Nghiên Cứu Hoạt Tính Của Protein KOD DNA Polymerase Tái Tổ Hợp Ở E. Coli

• Tác giả: Nguyễn Thị Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Sáng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Protein KOD DNA Polymerase Tái Tổ Hợp Ở E. Coli
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về PCR
• 1.2. Ứng dụng của PCR
• 1.3. Thành phần phản ứng PCR
• 1.4. Giới thiệu về DNA polymerase
• 1.4.1. Giới thiệu chung
• 1.4.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein
• 1.4.3. Các loại DNA polymerase thương mại
• 1.4.4. Cấu trúc của DNA polymerase
• 1.5. KOD DNA polymerase
• 1.5.1. Tình hình nghiên cứu
• 1.5.2. Giới thiệu về KOD
• 1.5.3. Đặc điểm và cấu trúc
• 1.5.4. Lựa chọn hệ thống biểu hiện
• 1.5.5. Vật chủ biểu hiện
• 1.5.6. Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực
• 1.5.6.1. Sắc ký ái lực Nickel
• 1.5.6.2. Sắc ký ái lực Glutathione
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD
• 2.3.2. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD
• 2.3.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 2.3.4. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
• 2.3.5. Thẩm tách protein
• 2.3.6. Thử hoạt tính enzyme
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng gen KOD
• 3.2. Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD
• 3.3. Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR
• 3.4. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1
• 3.5. Kết quả tách chiết plasmid DNA
• 3.6. Giải trình tự plasmid
• 3.7. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 3.8. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
• 3.9. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel
• 3.10. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST
• 3.11. Thẩm tách protein
• 3.12. Thử hoạt tính enzyme
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về KOD DNA Polymerase Ứng Dụng Nghiên Cứu

KOD DNA polymerase là một enzyme quan trọng, nổi bật trong số các DNA polymerase hiện có. Enzyme này có vai trò chủ chốt trong PCR, đặc biệt là khuếch đại các đoạn gen lớn, giải trình tự hệ gen, nghiên cứu đột biến và tổng hợp gen. Do đó, KOD DNA polymerase được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như sinh học, y học, pháp y, khoa học hình sự và nông nghiệp. Ví dụ, nó được sử dụng trong xét nghiệm sinh học phân tử để chẩn đoán các bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn và phát hiện mầm mống gây ung thư. Hiện tại, KOD DNA polymerase được cung cấp bởi TOYOBO Ltd (Nhật Bản) và Millipore, Sigma (Mỹ). Tuy nhiên, việc nhập khẩu gặp khó khăn về giá thành, thời gian vận chuyển và chất lượng enzyme. Vì vậy, Việt Nam cần có quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase chất lượng tốt với giá thành cạnh tranh để chủ động về công nghệ.

1.1. Ứng dụng của KOD DNA polymerase trong PCR hiện đại

KOD DNA polymerase sở hữu nhiều đặc tính ưu việt như tần số đột biến thấp, tính ổn định cao và tốc độ kéo dài nhanh, khiến nó trở thành lựa chọn hàng đầu cho PCR hiệu suất cao. Nó cho phép khuếch đại chính xác các đoạn DNA lớn, rất quan trọng trong các ứng dụng như giải trình tự hệ gen, phân tích đa hình DNA, và nghiên cứu biểu hiện gen. Kỹ thuật PCR sử dụng KOD DNA polymerase giúp chẩn đoán bệnh nhanh chóng và chính xác, từ đó có thể phát hiện các bệnh do virus, vi khuẩn. Các nghiên cứu cũng cho thấy KOD DNA polymerase có thể phát hiện mầm mống gây ung thư, hỗ trợ trong việc điều trị bệnh hiệu quả hơn.

