Nghiên Cứu Nhân Dòng, Biểu Hiện, Tinh Sạch Và Xác Định Hoạt Tính Của Protein Pwo DNA Polymerase Tái Tổ Hợp Ở E. Coli

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Huyền
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thọ Sơn
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Protein Pwo DNA Polymerase Tái Tổ Hợp Ở E. Coli
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái quát DNA polymerase
• 1.2. Phân loại DNA polymerase
• 1.3. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase
• 1.4. Quá trình sao chép DNA
• 1.5. Ứng dụng của DNA polymerase
• 1.6. Kỹ thuật giải trình tự
• 1.7. Kỹ thuật PCR
• 1.8. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase
• 1.9. Phân loại nguồn gốc
• 1.10. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp
• 1.11. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR
• 1.12. Công nghệ protein tái tổ hợp
• 1.13. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon
• 1.14. Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn
• 1.15. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 1.16. Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu
• 2.3. Dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Hóa chất và môi trường
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase
• 2.7. Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase
• 2.8. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở E.
• 2.9. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase
• 2.10. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp
• 3.2. Nhân dòng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase
• 3.3. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo
• 3.4. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E.
• 3.5. Tách plasmid, kiểm tra trình tự
• 3.6. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E.
• 3.7. Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase
• 3.8. Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel
• 3.9. Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate
• 3.10. Xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase
• 3.11. Tối ưu thành phần buffer PCR
• 3.12. Hoạt tính sao chép
• 3.13. Khả năng chịu nhiệt độ cao
• 3.14. Hoạt tính khi có mặt chất ức chế
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Protein Pwo DNA Polymerase Tái Tổ Hợp

Enzyme DNA polymerase đóng vai trò then chốt trong sao chép và sửa chữa DNA, không chỉ trong tế bào sống mà còn trong nhiều ứng dụng in vitro. DNA polymerase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ nghiên cứu gen và hệ gen, chẩn đoán bệnh di truyền, đến nông nghiệp và khoa học hình sự. Mặc dù tầm quan trọng lớn, việc sản xuất enzyme DNA polymerase chất lượng cao ở Việt Nam còn gặp nhiều thách thức, dẫn đến sự phụ thuộc vào nhập khẩu. Nguồn enzyme nhập khẩu thường đi kèm với các vấn đề như thời gian vận chuyển kéo dài, ảnh hưởng đến chất lượng do điều kiện bảo quản, và chi phí cao. Do đó, việc phát triển quy trình sản xuất DNA polymerase trong nước, đặc biệt là các enzyme thế hệ mới như Pwo DNA Polymerase, là vô cùng cần thiết. Việc này giúp chủ động nguồn nguyên liệu, giảm chi phí và thúc đẩy sự phát triển của các công ty công nghệ sinh học Việt Nam.

1.1. Vai trò của DNA polymerase trong sinh học phân tử

DNA polymerase là thành phần không thể thiếu trong quá trình sao chép và sửa chữa DNA. Enzyme này có khả năng tổng hợp chuỗi DNA mới dựa trên khuôn mẫu có sẵn, đảm bảo tính chính xác và toàn vẹn của thông tin di truyền. Ngoài ra, DNA polymerase còn được sử dụng trong nhiều kỹ thuật in vitro, chẳng hạn như PCR và giải trình tự DNA, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền học và các lĩnh vực liên quan. Sự đa dạng về cấu trúc và chức năng của các loại DNA polymerase cho phép chúng được ứng dụng trong nhiều quy trình khác nhau.

1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất DNA polymerase ở Việt Nam

Việc sản xuất enzyme DNA polymerase ở Việt Nam vẫn còn nhiều hạn chế về quy trình và đánh giá chất lượng. Hầu hết các nghiên cứu hiện tại tập trung vào tối ưu hóa quy trình cho các enzyme thế hệ cũ, có hoạt tính và độ bền kém. Điều này dẫn đến việc phải nhập khẩu các enzyme thế hệ mới, chất lượng cao, từ nước ngoài, gây ra nhiều khó khăn về chi phí, thời gian và chất lượng. Việc xây dựng quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase chất lượng cao trong nước là một nhu cầu cấp thiết, giúp chủ động nguồn cung và giảm giá thành sản phẩm.

