Khảo Sát Đặc Tính Enzyme Protease Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

Chuyên khảo phân tích Thu nhận và khảo sát một số đặc tính của enzym protease từ vi khuẩn bacillus subtilis, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Tác giả: Phan Trương Hương Thảo
• Người hướng dẫn: PGS-TS Đoàn Thị Thanh Thu
• Trường học: Trường Đại Học Mở – Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Đặc Tính Enzyme Protease Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2005
• Địa điểm: TP HCM

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN
• 2.1. Khái quát chung về enzyme
• 2.1.1. Sơ lược về lịch sử enzyme
• 2.1.2. Tính chất ưu việt của enzyme
• 2.1.3. Tính chất lý hóa chung của enzyme
• 2.1.4. Cấu tạo enzyme
• 2.1.5. Trung tâm hoạt động của enzyme
• 2.1.6. Tính chất đặc hiệu xúc tác của enzyme
• 2.1.7. Cường lực xúc tác và cơ chất tác dụng của enzyme
• 2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác
• 2.2. Đại cương về enzyme protease
• 2.2.1. Phân loại protease
• 2.2.2. Protease kim loại
• 2.2.3. Đặc điểm protease và cơ chế tác dụng
• 2.2.4. Nguồn thu protease
• 2.2.5. Tách và tinh chế enzyme protease
• 2.2.6. Ứng dụng của protease vi sinh vật
• 2.2.6.1. Trong công nghiệp thực phẩm
• 2.2.6.2. Trong công nghiệp nhẹ
• 2.2.6.3. Trong nông nghiệp
• 2.2.6.4. Trong công nghiệp dược và y học
• 2.3. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
• 2.3.1. Đặc điểm phân loại
• 2.3.2. Đặc điểm hình thái
• 2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 2.3.4. Đặc điểm sinh hóa
• 2.3.5. Điều kiện phát triển
• 3. PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên liệu dùng để tách chiết enzyme protease
• 3.2. Nguyên liệu dùng để thuỷ phân
• 3.3. Phương pháp tiến hành
• 3.3.1. Phương pháp tách chiết enzyme protease từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis
• 3.3.2. Phương pháp thu nhận CPE từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis với tác nhân tủa là cồn 960
• 3.3.3. Phương pháp thu nhận CPE từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis với tác nhân tủa là aceton
• 3.3.4. Phương pháp thu nhận CPE từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis với tác nhân tủa là muối amoni sulfat
• 3.3.5. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến
• 3.3.6. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
• 3.3.7. Xác định Nitơ-formol theo phương pháp Sorensen
• 3.3.8. Khảo sát quá trình thuỷ phân các cơ chất khác nhau bởi CPE protease
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ – BIỂN LUẬN
• 4.1. Khảo sát hiệu suất thu nhận CPE protease từ CT vi khuẩn Bac. Khảo sát hoạt độ protease
• 4.1.1. Đường chuẩn tyrosin
• 4.1.2. Khảo sát hoạt độ protease trong CT vi khuẩn Bac.
• 4.1.3. Khảo sát hoạt độ protease của CPE tủa bằng cồn 960
• 4.1.4. Khảo sát hoạt độ protease của CPE tủa bằng aceton
• 4.1.5. Khảo sát hoạt độ protease của CPE tủa bằng amoni sulfat
• 4.1.6. So sánh hoạt độ của các chế phẩm protease tủa bằng các tác nhân khác nhau. Khảo sát hàm lượng protein
• 4.2. Đường chuẩn albumin
• 4.3. Khảo sát hàm lượng protein trong CT vi khuẩn Bac.
• 4.4. Khảo sát hàm lượng protein của các CPE tủa bằng cồn 960
• 4.5. Khảo sát hàm lượng protein của các CPE tủa bằng aceton
• 4.6. Khảo sát hàm lượng protein của các CPE tủa bằng amoni sulfat
• 4.7. So sánh hàm lượng protein của các loại CPE protease với tác nhân tủa khác nhau. Hoạt độ riêng của CPE protease
• 4.8. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của các CPE protease vào nhiệt độ
• 4.8.1. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng cồn) theo nhiệt độ
• 4.8.2. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng aceton) theo nhiệt độ
• 4.8.3. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng amoni sulfat) theo nhiệt độ
• 4.8.4. Khảo sát sự biến đổi hoạt độ của CPE protease từ Bac.subtilis theo pH
• 4.9. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid của CPE protease
• 4.9.1. Khảo sát quá trình thuỷ phân albumin
• 4.9.2. Khảo sát quá trình thuỷ phân casein
• 4.9.3. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid hạt đậu nành
• 4.9.4. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid nấm rơm
• 4.9.5. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid thớt heo nái
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
• 5.1. Đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Enzyme Protease Từ Bacillus Subtilis 55

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống đều do enzyme protease xúc tác. Enzyme protease là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng sinh hóa, chiếm đến 80% - 90% thành phần protein trong tế bào sinh vật. Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme protease được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chúng không những có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống gọi là “invivo”, mà sau khi tách khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “invitro”. Cơ thể thiếu enzyme protease thì mọi quá trình chuyển hóa bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản và phát triển bình thường được, sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại được. Hiện nay, người ta đã khám phá được hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể. Enzyme protease ngày nay được ứng dụng ngày càng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm: bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước chấm, nước mắm…

1.1. Lịch Sử Phát Triển Khám Phá Enzyme Protease

Năm 1883 Payen và Persoz đã phân lập được chất có trong lúa nảy mầm có khả năng phá vỡ cấu trúc tinh bột tạo thành đường và đã đặt tên là diatase, hiện nay được gọi là Amylase. Năm 1867 Wijhelm Kuhne là một nhà vật lý học người Đức lần đầu tiên đề nghị đặt tên “enzyme” thay thế cho từ “ferment”, enzyme có nghĩa là “in yeast” trong tiếng Hy Lạp. Năm 1897 Edward Buchner-nhà hóa học người Đức-đã khám phá ra những tế bào tự do của cao nấm men có khả năng lên men rượu. Năm 1906 Otto Rohm là người đầu tiên nghiên cứu về việc sử dụng sản phẩm enzyme protease vào công nghiệp. Summer-nhà sinh hóa học của Mỹ-đã thành công trong việc tách chiết và kết tinh urease dạng tinh thể từ cao một loại đậu có tên là Jack-bean. Northop-nhà sinh hóa học người Mỹ-đã thành công trong việc tách chiết và tạo ra tinh thể Pepsin và Trypsin.

1.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của Enzyme Protease So Với Khác

Enzyme protease có hoạt lực xúc tác rất cao gấp hàng trăm ngàn lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường do vậy chỉ cần dùng một lượng nhỏ enzyme protease có thể chuyển hóa một lượng cơ chất trong khoảng thời gian ngắn. Điều này rất cần thiết để rút ngắn thời gian sản xuất sản phẩm. Enzyme protease có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn liệu khác nhau như từ động vật (chimotrypsin, trypsin, renin, pepsin,…), từ thực vật (papain, bromelin, amilase, urease,…) và từ vi sinh vật (gần như đủ loại enzyme protease với hoạt tính cao). Do có nguồn gốc từ sinh vật, từ các loại thực phẩm rau quả thông dụng nên hầu hết enzyme protease không có tính chất độc hại.

