Khảo Sát Đặc Tính Enzyme Protease Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

• Tác giả: Phan Trương Hương Thảo
• Người hướng dẫn: PGS-TS Đoàn Thị Thanh Thu
• Trường học: Trường Đại Học Mở – Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Đặc Tính Enzyme Protease Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2005
• Địa điểm: TP HCM

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN
• 2.1. Khái quát chung về enzyme
• 2.1.1. Sơ lược về lịch sử enzyme
• 2.1.2. Tính chất ưu việt của enzyme
• 2.1.3. Tính chất lý hóa chung của enzyme
• 2.1.4. Cấu tạo enzyme
• 2.1.5. Trung tâm hoạt động của enzyme
• 2.1.6. Tính chất đặc hiệu xúc tác của enzyme
• 2.1.7. Cường lực xúc tác và cơ chất tác dụng của enzyme
• 2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác
• 2.2. Đại cương về enzyme protease
• 2.2.1. Phân loại protease
• 2.2.2. Protease kim loại
• 2.2.3. Đặc điểm protease và cơ chế tác dụng
• 2.2.4. Nguồn thu protease
• 2.2.5. Tách và tinh chế enzyme protease
• 2.2.6. Ứng dụng của protease vi sinh vật
• 2.2.6.1. Trong công nghiệp thực phẩm
• 2.2.6.2. Trong công nghiệp nhẹ
• 2.2.6.3. Trong nông nghiệp
• 2.2.6.4. Trong công nghiệp dược và y học
• 2.3. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus subtilis
• 2.3.1. Đặc điểm phân loại
• 2.3.2. Đặc điểm hình thái
• 2.3.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 2.3.4. Đặc điểm sinh hóa
• 2.3.5. Điều kiện phát triển
• 3. PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên liệu dùng để tách chiết enzyme protease
• 3.2. Nguyên liệu dùng để thuỷ phân
• 3.3. Phương pháp tiến hành
• 3.3.1. Phương pháp tách chiết enzyme protease từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis
• 3.3.2. Phương pháp thu nhận CPE từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis với tác nhân tủa là cồn 960
• 3.3.3. Phương pháp thu nhận CPE từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis với tác nhân tủa là aceton
• 3.3.4. Phương pháp thu nhận CPE từ canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis với tác nhân tủa là muối amoni sulfat
• 3.3.5. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến
• 3.3.6. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
• 3.3.7. Xác định Nitơ-formol theo phương pháp Sorensen
• 3.3.8. Khảo sát quá trình thuỷ phân các cơ chất khác nhau bởi CPE protease
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ – BIỂN LUẬN
• 4.1. Khảo sát hiệu suất thu nhận CPE protease từ CT vi khuẩn Bac. Khảo sát hoạt độ protease
• 4.1.1. Đường chuẩn tyrosin
• 4.1.2. Khảo sát hoạt độ protease trong CT vi khuẩn Bac.
• 4.1.3. Khảo sát hoạt độ protease của CPE tủa bằng cồn 960
• 4.1.4. Khảo sát hoạt độ protease của CPE tủa bằng aceton
• 4.1.5. Khảo sát hoạt độ protease của CPE tủa bằng amoni sulfat
• 4.1.6. So sánh hoạt độ của các chế phẩm protease tủa bằng các tác nhân khác nhau. Khảo sát hàm lượng protein
• 4.2. Đường chuẩn albumin
• 4.3. Khảo sát hàm lượng protein trong CT vi khuẩn Bac.
• 4.4. Khảo sát hàm lượng protein của các CPE tủa bằng cồn 960
• 4.5. Khảo sát hàm lượng protein của các CPE tủa bằng aceton
• 4.6. Khảo sát hàm lượng protein của các CPE tủa bằng amoni sulfat
• 4.7. So sánh hàm lượng protein của các loại CPE protease với tác nhân tủa khác nhau. Hoạt độ riêng của CPE protease
• 4.8. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của các CPE protease vào nhiệt độ
• 4.8.1. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng cồn) theo nhiệt độ
• 4.8.2. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng aceton) theo nhiệt độ
• 4.8.3. Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ của CPE protease (tủa bằng amoni sulfat) theo nhiệt độ
• 4.8.4. Khảo sát sự biến đổi hoạt độ của CPE protease từ Bac.subtilis theo pH
• 4.9. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid của CPE protease
• 4.9.1. Khảo sát quá trình thuỷ phân albumin
• 4.9.2. Khảo sát quá trình thuỷ phân casein
• 4.9.3. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid hạt đậu nành
• 4.9.4. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid nấm rơm
• 4.9.5. Khảo sát quá trình thuỷ phân protid thớt heo nái
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
• 5.1. Đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Enzyme Protease Từ Bacillus Subtilis 55

Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào sống đều do enzyme protease xúc tác. Enzyme protease là những protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng sinh hóa, chiếm đến 80% - 90% thành phần protein trong tế bào sinh vật. Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme protease được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chúng không những có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng xảy ra trong tế bào sống gọi là “invivo”, mà sau khi tách khỏi tế bào chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “invitro”. Cơ thể thiếu enzyme protease thì mọi quá trình chuyển hóa bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản và phát triển bình thường được, sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại được. Hiện nay, người ta đã khám phá được hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể. Enzyme protease ngày nay được ứng dụng ngày càng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm: bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước chấm, nước mắm…

1.1. Lịch Sử Phát Triển Khám Phá Enzyme Protease

Năm 1883 Payen và Persoz đã phân lập được chất có trong lúa nảy mầm có khả năng phá vỡ cấu trúc tinh bột tạo thành đường và đã đặt tên là diatase, hiện nay được gọi là Amylase. Năm 1867 Wijhelm Kuhne là một nhà vật lý học người Đức lần đầu tiên đề nghị đặt tên “enzyme” thay thế cho từ “ferment”, enzyme có nghĩa là “in yeast” trong tiếng Hy Lạp. Năm 1897 Edward Buchner-nhà hóa học người Đức-đã khám phá ra những tế bào tự do của cao nấm men có khả năng lên men rượu. Năm 1906 Otto Rohm là người đầu tiên nghiên cứu về việc sử dụng sản phẩm enzyme protease vào công nghiệp. Summer-nhà sinh hóa học của Mỹ-đã thành công trong việc tách chiết và kết tinh urease dạng tinh thể từ cao một loại đậu có tên là Jack-bean. Northop-nhà sinh hóa học người Mỹ-đã thành công trong việc tách chiết và tạo ra tinh thể Pepsin và Trypsin.

1.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của Enzyme Protease So Với Khác

Enzyme protease có hoạt lực xúc tác rất cao gấp hàng trăm ngàn lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường do vậy chỉ cần dùng một lượng nhỏ enzyme protease có thể chuyển hóa một lượng cơ chất trong khoảng thời gian ngắn. Điều này rất cần thiết để rút ngắn thời gian sản xuất sản phẩm. Enzyme protease có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn liệu khác nhau như từ động vật (chimotrypsin, trypsin, renin, pepsin,…), từ thực vật (papain, bromelin, amilase, urease,…) và từ vi sinh vật (gần như đủ loại enzyme protease với hoạt tính cao). Do có nguồn gốc từ sinh vật, từ các loại thực phẩm rau quả thông dụng nên hầu hết enzyme protease không có tính chất độc hại.

1.3. Tính Chất Lý Hóa Chung Của Enzyme Protease

Bản chất hóa học của enzyme protease là protein nên enzyme protease có đầy đủ tính chất của một protein. Enzyme protease có khối lượng phân tử lớn, đa số enzyme protease có khối lượng phân tử trung bình từ 6.000 dalton do vậy enzyme protease không thể đi qua được màng bán thấm. Enzyme protease có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các dung dịch đệm, glycerin, khi hòa tan thì tạo thành dung dịch keo và enzyme protease không tan trong dung môi không phân cực. Enzyme protease cũng bị kết tủa bởi các tác nhân gây kết tủa protein. Các tác nhân vật lý và hóa học làm biến tính protein thì cũng làm biến tính enzyme protease vì vậy enzyme protease cũng bị mất hoạt tính.

II. Cách Phân Loại Enzyme Protease Cơ Chế Hoạt Động 58

Protease là một nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide trong protein, giải phóng các peptide và amino acid. Dựa vào vị trí tác động trên chuỗi peptide, protease được chia thành endopeptidase (cắt bên trong chuỗi) và exopeptidase (cắt từ đầu chuỗi). Dựa vào nhóm chức hoạt động, protease được phân loại thành serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metalloprotease. Cơ chế hoạt động của protease liên quan đến việc tấn công nucleophilic của một nhóm chức hoạt động (serine hydroxyl, cysteine thiol, hoặc aspartic carboxyl) vào carbonyl carbon của liên kết peptide, tạo ra một phức hợp trung gian tetraedric, sau đó bị phân hủy giải phóng các sản phẩm thủy phân. Enzyme protease đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, từ tiêu hóa protein đến điều hòa các con đường tín hiệu tế bào.