II. Thách Thức Khi Biểu Hiện Pwo DNA Polymerase Tái Tổ Hợp

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc sản xuất Pwo DNA Polymerase tái tổ hợp không phải là không có thách thức. Một trong những vấn đề chính là tối ưu hóa biểu hiện protein trong E. coli để đảm bảo năng suất cao. Pwo DNA Polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn cổ Pyrococcus woesei, có thể có mã di truyền khác biệt so với E. coli, dẫn đến hiệu quả dịch mã thấp. Ngoài ra, Pwo DNA Polymerase có thể hình thành các thể vùi, gây khó khăn cho quá trình tinh sạch. Cuối cùng, việc duy trì hoạt tính của enzyme trong quá trình sản xuất và bảo quản cũng là một thách thức cần được giải quyết. Việc phát triển các phương pháp hiệu quả để vượt qua những thách thức này là rất quan trọng để sản xuất Pwo DNA Polymerase tái tổ hợp chất lượng cao.

2.1. Tối ưu hóa biểu hiện protein trong E. coli

Việc tối ưu hóa biểu hiện protein trong E. coli đòi hỏi phải điều chỉnh nhiều yếu tố, bao gồm lựa chọn vector biểu hiện phù hợp, tối ưu hóa mã codon, và điều chỉnh điều kiện nuôi cấy. Vector biểu hiện cần có hệ thống điều khiển biểu hiện mạnh mẽ và ổn định. Tối ưu hóa mã codon giúp cải thiện hiệu quả dịch mã và giảm thiểu hình thành thể vùi. Điều kiện nuôi cấy, chẳng hạn như nhiệt độ và môi trường, cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến năng suất và chất lượng protein.

2.2. Ngăn ngừa sự hình thành thể vùi và tinh sạch protein hiệu quả

Sự hình thành thể vùi là một vấn đề phổ biến khi biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Các phương pháp như giảm nhiệt độ nuôi cấy, sử dụng chất phụ gia, hoặc sử dụng hệ thống biểu hiện có chaperon có thể giúp giảm thiểu sự hình thành thể vùi. Sau khi tế bào bị phá vỡ, các protein phải được tinh sạch, thường đòi hỏi phải biến tính và phục hồi hoạt tính của protein. Các kỹ thuật sắc ký như sắc ký ái lực nickel, sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel có thể được sử dụng để tinh sạch protein với độ tinh khiết cao.

III. Phương Pháp Nhân Dòng Gen Mã Hóa Pwo DNA Polymerase

Để sản xuất Pwo DNA Polymerase tái tổ hợp, bước đầu tiên là nhân dòng gen mã hóa enzyme này vào vector biểu hiện. Quá trình nhân dòng bao gồm thiết kế mồi PCR, khuếch đại gen mục tiêu, cắt enzyme giới hạn, gắn gen vào vector, và biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli. Việc thiết kế mồi PCR cần đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả khuếch đại cao. Sử dụng enzyme giới hạn phù hợp để cắt gen và vector giúp tạo ra các đầu dính tương thích, tăng hiệu quả gắn. Cuối cùng, biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli và chọn lọc các dòng mang gen mong muốn.

3.1. Thiết kế mồi PCR và khuếch đại gen Pwo DNA Polymerase

Mồi PCR cần được thiết kế sao cho có nhiệt độ nóng chảy (Tm) phù hợp, độ dài từ 18-25 bp và tránh các cấu trúc tự bắt cặp hoặc dimer mồi. PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại gen được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử. Phản ứng PCR đòi hỏi DNA polymerase chịu nhiệt tốt, có khả năng chịu nhiệt và thực hiện phản ứng lặp đi lặp lại trong điều kiện khắc nghiệt.