1.3. Tính Chất Lý Hóa Chung Của Enzyme Protease

Bản chất hóa học của enzyme protease là protein nên enzyme protease có đầy đủ tính chất của một protein. Enzyme protease có khối lượng phân tử lớn, đa số enzyme protease có khối lượng phân tử trung bình từ 6.000 dalton do vậy enzyme protease không thể đi qua được màng bán thấm. Enzyme protease có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các dung dịch đệm, glycerin, khi hòa tan thì tạo thành dung dịch keo và enzyme protease không tan trong dung môi không phân cực. Enzyme protease cũng bị kết tủa bởi các tác nhân gây kết tủa protein. Các tác nhân vật lý và hóa học làm biến tính protein thì cũng làm biến tính enzyme protease vì vậy enzyme protease cũng bị mất hoạt tính.

II. Cách Phân Loại Enzyme Protease Cơ Chế Hoạt Động 58

Protease là một nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong protein, giải phóng các peptide và amino acid. Dựa vào vị trí tác động trên chuỗi peptide, protease được chia thành endopeptidase (cắt bên trong chuỗi) và exopeptidase (cắt từ đầu chuỗi). Dựa vào nhóm chức hoạt động, protease được phân loại thành serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metalloprotease. Cơ chế hoạt động của protease liên quan đến việc tấn công nucleophilic của một nhóm chức hoạt động (serine hydroxyl, cysteine thiol, hoặc aspartic carboxyl) vào carbonyl carbon của liên kết peptide, tạo ra một phức hợp trung gian tetraedric, sau đó bị phân hủy giải phóng các sản phẩm thủy phân. Enzyme protease đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, từ tiêu hóa protein đến điều hòa các con đường tín hiệu tế bào.

2.1. Phân Loại Enzyme Protease Theo Cơ Chế Tác Dụng

Protease có thể được phân loại dựa trên cơ chế xúc tác của chúng. Serine protease sử dụng một dư lượng serine hoạt động trong trung tâm xúc tác của chúng. Cysteine protease sử dụng một dư lượng cysteine hoạt động. Aspartic protease sử dụng hai dư lượng aspartic acid trong trung tâm xúc tác của chúng. Metalloprotease sử dụng một ion kim loại, thường là kẽm, để kích hoạt phân tử nước và tấn công liên kết peptide. Mỗi loại protease có vai trò và ứng dụng khác nhau trong các lĩnh vực khác nhau.

2.2. Nguồn Gốc Tự Nhiên Của Enzyme Protease

Nguồn thu protease rất đa dạng. Chúng có thể được tìm thấy trong động vật (ví dụ: trypsin và chymotrypsin từ tuyến tụy), thực vật (ví dụ: papain từ đu đủ và bromelain từ dứa), và vi sinh vật (ví dụ: Bacillus subtilis protease). Protease từ vi sinh vật thường được ưa chuộng trong công nghiệp do tính ổn định, hoạt tính cao và khả năng sản xuất hàng loạt. Bacillus subtilis là một nguồn quan trọng của protease kiềm, được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng tẩy rửa và thủy phân protein.

2.3. Tách Chiết và Tinh Chế Enzyme Protease Hiệu Quả

Quá trình tách chiết và tinh chế enzyme protease từ nguồn tự nhiên bao gồm nhiều bước. Các bước thường bao gồm phá vỡ tế bào (nếu cần), kết tủa protein (sử dụng muối amoni sulfat hoặc dung môi hữu cơ), sắc ký (ví dụ: sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực), và lọc. Mục tiêu là thu được enzyme protease có độ tinh khiết cao với hoạt tính mong muốn. Phương pháp tách chiết và tinh chế cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và bảo toàn hoạt tính của enzyme protease.

III. Hướng Dẫn Khảo Sát Hoạt Tính Protease Từ Bacillus 57

Việc khảo sát hoạt tính protease là rất quan trọng để xác định khả năng thủy phân protein của enzyme thu được từ Bacillus subtilis. Phương pháp Anson cải tiến là một trong những phương pháp phổ biến nhất. Phương pháp này dựa trên việc đo lượng tyrosine giải phóng trong quá trình thủy phân casein bởi protease. Ngoài ra, hàm lượng protein cũng cần được xác định bằng phương pháp Lowry để tính hoạt độ riêng của enzyme. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và thời gian ủ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo kết quả chính xác.

3.1. Phương Pháp Anson Cải Tiến Đo Hoạt Tính Protease

Phương pháp Anson cải tiến là một phương pháp kolorimetric được sử dụng rộng rãi để xác định hoạt tính protease. Trong phương pháp này, casein được sử dụng làm cơ chất và protease thủy phân casein giải phóng các peptide và amino acid, bao gồm tyrosine. Lượng tyrosine giải phóng được đo bằng cách phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu, tạo ra một màu xanh có thể đo được bằng quang phổ kế. Hoạt tính protease được biểu thị bằng đơn vị Anson (AU), định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 micromole tyrosine mỗi phút.

3.2. Xác Định Hàm Lượng Protein Bằng Phương Pháp Lowry

Phương pháp Lowry là một phương pháp kolorimetric khác được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong mẫu. Phương pháp này dựa trên phản ứng của protein với thuốc thử Folin-Ciocalteu, tạo ra một màu xanh có thể đo được bằng quang phổ kế. Phương pháp Lowry nhạy hơn phương pháp Biuret và được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng protein trong nhiều loại mẫu, bao gồm cả chế phẩm enzyme protease. Kết quả thu được từ phương pháp Lowry được sử dụng để tính hoạt độ riêng của enzyme.

3.3. Ảnh Hưởng Của pH Nhiệt Độ Đến Hoạt Tính Enzyme

Hoạt tính protease bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH và nhiệt độ. Mỗi enzyme có một pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu, tại đó nó hoạt động hiệu quả nhất. Việc khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính protease là rất quan trọng để xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme. Các thí nghiệm thường được thực hiện bằng cách ủ enzyme protease với cơ chất casein ở các pH và nhiệt độ khác nhau, sau đó đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến.

IV. Tối Ưu Hóa Sản Xuất Enzyme Protease Từ Bacillus 59

Để tối ưu hóa sản xuất enzyme protease từ Bacillus subtilis, cần xem xét nhiều yếu tố như thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc), và thời gian nuôi cấy. Việc bổ sung các nguồn carbon và nitrogen phù hợp vào môi trường nuôi cấy có thể làm tăng đáng kể sản lượng protease. Ngoài ra, việc sử dụng các phương pháp lên men tiên tiến như lên men bề mặt và lên men chìm cũng có thể cải thiện hiệu quả sản xuất enzyme.