1.2. So sánh KOD DNA polymerase với các enzyme polymerase khác

So với các enzyme DNA polymerase khác như Taq polymerase hay Pfu polymerase, KOD DNA polymerase có độ chính xác cao hơn đáng kể nhờ khả năng đọc sửa. Điều này giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình khuếch đại, đảm bảo tính toàn vẹn của trình tự DNA. Ngoài ra, KOD DNA polymerase cũng có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và tốc độ kéo dài nhanh hơn, cho phép thực hiện PCR hiệu quả hơn. Bảng 1 so sánh một số đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến. Các đặc tính này bao gồm độ chính xác, tính ổn định và tốc độ kéo dài.

II. Thách Thức Trong Sản Xuất KOD DNA Polymerase Tái Tổ Hợp

Mặc dù có nhiều ứng dụng, việc sản xuất KOD DNA polymerase tái tổ hợp đối mặt với nhiều thách thức. Đầu tiên, quá trình biểu hiện gen KOD trong E. coli có thể gặp khó khăn do độc tính của protein hoặc sự hình thành các thể vùi không hoạt động. Thứ hai, việc tinh sạch enzyme từ hỗn hợp protein phức tạp đòi hỏi các quy trình sắc ký hiệu quả, đảm bảo độ tinh khiết và hoạt tính của enzyme. Thứ ba, việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR để đảm bảo hiệu suất và độ chính xác cao cũng là một vấn đề quan trọng. Hiện nay, trên thế giới đã có nghiên cứu về cấu trúc của KOD năm 1997 [32], và một số nghiên cứu tinh sạch enzyme này ở vật chủ E. coli, tuy nhiên kết quả tinh sạch vẫn chưa được công bố cụ thể. Gần đây nhất là nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch KOD ở hệ thống biểu hiện nấm men năm 2015 [39].

2.1. Vấn đề biểu hiện protein KOD trong hệ thống E. coli

Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli thường gặp phải tình trạng protein bị gấp sai hoặc tạo thành thể vùi, làm giảm hoạt tính của enzyme. Gen KOD có thể chứa các codon hiếm, gây khó khăn cho quá trình dịch mã trong E. coli. Ngoài ra, protein KOD có thể gây độc cho tế bào E. coli, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và năng suất biểu hiện. Cần tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện như nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và loại vector để cải thiện hiệu quả biểu hiện. Ngoài ra, việc sử dụng các dòng E. coli chuyên biệt có khả năng biểu hiện protein tốt hơn cũng cần được xem xét.

2.2. Các phương pháp tinh sạch KOD DNA polymerase hiệu quả

Tinh sạch KOD DNA polymerase đòi hỏi các kỹ thuật sắc ký ái lực để loại bỏ các tạp chất và thu được enzyme có độ tinh khiết cao. Sắc ký ái lực Nickel và GST là hai phương pháp phổ biến được sử dụng để tinh sạch các protein tái tổ hợp. Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm riêng, cần lựa chọn phương pháp phù hợp dựa trên đặc tính của protein và yêu cầu về độ tinh khiết. Việc tối ưu hóa các điều kiện sắc ký như pH, nồng độ muối và tốc độ dòng chảy là rất quan trọng để đạt được hiệu quả tinh sạch tối ưu.

2.3. Ảnh hưởng của điều kiện PCR đến hoạt tính enzyme KOD

Hoạt tính của KOD DNA polymerase phụ thuộc vào các điều kiện phản ứng PCR như nhiệt độ, pH, nồng độ Mg2+ và nồng độ dNTPs. Việc lựa chọn các điều kiện PCR phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất và độ chính xác của phản ứng. Cần tối ưu hóa các điều kiện này để enzyme hoạt động hiệu quả nhất. Ngoài ra, cần lựa chọn mồi (primer) phù hợp với trình tự DNA đích để tránh các phản ứng không đặc hiệu.