3.2. Cắt enzyme giới hạn và gắn gen vào vector

Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt cả gen mục tiêu và vector biểu hiện tại các vị trí cụ thể. Lựa chọn enzyme giới hạn cần đảm bảo rằng chúng không cắt bên trong gen mục tiêu và tạo ra các đầu dính tương thích. Gắn gen vào vector được thực hiện bằng enzyme ligase, tạo liên kết phosphodiester giữa các đầu dính. Sử dụng T4 DNA ligase có thể tăng hiệu quả gắn.

3.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli

Biến nạp là quá trình đưa vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli. Có nhiều phương pháp biến nạp khác nhau, bao gồm biến nạp nhiệt và điện. Sau khi biến nạp, các tế bào E. coli được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để chọn lọc các dòng mang vector tái tổ hợp. Thường sử dụng kháng sinh để làm chất chọn lọc.

IV. Biểu Hiện Và Tinh Sạch Protein Pwo DNA Polymerase Tái Tổ Hợp

Sau khi nhân dòng thành công, bước tiếp theo là biểu hiện và tinh sạch Pwo DNA Polymerase tái tổ hợp. Quá trình biểu hiện bao gồm nuôi cấy E. coli mang vector tái tổ hợp và cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG. Sau khi biểu hiện, tế bào được thu hoạch và phá vỡ để giải phóng protein. Quá trình tinh sạch sử dụng các kỹ thuật sắc ký khác nhau để loại bỏ các tạp chất và thu được Pwo DNA Polymerase tái tổ hợp có độ tinh khiết cao.

4.1. Nuôi cấy E. coli và cảm ứng biểu hiện protein

Tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng. Khi đạt đến mật độ tế bào thích hợp, IPTG được thêm vào để cảm ứng biểu hiện protein. Nhiệt độ nuôi cấy và thời gian cảm ứng có thể được tối ưu hóa để đạt năng suất protein cao nhất.

4.2. Phá vỡ tế bào và thu hồi protein

Sau khi cảm ứng, tế bào E. coli được thu hoạch bằng ly tâm. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng các phương pháp cơ học hoặc hóa học để giải phóng protein. Các phương pháp phá vỡ tế bào bao gồm siêu âm, nghiền, hoặc sử dụng enzyme lysozyme.

4.3. Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp

Việc tinh sạch protein tái tổ hợp có thể sử dụng nhiều kỹ thuật sắc ký. Sắc ký ái lực thường được sử dụng để tinh sạch protein có gắn đuôi His-tag. Các kỹ thuật khác như sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel có thể được sử dụng để loại bỏ các tạp chất còn lại.

V. Xác Định Hoạt Tính Của Protein Pwo DNA Polymerase

Để đảm bảo chất lượng của Pwo DNA Polymerase tái tổ hợp, cần xác định hoạt tính của enzyme sau khi tinh sạch. Xác định hoạt tính bao gồm đo khả năng sao chép DNA của enzyme bằng các phương pháp PCR hoặc kéo dài mồi. Hoạt tính được đo bằng đơn vị enzyme, thường là lượng DNA được sao chép trong một khoảng thời gian nhất định. Ngoài ra, cần xác định độ bền nhiệt và khả năng chịu chất ức chế của enzyme.

5.1. Đo khả năng sao chép DNA bằng PCR

Phản ứng PCR được sử dụng để đo khả năng sao chép DNA của enzyme. Sử dụng các mồi đặc hiệu và khuôn DNA, enzyme được cho phản ứng và sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di gel. Lượng sản phẩm PCR tạo ra tỉ lệ thuận với hoạt tính của enzyme.

5.2. Xác định độ bền nhiệt và khả năng chịu chất ức chế

Độ bền nhiệt của enzyme được xác định bằng cách ủ enzyme ở các nhiệt độ khác nhau và đo hoạt tính sau khi ủ. Khả năng chịu chất ức chế được xác định bằng cách thêm các chất ức chế vào phản ứng và đo hoạt tính. Thông thường dùng EDTA để ức chế.