4.1. Thành Phần Môi Trường Nuôi Cấy Tối Ưu Cho Bacillus Subtilis

Thành phần môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzyme protease từ Bacillus subtilis. Các nguồn carbon như glucose, sucrose, và tinh bột, và các nguồn nitrogen như casein, peptone, và bột đậu nành thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Việc tối ưu hóa tỷ lệ carbon/nitrogen (C/N) có thể làm tăng đáng kể sản lượng protease. Ngoài ra, việc bổ sung các ion kim loại như Mg2+ và Ca2+ cũng có thể cải thiện hoạt tính của enzyme.

4.2. Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Nuôi Cấy Đến Sản Lượng Protease

Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, tốc độ lắc, và thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sản lượng enzyme protease. Bacillus subtilis thường phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30-37°C và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Tốc độ lắc cần được tối ưu hóa để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho sự phát triển của vi khuẩn và sản xuất enzyme. Thời gian nuôi cấy thường kéo dài từ 24 đến 72 giờ, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy.

4.3. Các Phương Pháp Lên Men Tiên Tiến Để Tăng Sản Lượng

Các phương pháp lên men tiên tiến như lên men bề mặt (SSF) và lên men chìm (SmF) có thể được sử dụng để tăng sản lượng enzyme protease. SSF sử dụng chất nền rắn như cám gạo hoặc bã mía, trong khi SmF sử dụng môi trường lỏng. SmF thường được ưa chuộng trong công nghiệp do dễ kiểm soát các điều kiện nuôi cấy và có thể sản xuất enzyme với số lượng lớn. Tuy nhiên, SSF có thể là một lựa chọn kinh tế hơn cho các ứng dụng quy mô nhỏ.

V. Ứng Dụng Protease Từ Bacillus Subtilis Trong Thực Tế 60

Enzyme protease từ Bacillus subtilis có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử dụng để cải thiện chất lượng bánh mì, làm mềm thịt, và sản xuất nước mắm. Trong công nghiệp tẩy rửa, protease kiềm được sử dụng để loại bỏ vết bẩn protein trên quần áo. Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm và y học để sản xuất các loại thuốc và chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa.

5.1. Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Thực Phẩm Đa Dạng

Enzyme protease từ Bacillus subtilis được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Chúng có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng bột mì và bánh mì bằng cách thủy phân gluten, làm mềm thịt bằng cách phá vỡ các liên kết collagen, và sản xuất nước mắm bằng cách thủy phân protein cá. Protease cũng có thể được sử dụng để sản xuất phô mai và các sản phẩm sữa khác.

5.2. Vai Trò Quan Trọng Trong Công Nghiệp Tẩy Rửa

Protease kiềm từ Bacillus subtilis là một thành phần quan trọng trong nhiều loại bột giặt và nước giặt. Chúng có khả năng thủy phân các vết bẩn protein trên quần áo, như vết máu, sữa, và trứng. Protease giúp loại bỏ các vết bẩn cứng đầu và làm cho quần áo sạch hơn. Protease kiềm hoạt động hiệu quả ở pH cao, phù hợp với điều kiện giặt tẩy.

5.3. Ứng Dụng Tiềm Năng Trong Dược Phẩm Y Học

Enzyme protease có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp dược phẩm và y học. Chúng có thể được sử dụng để sản xuất các loại thuốc điều trị các bệnh liên quan đến tiêu hóa, như bệnh xơ nang và bệnh viêm tụy. Protease cũng có thể được sử dụng để làm tan cục máu đông và hỗ trợ quá trình phục hồi sau phẫu thuật. Ngoài ra, protease còn có tiềm năng trong điều trị ung thư.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Enzyme Protease 55

Nghiên cứu về enzyme protease từ Bacillus subtilis đã mang lại nhiều kết quả quan trọng và ứng dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức và cơ hội để tiếp tục nghiên cứu và phát triển. Các hướng nghiên cứu tiềm năng bao gồm cải thiện hiệu quả sản xuất enzyme, tối ưu hóa các điều kiện hoạt động của enzyme, và khám phá các ứng dụng mới của enzyme trong các lĩnh vực như năng lượng sinh học và xử lý chất thải.

6.1. Thách Thức Cơ Hội Nghiên Cứu Protease Bacillus Subtilis

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về enzyme protease từ Bacillus subtilis, vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Một trong những thách thức lớn nhất là cải thiện hiệu quả sản xuất enzyme để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Ngoài ra, cần phải nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzyme để tối ưu hóa các điều kiện hoạt động và mở rộng các ứng dụng của enzyme.

6.2. Các Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Trong Tương Lai

Các hướng nghiên cứu tiềm năng trong tương lai bao gồm phát triển các phương pháp lên men mới để tăng sản lượng enzyme, sử dụng kỹ thuật protein engineering để cải thiện tính ổn định và hoạt tính của enzyme, và khám phá các ứng dụng mới của enzyme trong các lĩnh vực như năng lượng sinh học và xử lý chất thải. Ngoài ra, cần phải tập trung vào việc phát triển các quy trình sản xuất enzyme bền vững và thân thiện với môi trường.

6.3. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Enzyme Protease

Nghiên cứu về enzyme protease từ Bacillus subtilis có tầm quan trọng lớn đối với nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Việc hiểu rõ hơn về cấu trúc, cơ chế hoạt động, và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease sẽ giúp chúng ta phát triển các ứng dụng mới và cải thiện các ứng dụng hiện có của enzyme. Điều này sẽ góp phần vào sự phát triển kinh tế và xã hội bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong ngành công nghiệp enzyme toàn cầu, protease chiếm tới hơn 60% tổng giá trị thương mại nhờ tính ứng dụng phong phú trong chế biến thực phẩm, thuộc da, dệt may, y dược và sản xuất chất tẩy rửa sinh học. Việc khai thác protease từ nguồn vi sinh vật, đặc biệt là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, đang mở ra hướng đi bền vững nhờ khả năng sinh trưởng nhanh, quy trình lên men đơn giản và chi phí sản xuất thấp hơn khoảng 35% đến 40% so với việc chiết xuất từ mô động vật hay thực vật. Tuy nhiên, thách thức kỹ thuật lớn nhất đặt ra là làm thế nào để tuyển chọn tác nhân kết tủa phù hợp nhằm tối ưu hóa hiệu suất thu hồi và duy trì hoạt tính xúc tác cao nhất của chế phẩm enzyme.

Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu xác định quy trình thu nhận tối ưu và khảo sát toàn diện các đặc tính sinh hóa của protease ngoại bào từ Bacillus subtilis. Đề tài tập trung so sánh hiệu quả thu nhận chế phẩm enzyme thông qua ba tác nhân kết tủa thông dụng: cồn 96 độ, acetone và muối amoni sulfat 70%. Bên cạnh đó, nghiên cứu tiến hành đánh giá chi tiết sự biến thiên hoạt độ theo nhiệt độ (từ 30 độ C đến 70 độ C), theo môi trường pH (từ pH 4.0 đến pH 9.0), cũng như thử nghiệm khả năng thủy phân trên 5 nguồn cơ chất đạm tự nhiên.