III. Phương Pháp Nhân Dòng và Biểu Hiện Gen KOD DNA

Để sản xuất KOD DNA polymerase tái tổ hợp, quy trình nhân dòng và biểu hiện gen KOD đóng vai trò then chốt. Điều này bao gồm tối ưu hóa mã bộ ba, tổng hợp gen, chèn gen vào vector biểu hiện, và biểu hiện protein trong E. coli. Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp và tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện là rất quan trọng để đạt được năng suất cao và hoạt tính của enzyme. Căn cứ vào mục tiêu chính của đề tài, chúng tôi đề ra các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Tối ưu hóa được mã bộ ba của gen KOD DNA polymerase bằng công cụ tin sinh. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase. Chèn đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1. Biểu hiện protein KOD tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 DE3. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột Niken hoặc GST. Đánh giá hoạt tính enzyme KOD bằng kỹ thuật PCR.

3.1. Tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD cho E. coli

Việc tối ưu hóa mã bộ ba giúp tăng cường hiệu quả dịch mã trong E. coli bằng cách thay thế các codon hiếm bằng các codon phổ biến. Quá trình này có thể được thực hiện bằng các công cụ tin sinh học trực tuyến. Bảng 7 thể hiện kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba sử dụng GenScript. Tối ưu hóa mã bộ ba làm tăng hiệu quả dịch mã và giảm nguy cơ protein bị gấp sai. Điều này góp phần tăng năng suất biểu hiện và cải thiện hoạt tính của enzyme.

3.2. Lựa chọn vector biểu hiện pET M và pGEX 4T 1 phù hợp

Vector biểu hiện đóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp. Vector pET-M và pGEX-4T-1 là hai loại vector phổ biến được sử dụng trong E. coli. Vector pET-M có hệ thống cảm ứng T7 mạnh mẽ, cho phép biểu hiện protein với năng suất cao. Vector pGEX-4T-1 chứa gen mã hóa Glutathione S-transferase (GST), giúp tinh sạch protein dễ dàng bằng sắc ký ái lực. Việc lựa chọn vector phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của protein và mục tiêu nghiên cứu.

3.3. Quy trình chèn gen KOD vào vector biểu hiện

Quy trình chèn gen KOD vào vector biểu hiện bao gồm các bước: cắt enzyme giới hạn vector và gen KOD, nối gen KOD vào vector bằng enzyme ligase, biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli. Phản ứng cắt enzyme giới hạn cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tạo ra các đầu dính tương thích. Phản ứng nối cần được tối ưu hóa để tăng hiệu quả tạo plasmid tái tổ hợp. Biến nạp hiệu quả plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. coli. Sau biến nạp, cần chọn lọc các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng kháng sinh.

IV. Tinh Sạch KOD DNA Polymerase Bằng Sắc Ký Ái Lực

Tinh sạch KOD DNA polymerase là bước quan trọng để thu được enzyme có độ tinh khiết cao. Sắc ký ái lực Nickel và GST là hai phương pháp hiệu quả được sử dụng. Quy trình này bao gồm gắn protein vào cột sắc ký, rửa loại tạp chất, và giải phóng protein. Các bước rửa loại tạp chất và giải phóng protein cần được tối ưu hóa. Hình 9 mô tả các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực. Phương pháp sắc ký ái lực Nickel, Hình 10 thể hiện cơ chế tinh sạch của phương pháp này. Đối với GST, Hình 11 mô tả cơ chế sắc ký.

4.1. Tinh sạch KOD His bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel

Phương pháp sắc ký ái lực Nickel dựa trên ái lực giữa đuôi 6xHis gắn vào protein KOD và ion Nickel gắn trên cột sắc ký. Protein KOD-His sẽ gắn vào cột, trong khi các tạp chất khác sẽ bị rửa trôi. Sau đó, protein KOD-His được giải phóng khỏi cột bằng imidazole. Nồng độ imidazole cần được tối ưu hóa để đảm bảo giải phóng protein hiệu quả mà không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.

4.2. Tinh sạch KOD GST bằng phương pháp sắc ký ái lực GST

Phương pháp sắc ký ái lực GST dựa trên ái lực giữa đuôi GST gắn vào protein KOD và glutathione gắn trên cột sắc ký. Protein KOD-GST sẽ gắn vào cột, trong khi các tạp chất khác sẽ bị rửa trôi. Sau đó, protein KOD-GST được giải phóng khỏi cột bằng glutathione. Nồng độ glutathione cần được tối ưu hóa để đảm bảo giải phóng protein hiệu quả mà không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.