VI. Ứng Dụng Của Nghiên Cứu Protein Pwo DNA Polymerase

Nghiên cứu về protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp không chỉ mang lại kiến thức cơ bản về enzyme này mà còn mở ra nhiều ứng dụng thực tiễn. Pwo DNA Polymerase có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit PCR chất lượng cao, phục vụ cho các nghiên cứu di truyền học, y học và nông nghiệp. Ngoài ra, enzyme này có thể được cải tiến để tạo ra các enzyme có hoạt tính và độ bền cao hơn, mở rộng phạm vi ứng dụng trong các lĩnh vực công nghệ sinh học khác.

6.1. Phát triển các bộ kit PCR chất lượng cao

Pwo DNA Polymerase có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit PCR chất lượng cao, có độ chính xác và hiệu quả khuếch đại cao. Các bộ kit này có thể được sử dụng trong các nghiên cứu di truyền học, y học và nông nghiệp.

6.2. Cải tiến enzyme để mở rộng phạm vi ứng dụng

Enzyme Pwo DNA Polymerase có thể được cải tiến bằng các phương pháp kỹ thuật di truyền để tạo ra các enzyme có hoạt tính và độ bền cao hơn. Các enzyme cải tiến này có thể được sử dụng trong các lĩnh vực công nghệ sinh học khác, chẳng hạn như giải trình tự DNA và chẩn đoán phân tử.

Tổng quan nghiên cứu

Enzyme DNA polymerase đóng vai trò trung tâm trong quá trình sao chép và sửa chữa DNA, đồng thời là công cụ không thể thiếu trong các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và giải trình tự gen. Tại Việt Nam, việc tự sản xuất enzyme DNA polymerase thế hệ mới vẫn còn nhiều hạn chế, dẫn đến phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu với chi phí cao và thời gian cung ứng kéo dài. Pwo DNA polymerase, một enzyme bền nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ Pyrococcus woesei, nổi bật với khả năng hoạt động ổn định ở nhiệt độ cao và độ chính xác sao chép cao, phù hợp cho các ứng dụng PCR với các đoạn DNA dưới 3 kb. Nghiên cứu này nhằm thiết kế, nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli, góp phần chủ động nguồn enzyme chất lượng cao trong nước, giảm chi phí và thời gian cung cấp cho các công ty công nghệ sinh học Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong năm 2019, với mục tiêu tối ưu hóa mã bộ ba gen Pwo-pol, xây dựng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo, biểu hiện protein ở E. coli BL21 (DE3), tinh sạch protein và đánh giá hoạt tính enzyme trong các điều kiện phản ứng PCR tiêu chuẩn. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase nội địa, hỗ trợ phát triển khoa học công nghệ sinh học và ứng dụng trong y học, nông nghiệp, pháp y và nghiên cứu gen.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Phân loại và cấu trúc DNA polymerase: DNA polymerase được phân thành 7 họ chính (A, B, C, D, X, Y, RT) dựa trên trình tự amino acid và chức năng. Pwo DNA polymerase thuộc họ B, có khả năng đọc sửa exonuclease 3’–5’, giúp tăng độ chính xác sao chép DNA.
• Cấu trúc enzyme dạng bàn tay phải: gồm các miền “thumb”, “palm”, “fingers” chịu trách nhiệm xúc tác, gắn DNA và tương tác với nucleotide. Pwo-pol có thêm vùng exonuclease giúp proofreading.
• Cơ chế sao chép DNA và phức hệ replisome: enzyme DNA polymerase phối hợp với các protein khác trong phức hệ sao chép DNA, đặc biệt ở vi khuẩn Cổ như Pyrococcus woesei.
• Ứng dụng enzyme trong PCR và giải trình tự: enzyme bền nhiệt như Pwo-pol được sử dụng trong PCR để khuếch đại DNA với độ chính xác cao, chịu nhiệt tốt và khả năng hoạt động trong môi trường có chất ức chế.
• Công nghệ protein tái tổ hợp: tổng hợp gen tối ưu mã codon, nhân dòng gen vào vector pEtM, biểu hiện protein ở E. coli BL21 (DE3), tinh sạch bằng sắc ký ái lực nickel và kết tủa ammonium sulfate.