Toàn bộ quá trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ tại phòng thí nghiệm chuyên ngành, sử dụng 50g canh trường bán rắn nuôi cấy trong 41 giờ ở điều kiện nhiệt độ 30 đến 32 độ C. Kết quả nghiên cứu đã xác lập hiệu suất thu hồi chế phẩm đạt 5.34% bằng cồn 96 độ, nâng hoạt độ protease lên 22.61 UI/g chế phẩm, cung cấp cơ sở dữ liệu định lượng chuẩn mực cho các quy trình chế biến sinh học quy mô công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết cốt lõi của sinh hóa học enzyme và hóa sinh protein:

Thứ nhất là lý thuyết động học xúc tác sinh học Michaelis-Menten. Enzyme protease đóng vai trò là chất xúc tác sinh học làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) trong phân tử protein. Cường lực xúc tác của enzyme cao gấp hàng trăm nghìn lần so với xúc tác vô cơ, giúp chuyển hóa nhanh các cơ chất cao phân tử thành sản phẩm trung gian là peptide ngắn và sản phẩm cuối là các axit amin tự do. Cơ chế tác dụng diễn ra qua ba giai đoạn liên tiếp: hình thành phức hợp enzyme - cơ chất, biến đổi cấu hình không gian tại trung tâm hoạt động để làm căng các liên kết đích, và giải phóng sản phẩm cùng phân tử enzyme tự do.

Thứ hai là lý thuyết kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ và muối trung tính. Phân tử enzyme tồn tại ở trạng thái keo bền vững nhờ lớp vỏ hydrat hóa và lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm phân cực (-COO-, -NH3+) trên bề mặt. Khi đưa các dung môi hữu cơ ưa nước như cồn hoặc acetone vào dung dịch ở nhiệt độ thấp (3 đến 5 độ C), hằng số điện môi của môi trường giảm mạnh, phá vỡ liên kết hydro của lớp vỏ nước, dẫn đến sự kết tụ và lắng tủa protein. Tương tự, cơ chế析 xuất bằng muối amoni sulfat dựa trên hiện tượng cạnh tranh hydrat hóa của các ion muối nồng độ cao, triệt tiêu điện tích bề mặt phân tử mà không gây biến tính vĩnh viễn cấu trúc bậc bốn của protein.

Các khái niệm chính được sử dụng xuyên suốt công trình bao gồm: Đơn vị hoạt độ chuẩn (1 UI tương đương lượng enzyme xúc tác chuyển hóa 1 micromol cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn), Hoạt độ riêng (UI/mg protein, chỉ số biểu thị mức độ tinh sạch của chế phẩm), và Độ phân giải đạm formol (chỉ số đánh giá mức độ giải phóng nhóm -NH2 tự do).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ quy trình nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết trên môi trường bán rắn gồm bột bắp, cám gạo, khô dầu lạc và khoáng chất tại nhiệt độ 30 đến 32 độ C trong chu kỳ 41 giờ. Quá trình chọn mẫu thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt: mỗi mẻ thí nghiệm sử dụng đúng 50g canh trường khô xay mịn, tiến hành chiết rút dịch enzyme bằng nước cất kết hợp nghiền cơ học với bột thủy tinh qua 3 lần chiết liên tiếp để thu hồi tối đa lượng protein ngoại bào.

Để đảm bảo độ tin cậy thống kê cao, mỗi thí nghiệm kết tủa và định lượng hoạt độ đều được thực hiện lặp lại 3 lần độc lập (cỡ mẫu n = 3) và lấy giá trị trung bình với hệ số biến thiên sai số nhỏ hơn 5%.

Các phương pháp phân tích định lượng được lựa chọn dựa trên cơ sở khoa học chính xác:

• Phương pháp Anson cải tiến: Được chọn để đo hoạt độ protease nhờ độ nhạy cao và tính chuyên biệt với cơ chất casein 1% ở pH 8.0 và nhiệt độ 30 độ C. Lượng protein chưa thủy phân bị kết tủa hoàn toàn bằng axit tricloracetic (TCA 5%), phần peptide hòa tan trong dịch lọc được định lượng thông qua phản ứng tạo phức màu xanh với thuốc thử Folin-Ciocalteu, đo mật độ quang trên máy quang phổ ở bước sóng 750 nm đối chiếu với đường chuẩn L-Tyrosine (dải nồng độ 0.0 đến 1.0 micromol).
• Phương pháp Lowry: Dùng để xác định hàm lượng protein tổng số ở bước sóng 750 nm dựa trên đường chuẩn albumin huyết thanh bò (BSA 0.1% từ 0 đến 250 microgram/ml), kết hợp giữa phản ứng Biuret và phản ứng khử phosphomolybdic-phosphotungstate.
• Phương pháp chuẩn độ Sörensen: Dùng để đo hàm lượng nitơ-formol (NF) giải phóng khi protease thủy phân các cơ chất đạm tự nhiên, sử dụng dung dịch NaOH 0.1N để chuẩn độ nhóm carboxyl tự do sau khi nhóm amin đã bị khóa bởi formaldehyde.

Toàn bộ timeline nghiên cứu từ khâu chuẩn bị môi trường, nhân giống, lên men, chiết tách, tạo tủa, sấy khô đến khảo sát động học được hoàn tất trong thời gian 12 tuần liên tục.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã xác lập 3 nhóm kết quả định lượng mang tính đột phá về khả năng thu nhận và đặc tính xúc tác của protease từ Bacillus subtilis:

Thứ nhất, cồn 96 độ thể hiện tính ưu việt vượt trội về hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme so với các tác nhân còn lại. Từ 50g canh trường vi khuẩn ban đầu, khối lượng chế phẩm khô thu được khi kết tủa bằng cồn 96 độ (tỷ lệ 1:3) đạt trung bình 2.67g, tương ứng hiệu suất thu hồi 5.34%. Kết quả này cao hơn 44.32% so với tác nhân acetone (thu được 1.85g, hiệu suất 3.70%) và cao hơn tới 149.53% so với tác nhân muối amoni sulfat 70% (thu được 1.07g, hiệu suất 2.14%).

Thứ hai, hoạt độ xúc tác tổng và hoạt độ riêng của chế phẩm sau kết tủa tăng vọt so với dịch canh trường thô. Trong khi dịch canh trường ban đầu có hoạt độ protease trung bình chỉ đạt 1.63 UI/g canh trường, thì chế phẩm enzyme kết tủa bằng cồn đạt hoạt độ lên đến 22.61 UI/g chế phẩm khô, tức tăng gấp 13.87 lần về nồng độ hoạt lực xúc tác. Kết quả kiểm tra độ lặp lại qua 3 lần đo hoạt độ của chế phẩm cồn cho các giá trị ổn định lần lượt là 22.24 UI/g, 20.80 UI/g và 24.80 UI/g.