4.3. Đánh giá độ tinh khiết và hoạt tính sau tinh sạch

Sau khi tinh sạch, cần đánh giá độ tinh khiết của protein bằng điện di SDS-PAGE. Hoạt tính của enzyme KOD cần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR. Các bước thử hoạt tính cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác. Độ tinh khiết và hoạt tính enzyme là hai yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu quả của quy trình tinh sạch.

V. Đánh Giá Hoạt Tính Của Protein KOD DNA Polymerase Tái Tổ Hợp

Việc đánh giá hoạt tính enzyme KOD là bước quan trọng để xác định khả năng khuếch đại DNA của enzyme. Kỹ thuật PCR được sử dụng để đánh giá hoạt tính enzyme bằng cách khuếch đại một đoạn DNA đích. Kết quả PCR cho phép xác định xem enzyme KOD có hoạt động hiệu quả hay không. Hiệu quả khuếch đại DNA là tiêu chí quan trọng. Hình 26 và 27 thể hiện kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme.

5.1. Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định hoạt tính KOD His

Kỹ thuật PCR được sử dụng để đánh giá khả năng khuếch đại DNA của enzyme KOD-His. Một đoạn DNA đích được khuếch đại bằng enzyme KOD-His và các thành phần PCR khác. Kết quả PCR được phân tích bằng điện di để xác định xem đoạn DNA đích có được khuếch đại hiệu quả hay không. Hiệu quả khuếch đại DNA là thước đo hoạt tính của enzyme.

5.2. So sánh hoạt tính của KOD His và KOD GST

Hoạt tính của enzyme KOD-His và KOD-GST được so sánh bằng kỹ thuật PCR. Hai enzyme được sử dụng để khuếch đại cùng một đoạn DNA đích. Kết quả PCR được phân tích để xác định xem enzyme nào có khả năng khuếch đại DNA hiệu quả hơn. So sánh hoạt tính giúp xác định enzyme nào phù hợp hơn cho các ứng dụng PCR khác nhau.

5.3. Ảnh hưởng của kích thước gen và đệm PCR đến hoạt tính

Kích thước gen và đệm PCR có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme KOD. Hoạt tính của enzyme được đánh giá bằng kỹ thuật PCR với các kích thước gen và đệm PCR khác nhau. Kết quả PCR cho phép xác định xem kích thước gen và đệm PCR nào phù hợp nhất cho hoạt động của enzyme. Hình 28 thể hiện kết quả PCR thử hoạt tính enzyme với các kích thước gen và đệm PCR khác nhau.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu KOD Polymerase

Nghiên cứu về KOD DNA polymerase tái tổ hợp đã đạt được những kết quả đáng khích lệ trong việc nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch enzyme. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hoạt tính enzyme trong các ứng dụng PCR khác nhau. Việc phát triển quy trình sản xuất KOD DNA polymerase tái tổ hợp tại Việt Nam sẽ góp phần chủ động nguồn enzyme phục vụ nghiên cứu và ứng dụng trong nước. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, chia sẻ và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn!

6.1. Tóm tắt kết quả đạt được và hạn chế còn tồn tại

Nghiên cứu đã thành công trong việc nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch KOD DNA polymerase tái tổ hợp trong E. coli. Tuy nhiên, năng suất biểu hiện và độ tinh khiết của enzyme vẫn cần được cải thiện. Các điều kiện PCR cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất và độ chính xác cao. Việc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme cũng rất quan trọng.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo về KOD polymerase

Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào tối ưu hóa quy trình biểu hiện và tinh sạch enzyme để tăng năng suất và độ tinh khiết. Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của enzyme để phát triển các enzyme đột biến có hoạt tính cao hơn. Ngoài ra, cần đánh giá hoạt tính enzyme trong các ứng dụng PCR khác nhau để mở rộng phạm vi ứng dụng.