Các khái niệm chính bao gồm: codon adaptation index (CAI), hoạt tính enzyme, processivity, fidelity, phương pháp tinh sạch protein, và buffer PCR tối ưu.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Gen mã hóa Pwo DNA polymerase được tổng hợp hóa học, tối ưu mã codon phù hợp với E. coli sử dụng phần mềm GenSmart Codon Optimization (CAI đạt 0.94, tăng từ 0.38 ban đầu).
• Phương pháp nhân dòng và tạo vector tái tổ hợp: PCR nhân gen Pwo-pol, cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và EcoRI, nối vào vector pEtM, biến nạp vào E. coli BL21 (DE3).
• Biểu hiện protein: nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường LB, cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0.3 mM, tối ưu nhiệt độ 37oC trong 16 giờ.
• Tinh sạch protein: sử dụng phương pháp sắc ký ái lực nickel (Ni-NTA agarose) kết hợp xử lý nhiệt (70oC và 95oC) để loại bỏ protein tạp, đồng thời thử nghiệm kết tủa ammonium sulfate.
• Xác định hoạt tính enzyme: phản ứng PCR in vitro với các đoạn gen AcrH (~400 bp) và KOD (~2 kb), đánh giá khả năng chịu nhiệt, tốc độ kéo dài chuỗi, và hoạt động trong môi trường có chất ức chế.
• Timeline nghiên cứu: tổng thể thực hiện trong năm 2019 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN.

Cỡ mẫu: nhiều lần nhân dòng và biểu hiện protein, chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp, đánh giá hoạt tính enzyme trên mẫu protein tinh sạch.

Phương pháp chọn mẫu: chọn lọc khuẩn lạc dựa trên PCR kiểm tra chèn gen, lựa chọn mẫu biểu hiện protein có băng SDS-PAGE rõ ràng.

Phương pháp phân tích: điện di gel agarose và SDS-PAGE, giải trình tự Sanger, đánh giá hoạt tính PCR, so sánh với enzyme thương mại.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu hóa gen Pwo-pol: Gen mã hóa 775 acid amin được tối ưu sử dụng 28 codon thay vì 57 ban đầu, CAI tăng từ 0.38 lên 0.94, tỉ lệ GC tăng từ 39% lên 48%, loại bỏ 7 codon hiếm, giúp tăng hiệu quả biểu hiện ở E. coli.

2. Nhân dòng và tạo vector tái tổ hợp thành công: PCR nhân gen thu được băng 2344 bp đúng kích thước lý thuyết; plasmid pEtM-Pwo có kích thước ~8 kb; biến nạp vào E. coli BL21 (DE3) tạo ra nhiều khuẩn lạc trên đĩa chọn lọc; PCR kiểm tra cho thấy 2/3 khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp đúng kích thước 2599 bp.

3. Biểu hiện protein Pwo-pol hiệu quả: Protein biểu hiện rõ ràng trên gel SDS-PAGE với kích thước ~92 kDa, mức độ biểu hiện cao nhất ở 37oC với IPTG 0.3 mM, so với nhiệt độ phòng biểu hiện tăng khoảng 20-30%.

4. Tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực nickel kết hợp xử lý nhiệt: Xử lý tế bào ở 70oC trong 1 giờ hoặc 95oC trong 30 phút giúp loại bỏ phần lớn protein tạp của E. coli; bước rửa cột với imidazole tăng dần (30 mM đến 100 mM) làm giảm protein tạp nhưng cũng làm mất một phần protein tái tổ hợp; phương pháp kết tủa ammonium sulfate được thử nghiệm nhưng hiệu quả thấp hơn.

5. Xác định hoạt tính enzyme: Protein Pwo-pol tinh sạch có khả năng khuếch đại đoạn gen AcrH (~400 bp) và KOD (~2 kb) trong phản ứng PCR; enzyme duy trì hoạt tính sau bước biến tính 98oC/5 phút; hoạt động tốt trong môi trường có chất ức chế như phenol, EDTA; buffer PCR tối ưu với pH 7.8, MgSO4 20 mM, KCl 250 mM, (NH4)2SO4 100 mM, Triton X 1%, BSA 1 mg/ml.