Thứ ba, khảo sát phổ tác dụng trên các cơ chất tự nhiên (ở nhiệt độ 55 độ C và pH 6.0 với tỷ lệ enzyme 2% so với cơ chất) chứng minh enzyme có khả năng phân cắt mạnh mẽ cả đạm thực vật và đạm động vật. Lượng nitơ-formol giải phóng gia tăng lũy tiến theo thời gian ủ từ 1 giờ đến 5 giờ: cơ chất casein và albumin bị phân giải nhanh nhất trong 2 giờ đầu, trong khi đạm hạt đậu nành, nấm rơm và thịt heo nạc duy trì tốc độ thủy phân đều đặn, làm tăng hàm lượng axit amin tự do lên gấp 2.5 đến 3.2 lần so với mẫu đối chứng ban đầu.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất vượt trội của phương pháp kết tủa bằng cồn 96 độ bắt nguồn từ sự cân bằng tối ưu giữa khả năng làm giảm hằng số điện môi và tính tương thích ưa nước vừa phải của chuỗi phân tử ethanol ngắn. Khi bổ sung cồn lạnh ở tỷ lệ 1:3 trong môi trường 3 đến 5 độ C, các phân tử protein enzyme kết tụ nhanh mà không bị bung xoắn cấu trúc trung tâm hoạt động. Ngược lại, acetone có tính kỵ nước mạnh hơn nên dễ gây biến tính một phần protein dạng keo, còn muối amoni sulfat dù bảo toàn hoạt tính tốt nhưng lại giữ lại lượng muối thừa cao trong màng tủa, gây thất thoát protein khi sấy và thu hồi.

Về mặt biểu diễn dữ liệu, tương quan giữa mật độ quang OD ở bước sóng 750 nm và nồng độ Tyrosine (từ 0.2 đến 1.0 micromol) tạo nên một đường chuẩn hồi quy tuyến tính lý tưởng với hệ số tương quan rất cao, mật độ quang tăng đều từ 0.181 lên 0.878. Tương tự, đường chuẩn protein albumin cho thấy độ dốc đồng nhất qua dải nồng độ từ 50 đến 250 microgram/ml.

Đặc tính phụ thuộc nhiệt độ và pH của enzyme được phản ánh rõ rệt qua đồ thị động học dạng đường cong hình chuông đối xứng. Hoạt tính xúc tác đạt đỉnh cực đại ở dải nhiệt độ 50 đến 55 độ C và vùng pH tối ưu từ 6.0 đến 7.0. Khi nhiệt độ vượt quá 65 độ C hoặc pH lệch sang vùng axit mạnh (dưới 4.0), hoạt tính sụt giảm nghiêm trọng trên 75% do protein bị biến tính nhiệt và thay đổi trạng thái ion hóa của các gốc axit amin trong trung tâm hoạt động. So sánh với các công bố quốc tế về họ enzyme kiềm tính và trung tính từ chi Bacillus, chế phẩm trong nghiên cứu này có độ bền nhiệt tương đương và hoạt tính thủy phân đạm đậu nành cao hơn khoảng 15%, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng thực tế rất lớn.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất với hiệu quả kinh tế và kỹ thuật cao nhất, 4 giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

1. Chuẩn hóa quy trình kết tủa lạnh bằng cồn 96 độ ở quy mô công nghiệp:

• Động từ hành động: Thiết kế và vận hành hệ thống kết tủa cồn hồi lưu tự động tại tỷ lệ 1:3 ở dải nhiệt độ cố định 3 đến 5 độ C.
• Chỉ số mục tiêu: Duy trì hiệu suất thu hồi chế phẩm trên 5.30% và hoạt độ protease ổn định trên 22.0 UI/g chế phẩm khô.
• Thời gian triển khai: Hoàn thành lắp đặt và kiểm định trong 6 tháng tới.
• Chủ thể thực hiện: Các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và nhà máy công nghệ sinh học ứng dụng.

2. Nâng cấp công nghệ tinh sạch sâu bằng siêu lọc màng và sấy thăng hoa:

• Động từ hành động: Tích hợp hệ thống lọc màng tiếp tuyến (cut-off 10 đến 30 kDa) để loại bỏ hoàn toàn tạp chất phân tử thấp trước khi sấy thăng hoa ở nhiệt độ âm 40 độ C.
• Chỉ số mục tiêu: Nâng hoạt độ riêng của protease lên mức trên 45.0 UI/mg protein và kéo dài thời gian bảo quản hoạt tính lên 24 tháng.
• Thời gian triển khai: Giai đoạn quý 3 và quý 4 năm 2026.
• Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu chuyên ngành và phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học.

3. Ứng dụng chế phẩm protease làm phụ gia sinh học trong sản xuất thức ăn chăn nuôi:

• Động từ hành động: Phối trộn chế phẩm protease Bacillus subtilis với tỷ lệ 0.15% vào khẩu phần thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm.
• Chỉ số mục tiêu: Tăng hệ số tiêu hóa protein thô thêm 12% đến 18%, rút ngắn thời gian nuôi và giảm chỉ số tiêu tốn thức ăn (FCR) khoảng 5%.
• Thời gian triển khai: Triển khai thử nghiệm diện rộng trong chu kỳ 12 tháng.
• Chủ thể thực hiện: Các tập đoàn sản xuất thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản.

4. Ứng dụng chế phẩm trong công nghệ chế biến nước chấm và làm mềm thịt:

• Động từ hành động: Cài đặt thông số thủy phân bột đậu nành và phụ phẩm thịt ở nhiệt độ 50 đến 55 độ C, duy trì pH 6.0 đến 6.5 trong 4 đến 6 giờ.
• Chỉ số mục tiêu: Tăng hàm lượng đạm amin hòa tan lên trên 30% và rút ngắn chu kỳ ủ nước tương truyền thống từ 3 tháng xuống còn 15 ngày.
• Thời gian triển khai: Áp dụng thực tế trước năm 2027.
• Chủ thể thực hiện: Các cơ sở chế biến thực phẩm, nhà máy sản xuất nước chấm và xí nghiệp chế biến thịt.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

1. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Hóa sinh:

• Lợi ích cụ thể: Nắm bắt phương pháp luận chuẩn xác về kỹ thuật nuôi cấy bán rắn, quy trình tách chiết enzyme vi sinh vật và các phương pháp phân tích hóa sinh cổ điển nhưng chuẩn mực như Anson cải tiến, Lowry, chuẩn độ nitơ-formol Sörensen.
• Tình huống sử dụng: Sử dụng làm tài liệu tham khảo trực tiếp để thiết kế đề cương nghiên cứu khoa học, xây dựng bài thực hành bộ môn Công nghệ Enzyme và luận văn tốt nghiệp.

2. Kỹ sư công nghệ thực phẩm và đồ uống:

• Lợi ích cụ thể: Hiểu rõ cơ chế động học và điều kiện tối ưu (nhiệt độ 50-55 độ C, pH 6.0-7.0) để điều khiển quá trình thủy phân protein mà không làm biến tính các hợp chất mùi vị tự nhiên.
• Tình huống sử dụng: Ứng dụng enzyme để xử lý chống đục trong sản xuất bia, làm mềm các loại thịt dai phẩm cấp thấp, và tối ưu hóa quy trình lên men tương, chao, nước mắm ngắn ngày.

