co và vô cơ khác.
Enzyme không chỉ xúc tác các phản ứng trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi cơ thể sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện xác định. - Enzyme có tính đặc hiệu, nghĩa là mỗi loại enzyme chỉ xúc tác cho một cơ chất nhất định.2/ Tính chất của enzyme: - Enzyme có bản chất là protein nên có tất cả các thuộc tính lý hóa của protein. Đa số các loại enzyme có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn. - Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong ete và các dung môi không phân cực.
- Dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao. Trong môi trường axit hoặc bazo cũng làm enzyme mất khả năng hoạt động. - Enzyme có tính lưỡng tính. - Tính cường lực xúc tác - Tính đặc hiệu - Làm giảm năng lượng hoát hóa phản ứng - Enzyme có hai nhóm: enzyme một cấu tử ( chỉ chứa protein) và enzyme hai cấu tử ( trong phân tử còn có nhóm không phải protein).
Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần: • Apoenzym: Phần protein, nâng cao lực xúc tác của E, quyết định tính đặc hiệu. Tieu luan • Coenzym: Phần không phải protein, trực tiếp tham gia vào phản ứng E, bản chất là những hợp chất hữu cơ phức tạp. Tieu luan 2/ THU NHẬN ENZYME TỪ VI SINH VẬT: *Ưu điểm của nguồn thu enzyme vi sinh vật: - Có thể thay đổi hệ enzme bằng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy và sử dụng các tác nhân điều chỉnh. Bằng cách này có thể vi sinh vật tổng hợp mạnh hoặc một vài enzyme nào đó theo mong muốn.
- Khả năng sinh sản nhanh, phát triển mạnh và sinh tổng hợp enzyme với vận tốc rất lớn nên cho phép thu được một lượng lớn enzyme trong khoảng thời gian ngắn một cách dễ dàng. - Khả năng chuyển hóa mạnh nên hoạt tính của enzyme vi sinh vật rất mạnh, vượt xa so với các enzyme khác - Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật, là nguồn nguyên liệu vô tận, có thể chủ động tạo ra được.Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (16-100 giờ). Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Và phần lớn thức ăn nuôi vi sinh vật dễ kiếm và rẻ.
- Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, trong vòng 24 giờ vi sinh vật có thể chuyển hoá một lượng thức ăn gấp 30-40 lần trọng lượng cơ thể chúng.1/ Thu nhận enzyme thô - Trên thực tế có nhiều phương pháp thu nhận enzyme từ vi sinh vật. Một số phương pháp tách chiết như phương pháp cơ học, cô đặc, siêu lọc và các phương pháp tinh sạch enzyme phổ biến hiện nay như phương pháp sắc kí, điện di, kết tủa, màng bán dẫn. - Các Enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu trúc tế bào chứa chúng. Do đó, để chiết rút enzyme nội bào thì điều trước tiên ta phải phá vỡ cấu trúc tế bào có chứa ezyme và chuyển chúng vào dung dịch.
- Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, dung dịch đệm hoặc muối trung tính.2/ Các phương pháp thu nhận enzyme thô: 2.1/ Phương pháp cơ học: - Phương pháp cơ học được ứng dụng để tách enzyme ra khỏi tế bào và các thành - phần khác gồm 2 phương pháp: + Phương pháp lọc + Phương pháp ly tâm a/ Phương pháp ly tâm - Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhận enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào. - Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan.
Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau: + Protein có hoạt tính sinh học + Các chất hòa tan khác + Nước - Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác. - Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp. - Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục.
Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa. - Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.
b/ Phương pháp lọc - Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan. Tieu luan - Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc.
Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, độ nhớt dịch lọc, sức đề kháng. - Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau: + Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả. + Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính.
Trong đó, lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả. + Lọc theo dòng chảy cắt ngang: Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới.
Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu chất rắn.