Thảo luận kết quả

Việc tối ưu hóa mã codon giúp tăng hiệu quả biểu hiện protein Pwo-pol ở E. coli, phù hợp với các nghiên cứu trước cho thấy CAI cao và loại bỏ codon hiếm là yếu tố quan trọng để tăng năng suất protein tái tổ hợp. Kết quả nhân dòng và biến nạp plasmid cho thấy quy trình kỹ thuật chuẩn xác, đảm bảo gen được chèn đúng khung đọc mở, không có đột biến thay thế.

Biểu hiện protein ở 37oC với IPTG 0.3 mM là điều kiện tối ưu, phù hợp với đặc tính sinh trưởng và biểu hiện protein của E. coli BL21 (DE3). Việc xử lý tế bào bằng nhiệt độ cao giúp loại bỏ protein không bền nhiệt của E. coli, tận dụng đặc tính bền nhiệt của Pwo-pol, tương tự các nghiên cứu enzyme DNA polymerase bền nhiệt khác.

Tinh sạch sắc ký ái lực nickel là phương pháp hiệu quả để thu nhận protein có đuôi His-tag, tuy nhiên cần cân bằng giữa nồng độ imidazole để loại bỏ protein tạp mà không làm mất protein mục tiêu. Phương pháp kết tủa ammonium sulfate ít hiệu quả hơn do đặc tính hòa tan của protein Pwo-pol.

Hoạt tính enzyme được xác nhận qua các phản ứng PCR với các đoạn gen mẫu, enzyme duy trì hoạt tính sau bước biến tính cao, chứng tỏ tính bền nhiệt và độ chính xác cao trong sao chép DNA. Buffer PCR tối ưu giúp tăng hiệu quả phản ứng, phù hợp với các enzyme DNA polymerase bền nhiệt khác.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ SDS-PAGE thể hiện mức độ tinh sạch protein, biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme dưới các điều kiện khác nhau, bảng so sánh các thông số kỹ thuật của enzyme tái tổ hợp với enzyme thương mại.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình sản xuất enzyme Pwo DNA polymerase quy mô phòng thí nghiệm: Áp dụng quy trình tối ưu hóa gen, biểu hiện và tinh sạch đã xây dựng để sản xuất enzyme chất lượng cao, ổn định, phục vụ nghiên cứu và ứng dụng trong nước. Thời gian thực hiện 6-12 tháng, chủ thể: các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

2. Tối ưu hóa quy trình tinh sạch protein: Nghiên cứu thêm các bước xử lý nhiệt kết hợp sắc ký ái lực với các phương pháp tinh sạch bổ sung như lọc gel hoặc sắc ký trao đổi ion để nâng cao độ tinh khiết và thu hồi enzyme. Thời gian 3-6 tháng, chủ thể: nhóm nghiên cứu protein.

3. Xây dựng bộ kit PCR nội địa sử dụng enzyme Pwo-pol: Phát triển bộ kit PCR với enzyme Pwo-pol sản xuất trong nước, giảm chi phí và thời gian cung cấp cho các phòng thí nghiệm, bệnh viện, công ty công nghệ sinh học. Thời gian 12 tháng, chủ thể: doanh nghiệp công nghệ sinh học.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp cho các nhà khoa học, kỹ thuật viên tại các viện nghiên cứu và trường đại học nhằm nâng cao năng lực sản xuất enzyme nội địa. Thời gian liên tục, chủ thể: trường đại học, viện nghiên cứu.

5. Nghiên cứu cải tiến enzyme Pwo-pol: Tiến hành đột biến có định hướng để nâng cao tốc độ kéo dài chuỗi, độ bền nhiệt và khả năng chịu chất ức chế nhằm mở rộng ứng dụng enzyme trong các kỹ thuật PCR đặc biệt. Thời gian 12-18 tháng, chủ thể: nhóm nghiên cứu enzyme.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cung cấp quy trình chi tiết về thiết kế gen, biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng thực nghiệm.