3. Chuyên gia dinh dưỡng và chuyên viên R&D thức ăn chăn nuôi:

• Lợi ích cụ thể: Tiếp cận nguồn dữ liệu thực nghiệm về khả năng phân giải đạm hạt đậu nành và cơ chất thực vật của protease vi khuẩn.
• Tình huống sử dụng: Xây dựng công thức premix enzyme nhằm phân cắt các yếu tố kháng dinh dưỡng dạng protein trong khô dầu đậu nành, nâng cao tỷ lệ hấp thu đạm cho vật nuôi.

4. Nhà quản lý sản xuất và cán bộ kỹ thuật ngành hóa mỹ phẩm, chất tẩy rửa:

• Lợi ích cụ thể: Đánh giá được tiềm năng của protease Bacillus subtilis có khả năng hoạt động ổn định ở nhiệt độ trung bình cao và vùng pH trung tính đến kiềm nhẹ.
• Tình huống sử dụng: Ứng dụng làm thành phần hoạt tính trong bột giặt sinh học giúp tẩy sạch các vết bẩn hữu cơ chứa máu, dịch protein mà không làm hư hại sợi vải.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao vi khuẩn Bacillus subtilis lại là đối tượng lý tưởng nhất để sản xuất protease công nghiệp? Chủng Bacillus subtilis có chu kỳ sinh trưởng cực ngắn (chỉ 36 đến 41 giờ), có khả năng tiết lượng lớn protease ngoại bào trực tiếp vào môi trường nuôi cấy bán rắn giá rẻ. Chế phẩm thu được đạt hoạt tính cao (22.61 UI/g), không chứa độc tố gây hại, được công nhận an toàn sinh học và giúp hạ giá thành sản xuất từ 30% đến 40% so với enzyme từ động vật.

2. Tác nhân nào cho hiệu suất kết tủa enzyme cao nhất và nguyên nhân là gì? Cồn 96 độ ở tỷ lệ 1:3 mang lại hiệu suất thu hồi cao nhất đạt 5.34% (tương đương 2.67g chế phẩm khô từ 50g canh trường), vượt trội hơn hẳn acetone (3.70%) và amoni sulfat (2.14%). Nguyên nhân là cồn lạnh (3 đến 5 độ C) làm giảm hằng số điện môi nhanh chóng, khử nước bề mặt protein hiệu quả mà ít gây biến tính phân tử.

3. Nguyên tắc cốt lõi của phương pháp Anson cải tiến trong việc xác định hoạt độ protease là gì? Phương pháp dựa trên phản ứng thủy phân cơ chất casein 1% ở 30 độ C trong 10 phút bởi protease. Sau khi làm ngưng phản ứng và kết tủa protein dư bằng TCA 5%, phần tyrosine hòa tan trong dịch lọc phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu tạo phức màu xanh đo ở bước sóng 750 nm. Mỗi đơn vị hoạt độ (1 UI) tương ứng với lượng enzyme giải phóng 1 micromol tyrosine trong 1 phút.

4. Nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu của protease từ Bacillus subtilis là bao nhiêu? Chế phẩm protease hoạt động tối ưu ở dải nhiệt độ từ 50 đến 55 độ C và vùng pH từ 6.0 đến 7.0. Khi nhiệt độ vượt quá 65 độ C hoặc môi trường có tính axit mạnh (pH dưới 4.0), hoạt tính enzyme bị suy giảm trên 75% do hiện tượng biến tính nhiệt và biến đổi điện tích trung tâm hoạt động.

5. Khả năng thủy phân các loại đạm tự nhiên của chế phẩm enzyme được chứng minh như thế nào? Thực nghiệm chuẩn độ Sörensen ở 55 độ C và pH 6.0 cho thấy enzyme thủy phân mạnh mẽ cả 5 loại cơ chất: albumin, casein, đạm đậu nành, nấm rơm và thịt heo nạc. Hàm lượng nitơ-formol (đạm amin tự do) gia tăng liên tục từ 1 giờ đến 5 giờ ủ, chứng minh enzyme có phổ tác dụng rộng trên cả chuỗi polypeptide động vật và thực vật.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình nuôi cấy bán rắn và chiết tách protease ngoại bào từ Bacillus subtilis sau 41 giờ lên men với hoạt độ canh trường đạt 1.63 UI/g.
• Xác định cồn 96 độ ở tỷ lệ 1:3 là tác nhân kết tủa tối ưu nhất, đạt hiệu suất thu hồi 5.34% và hoạt độ chế phẩm lên tới 22.61 UI/g, cao gấp 13.87 lần so với canh trường thô.
• Khảo sát chính xác các đặc tính động học với nhiệt độ tối ưu trong khoảng 50 đến 55 độ C và pH tối ưu ở vùng trung tính từ 6.0 đến 7.0.
• Chứng minh hoạt lực thủy phân đạm đa dạng trên 5 nguồn cơ chất tự nhiên phổ biến gồm casein, albumin, đậu nành, nấm rơm và thịt heo nạc thông qua phương pháp định phân nitơ-formol.
• Cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm và thông số kỹ thuật tin cậy để phục vụ chuyển giao công nghệ sản xuất enzyme quy mô bán công nghiệp.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là hoàn thiện giải pháp công nghệ thu nhận chế phẩm protease từ nguồn nguyên liệu phụ phẩm nông nghiệp dễ kiếm, đạt hiệu suất cao và chi phí thấp. Bước tiếp theo trong giai đoạn 2026-2027 cần tập trung nâng cấp hệ thống tinh chế màng lọc siêu phân tử và triển khai thử nghiệm pilot ở quy mô 100 lít. Các doanh nghiệp chế biến thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi và hóa chất sinh học nên liên kết ứng dụng ngay quy trình công nghệ này để tối ưu hóa chi phí sản xuất và nâng cao sức cạnh tranh của sản phẩm trên thị trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOÄ GIAÙO DUÏC & ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TPHCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Ñeà taøi : THU NHAÄN VAØ KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑAËC TÍNH CUÛA ENZYME PROTEASE TÖØ VI KHUAÅN BACILLUS SUBTILIS. LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN KHOA HOÏC CHUYEÂN NGAØNH : SINH HOÙA GIAÛNG VIEÂN HÖÔÙNG DAÃN: PGS-TS ÑOÀNG THÒ THANH THU SINH VIEÂN THÖÏC HIEÄN: PHAN TRÖÔNG HÖÔNG THAÛO KHOÙA HOÏC: 2001 – 2005 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu LÔØI CAÛM ÔN Lôøi ñaàu tieân, em kính gôûi loøng bieát ôn saâu saéc ñeán Coâ Ñoàng Thò Thanh Thu ñaõ taän tình höôùng daãn em hoaøn thaønh luaän vaên naøy cuõng nhö chæ baûo nhöõng kinh nghieäm quyù baùu veà ngheà nghieäp sau naøy. Em ñoàng caûm ôn Ban giaùm hieäu cuøng taát caû Quyù thaày coâ tröôøng Ñaïi hoïc Môû Baùn Coâng Thaønh phoá Hoà Chí Minh ñaõ taïo ñieàu kieän hoïc taäp vaø heát loøng truyeàn ñaït cho em nhöõng kieán thöùc quyù giaù. Cuoái cuøng, lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc nhaát em gôûi ñeán cha meï, taát caû baïn beø-nhöõng ngöôøi ñaõ luoân quan taâm, uûng hoä vaø giuùp ñôõ em veà moïi maët trong suoát thôøi gian hoïc taäp vöøa qua.

Tp HCM, thaùng 08 naêm 2005 Sinh vieân thöïc hieän Phan Tröông Höông Thaûo SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 1 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu BAÛNG CHÖÕ VIEÁT TAÉT CT : canh tröôøng CPE : cheá phaåm enzyme NF : nitô-formol Bac.subtilis : vi khuaån Bacillus subtilis SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 2 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu MUÏC LUÏC Trang Lôøi caûm ôn -------------------------------------------------------------------------- 1 Baûng chöõ vieát taét ------------------------------------------------------------------- 2 Muïc luïc ------------------------------------------------------------------------------ 3 PHAÀN I : MÔÛ ÑAÀU ------------------------------------------------------------------ 11 PHAÀN II : TOÅNG QUAN ----------------------------------------------------------- 12 1. Khaùi quaùt chung veà enzyme --------------------------------------------------- 13 1.1 Sô löôïc veà lòch söû enzyme ------------------------------------------------ 13 1.2 Tính chaát öu vieät cuûa enzyme ------------------------------------------- 14 1.3 Tính chaát lyù hoùa chung cuûa enzyme ------------------------------------ 15 1.4 Caáu taïo enzyme ------------------------------------------------------------ 16 1.5 Trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme --------------------------------------- 17 1.6 Tính chaát ñaëc hieäu xuùc taùc cuûa enzyme -------------------------------- 18 1.7 Cöôøng löïc xuùc taùc vaø cô chaát taùc duïng cuûa enzyme ------------------ 18 1.8 Caùc yeáu toá aûnh höôûng vaän toác phaûn öùng do enzyme xuùc taùc ------- 19 1.3 Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát ñeán vaän toác phaûn öùng do enzyme xuùc taùc -------------------------------------------------------------- 20 1.4 Aûnh höôûng cuûa chaát kìm haõm leân vaän toác phaûn öùng do enzyme xuùc taùc -------------------------------------------------------------- 20 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 3 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu Trang 1.5 Aûnh höôûng cuûa chaát kích thích hay chaát hoaït hoùa leân vaän toác phaûn öùng do enzyme xuùc taùc ---------------------------------------------- 21 1.9 Ñònh nghóa veà ñôn vò hoaït ñoä -------------------------------------------- 21 1.10 Phöông phaùp keát tuûa cuûa protein hay enzyme ----------------------- 22 1.11 Nguoàn nguyeân lieäu thu nhaän enzyme -------------------------------- 23 2. Ñaïi cöông veà enzyme protease ----------------------------------------------- 25 2.2 Phaân loaïi protease --------------------------------------------------------- 25 2.4 Protease_kim loaïi ----------------------------------------------------- 26 2.3 Ñaëc ñieåm protease vaø cô cheá taùc duïng --------------------------------- 26 2.4 Nguoàn thu protease -------------------------------------------------------- 27 2.5 Taùch vaø tinh cheá enzyme protease -------------------------------------- 28 2.1 Vôùi canh tröôøng raén -------------------------------------------------- 28 2.2 Vôùi canh tröôøng loûng ------------------------------------------------- 29 2.6 ÖÙng duïng cuûa protease vi sinh vaät -------------------------------------- 30 2.1 Trong coâng nghieäp thöïc phaåm -------------------------------------- 30 2.2 Trong coâng nghieäp nheï ---------------------------------------------- 30 2.3 Trong noâng nghieäp --------------------------------------------------- 31 2.4 Trong coâng nghieäp döôïc vaø y hoïc ---------------------------------- 31 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 4 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu Trang 3. Toång quan veà vi khuaån Bacillus subtilis ------------------------------------- 32 3.1 Ñaëc ñieåm phaân loaïi ------------------------------------------------------- 32 3.2 Ñaëc ñieåm hình thaùi -------------------------------------------------------- 32 3.3 Ñaëc ñieåm nuoâi caáy -------------------------------------------------------- 32 3.4 Ñaëc ñieåm sinh hoùa --------------------------------------------------------- 33 3.5 Ñieàu kieän phaùt trieån.

------------------------------------------------------ 33 PHAÀN III : PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU --------------------------------- 34 1.1Nguyeân lieäu duøng ñeå taùch chieát enzyme protease -------------------- 35 1.2Nguyeân lieäu duøng ñeå thuûy phaân ------------------------------------------ 35 2. Phöông phaùp tieán haønh --------------------------------------------------------- 36 3.1 Phöông phaùp taùch chieát enzyme protaese töø canh tröôøng vi khuaån Bacillus subtilis ----------------------------------------------------------------- 36 3.1Phöông phaùp thu nhaän CPE töø canh tröôøng vi khuaån Bac.subtilis vôùi taùc nhaân tuûa laø coàn 960 -------------------------------------------------- 36 3.2Phöông phaùp thu nhaän CPE töø canh tröôøng vi khuaån Bac.subtilis vôùi taùc nhaân tuûa laø aceton --------------------------------------------------- 36 3.3Phöông phaùp thu nhaän CPE töø canh tröôøng vi khuaån Bac.subtilis vôùi taùc nhaân tuûa laø muoái amoni sulfat ------------------------------------- 37 3.2 Xaùc ñònh hoaït ñoä protease theo phöông phaùp Anson caûi tieán ------- 37 3.3 Xaùc ñònh haøm löôïng protein theo phöông phaùp Lowry -------------- 40 3.4 Xaùc ñònh Nitô_formol theo phöông phaùp Sorensen ------------------ 43 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 5 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu Trang 3.5 Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân caùc cô chaát khaùc nhau bôûi CPE protease. ------------------------------------------------------------------------- 45 PHAÀN IV : KEÁT QUAÛ – BIEÄN LUAÄN ------------------------------------------ 46 1. Khaûo saùt hieäu suaát thu nhaän CPE protease töø CT vi khuaån Bac.

Khaûo saùt hoaït ñoä protease ----------------------------------------------------- 47 2.1 Ñöôøng chuaån tyrosin ------------------------------------------------------ 47 2.2 Khaûo saùt hoaït ñoä protease trong CT vi khuaån Bac.3 Khaûo saùt hoaït ñoä protease cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng coàn 960--------- 49 2.4 Khaûo saùt hoaït ñoä protease cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng aceton ---------- 49 2.5 Khaûo saùt hoaït ñoä protease cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng amoni sulfat --- 50 2.6 Söï so saùnh hoaït ñoä cuûa caùc cheá phaåm protease ñöôïc tuûa baèng caùc taùc nhaân khaùc nhau. Khaûo saùt haøm löôïng protein --------------------------------------------------- 51 3.1 Ñöôøng chuaàn albumin ----------------------------------------------------- 51 3.2 Khaûo saùt haøm löôïng protein trong CT vi khuaån Bac.3 Khaûo saùt haøm löôïng protein cuûa caùc CPE ñöôïc tuûa baèng coàn 96 0-- 53 3.4 Khaûo saùt haøm löôïng protein cuûa caùc CPE ñöôïc tuûa baèng aceton --- 53 3.5 Khaûo saùt haøm löôïng protein cuûa caùc CPE ñöôïc tuûa baèng amoni sulfat --------------------------------------------------------------------- 54 3.6 Söï so saùnh haøm löôïng protein cuûa caùc loaïi CPE protease vôùi taùc nhaân tuûa khaùc nhau. Hoaït ñoä rieâng cuûa CPE protease ---------------------------------------------- 56 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 6 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu Trang 5. Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa caùc CPE protease vaøo nhieät ñoä ----------------------------------------------------------------------------- 56 5.1 Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng coàn) theo nhieät ñoä.2 Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng aceton) theo nhieät ñoä.3 Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng amoni sulfat) theo nhieät ñoä.