2. Các phòng thí nghiệm sản xuất enzyme và kit sinh học: Tham khảo để phát triển quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase nội địa, giảm chi phí nhập khẩu, tăng tính chủ động nguồn nguyên liệu.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học trong nước: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm enzyme PCR chất lượng cao, phục vụ thị trường trong nước và xuất khẩu.

4. Các cơ sở đào tạo và chuyển giao công nghệ: Sử dụng luận văn làm tài liệu giảng dạy, đào tạo kỹ thuật biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp, nâng cao năng lực công nghệ sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Pwo DNA polymerase có ưu điểm gì so với các enzyme DNA polymerase khác?
   Pwo-pol có khả năng bền nhiệt cao với thời gian half-life lên đến 2 giờ ở 100oC, độ chính xác sao chép cao nhờ hoạt động exonuclease 3’–5’, phù hợp cho PCR các đoạn DNA dưới 3 kb, vượt trội hơn enzyme Taq-pol về độ sai sót và độ bền.

2. Tại sao cần tối ưu mã codon khi biểu hiện protein tái tổ hợp?
   Tối ưu mã codon giúp tăng hiệu quả dịch mã trong vật chủ, giảm codon hiếm gây gián đoạn dịch mã, tăng năng suất protein và giảm độc tính cho tế bào biểu hiện, như nghiên cứu đã nâng CAI từ 0.38 lên 0.94.

3. Phương pháp tinh sạch nào hiệu quả nhất cho protein Pwo-pol?
   Tinh sạch sắc ký ái lực nickel kết hợp xử lý nhiệt (70-95oC) là phương pháp hiệu quả nhất, giúp loại bỏ protein tạp của E. coli và thu được protein tái tổ hợp có độ tinh sạch cao, trong khi kết tủa ammonium sulfate ít hiệu quả hơn.

4. Làm thế nào để xác định hoạt tính của protein Pwo-pol tái tổ hợp?
   Hoạt tính được xác định qua phản ứng PCR in vitro sử dụng các đoạn gen mẫu (AcrH ~400 bp, KOD ~2 kb), đánh giá khả năng khuếch đại DNA, khả năng chịu nhiệt độ cao và hoạt động trong môi trường có chất ức chế.

5. Ứng dụng thực tiễn của enzyme Pwo-pol sản xuất trong nước là gì?
   Enzyme Pwo-pol có thể được sử dụng trong các kỹ thuật PCR, giải trình tự gen, chẩn đoán y học, nghiên cứu gen và phát triển kit sinh học, giúp giảm chi phí nhập khẩu, tăng tốc độ cung cấp và nâng cao năng lực công nghệ sinh học trong nước.

Kết luận

• Đã thiết kế và tối ưu hóa gen mã hóa Pwo DNA polymerase phù hợp với vật chủ E. coli, nâng cao hiệu quả biểu hiện protein.
• Thành công trong việc nhân dòng, tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo và biểu hiện protein Pwo-pol với điều kiện IPTG 0.3 mM, 37oC.
• Phát triển quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực nickel kết hợp xử lý nhiệt, thu được protein có độ tinh sạch cao và hoạt tính ổn định.
• Xác định hoạt tính enzyme qua các phản ứng PCR in vitro, chứng minh enzyme bền nhiệt, chính xác và hoạt động tốt trong môi trường có chất ức chế.
• Đề xuất các giải pháp phát triển quy trình sản xuất enzyme nội địa, xây dựng bộ kit PCR và đào tạo chuyển giao công nghệ nhằm thúc đẩy ngành công nghệ sinh học Việt Nam.

Hành động tiếp theo: Triển khai quy trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm, tối ưu hóa tinh sạch, phát triển sản phẩm kit PCR nội địa và đào tạo nhân lực kỹ thuật. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học được khuyến khích hợp tác để ứng dụng kết quả nghiên cứu này.