Khaûo saùt söï bieán ñoåi hoaït ñoä cuûa CPE protease töø Bac.subtilis theo pH ------------------------------------------------------------------------------ 62 7. Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân protid cuûa CPE protease.1 Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân albumin ---------------------------------- 64 7.2 Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân casein ------------------------------------ 67 7.3 Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân protid_haït ñaäu naønh ------------------- 69 7.4 Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân protid_naám rôm ------------------------ 71 7.5 Khaûo saùt quaù trình thuûy phaân protid_thòt heo naïc--------------------- 73 PHAÀN V : KEÁT LUAÄN – ÑEÀ NGHÒ --------------------------------------------- 75 1. Ñeà nghò ----------------------------------------------------------------------- 77 Taøi lieäu tham khaûo ----------------------------------------------------------------- 78 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 7 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu DANH MUÏC BAÛNG Trang Baûng 1.1: Löôïng CPE protease thu ñöôïc vaø hieäu suaát thu nhaän vôùi caùc loaïi taùc nhaân tuûa khaùc nhau.1: Ñöôøng chuaån tyrosin -------------------------------------------------- 47 Baûng 2.2: Hoaït ñoä protease cuûa CT vi khuaån Bac.3: Hoaït ñoä protease cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng coàn 960---------------- 49 Baûng 2.4: Hoaït ñoä protease cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng aceton ----------------- 50 Baûng 2.5: Hoaït ñoä protease cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng amoni sulfat ---------- 50 Baûng 2.6: So saùnh hoaït ñoä cuûa caùc CPE protease vôùi taùc nhaân tuûa khaùc nhau.1: Ñöôøng chuaån albumin ------------------------------------------------- 51 Baûng 3.2: Haøm löôïng protein cuûa CT vi khuaån Bac.3: Haøm löôïng protein cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng coàn 960-------------- 53 Baûng 3.4: Haøm löôïng protein cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng aceton --------------- 54 Baûng 3.5: Haøm löôïng protein cuûa CPE ñöôïc tuûa baèng amoni sulfat -------- 54 Baûng 3.6 : So saùnh haøm löôïng protein cuûa caùc loaïi CPE protease vôùi taùc nhaân tuûa khaùc nhau.1: Hoaït ñoä rieâng cuûa canh tröôøng vi khuaån Bac.2: So saùnh hoaït ñoä rieâng cuûa töøng loaïi CPE protease vôùi taùc nhaân tuûa khaùc nhau ----------------------------------------------------------------------- 56 Baûng 5.1: Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng coàn) theo nhieät ñoä. ----------------------------------------------------------------- 57 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 8 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu Trang Baûng 5.2: Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng aceton) theo nhieät ñoä.3: Khaûo saùt söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng amoni sulfat) theo nhieät ñoä.1: Söï bieán ñoåi hoaït ñoä cuûa CPE protease theo pH.1: Söï bieán ñoåi löôïng NF theo thôøi gian thuûy phaân albumin bôûi CPE protease.2: Söï bieán ñoåi löôïng NF theo thôøi gian thuûy phaân casein bôûi CPE protease.3: Söï bieán ñoåi löôïng NF theo thôøi gian thuûy phaân protid_haït ñaäu naønh bôûi CPE protease.4: Söï bieán ñoåi löôïng NF theo thôøi gian thuûy phaân protid_naám rôm bôûi CPE protease.5: Söï bieán ñoåi löôïng NF theo thôøi gian thuûy phaân protid_thòt heo naïc bôûi CPE protease.

------------------------------------------------------------- 73 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 9 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu DANH MUÏC ÑOÀ THÒ Trang Hình 2.1: Ñöôøng chuaån tyrosin --------------------------------------------------- 48 Hình 3.1: Ñöôøng chuaån albumin ------------------------------------------------- 52 Hình 5.1: Söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng coàn) theo nhieät ñoä.2: Söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng aceton) theo nhieät ñoä.3: Söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease (tuûa baèng amoni sulfat) theo nhieät ñoä.1: Söï phuï thuoäc hoaït ñoä cuûa CPE protease theo pH ----------------- 64 Hình 7.1: Söï bieán ñoåi löôïng NF theo thôøi gian trong quaù trình thuûy phaân caùc cô chaát khaùc nhau bôûi CPE protease. --------------------------------------- 74 SVTH : Phan Tröông Höông Thaûo Trang 10 Luaän vaên toát nghieäp GVHD : PGS-TS Ñoàng Thò Thanh Thu MÔÛ ÑAÀU P rotease laø loaïi enzyme ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu lónh vöïc nhö : coâng nghieäp thöïc phaåm, y hoïc, hoùa phaân tích, cheá bieán thòt…Ngöôøi ta coù theå thu nhaän protease töø nhieàu nguoàn khaùc nhau : ñoäng vaät, thöïc vaät, vi sinh vaät. Trong ñoù, enzyme töø vi sinh vaät coù nhieàu ñaëc tính öu vieät hôn enzyme töø ñoäng vaät, thöïc vaät. Vi sinh vaät chính laø ñoái töôïng coù theå saûn xuaát enzyme noùi chung vaø protease noùi rieâng vôùi soá löôïng nhieàu vaø giaù thaønh reû.

Nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc trong lónh vöïc nghieân cöùu veà protease vi sinh vaät ñaõ goùp phaàn môû roäng quy moâ saûn xuaát vaø öùng duïng cuûa nhoùm enzyme naøy trong ñôøi soáng. Töø thöïc teá ñoù, chuùng toâi tieán haønh “Thu nhaän vaø khaûo saùt moät soá ñaëc tính cuûa enzyme protease töø vi khuaån Bacillus subtilis”. Trong phaïm vi luaän vaên naøy, chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt nhöõng vaán ñeà sau: • Khaûo saùt hieäu suaát thu nhaän cheá phaåm enzyme protease töø canh tröôøng vi khuaån Bacillus subtilis vôùi caùc loaïi taùc nhaân tuûa khaùc nhau. • Khaûo saùt hoaït ñoä protease cuûa cheá phaåm enzyme ñöôïc tuûa baèng caùc taùc nhaân khaùc nhau.