2.1. Phân Loại Enzyme Protease Theo Cơ Chế Tác Dụng

Protease có thể được phân loại dựa trên cơ chế xúc tác của chúng. Serine protease sử dụng một dư lượng serine hoạt động trong trung tâm xúc tác của chúng. Cysteine protease sử dụng một dư lượng cysteine hoạt động. Aspartic protease sử dụng hai dư lượng aspartic acid trong trung tâm xúc tác của chúng. Metalloprotease sử dụng một ion kim loại, thường là kẽm, để kích hoạt phân tử nước và tấn công liên kết peptide. Mỗi loại protease có vai trò và ứng dụng khác nhau trong các lĩnh vực khác nhau.

2.2. Nguồn Gốc Tự Nhiên Của Enzyme Protease

Nguồn thu protease rất đa dạng. Chúng có thể được tìm thấy trong động vật (ví dụ: trypsin và chymotrypsin từ tuyến tụy), thực vật (ví dụ: papain từ đu đủ và bromelain từ dứa), và vi sinh vật (ví dụ: Bacillus subtilis protease). Protease từ vi sinh vật thường được ưa chuộng trong công nghiệp do tính ổn định, hoạt tính cao và khả năng sản xuất hàng loạt. Bacillus subtilis là một nguồn quan trọng của protease kiềm, được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng tẩy rửa và thủy phân protein.

2.3. Tách Chiết và Tinh Chế Enzyme Protease Hiệu Quả

Quá trình tách chiết và tinh chế enzyme protease từ nguồn tự nhiên bao gồm nhiều bước. Các bước thường bao gồm phá vỡ tế bào (nếu cần), kết tủa protein (sử dụng muối amoni sulfat hoặc dung môi hữu cơ), sắc ký (ví dụ: sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực), và lọc. Mục tiêu là thu được enzyme protease có độ tinh khiết cao với hoạt tính mong muốn. Phương pháp tách chiết và tinh chế cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và bảo toàn hoạt tính của enzyme protease.

III. Hướng Dẫn Khảo Sát Hoạt Tính Protease Từ Bacillus 57

Việc khảo sát hoạt tính protease là rất quan trọng để xác định khả năng thủy phân protein của enzyme thu được từ Bacillus subtilis. Phương pháp Anson cải tiến là một trong những phương pháp phổ biến nhất. Phương pháp này dựa trên việc đo lượng tyrosine giải phóng trong quá trình thủy phân casein bởi protease. Ngoài ra, hàm lượng protein cũng cần được xác định bằng phương pháp Lowry để tính hoạt độ riêng của enzyme. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và thời gian ủ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo kết quả chính xác.

3.1. Phương Pháp Anson Cải Tiến Đo Hoạt Tính Protease

Phương pháp Anson cải tiến là một phương pháp kolorimetric được sử dụng rộng rãi để xác định hoạt tính protease. Trong phương pháp này, casein được sử dụng làm cơ chất và protease thủy phân casein giải phóng các peptide và amino acid, bao gồm tyrosine. Lượng tyrosine giải phóng được đo bằng cách phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu, tạo ra một màu xanh có thể đo được bằng quang phổ kế. Hoạt tính protease được biểu thị bằng đơn vị Anson (AU), định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 micromole tyrosine mỗi phút.

3.2. Xác Định Hàm Lượng Protein Bằng Phương Pháp Lowry

Phương pháp Lowry là một phương pháp kolorimetric khác được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong mẫu. Phương pháp này dựa trên phản ứng của protein với thuốc thử Folin-Ciocalteu, tạo ra một màu xanh có thể đo được bằng quang phổ kế. Phương pháp Lowry nhạy hơn phương pháp Biuret và được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng protein trong nhiều loại mẫu, bao gồm cả chế phẩm enzyme protease. Kết quả thu được từ phương pháp Lowry được sử dụng để tính hoạt độ riêng của enzyme.

3.3. Ảnh Hưởng Của pH Nhiệt Độ Đến Hoạt Tính Enzyme

Hoạt tính protease bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH và nhiệt độ. Mỗi enzyme có một pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu, tại đó nó hoạt động hiệu quả nhất. Việc khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính protease là rất quan trọng để xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme. Các thí nghiệm thường được thực hiện bằng cách ủ enzyme protease với cơ chất casein ở các pH và nhiệt độ khác nhau, sau đó đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến.

IV. Tối Ưu Hóa Sản Xuất Enzyme Protease Từ Bacillus 59

Để tối ưu hóa sản xuất enzyme protease từ Bacillus subtilis, cần xem xét nhiều yếu tố như thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc), và thời gian nuôi cấy. Việc bổ sung các nguồn carbon và nitrogen phù hợp vào môi trường nuôi cấy có thể làm tăng đáng kể sản lượng protease. Ngoài ra, việc sử dụng các phương pháp lên men tiên tiến như lên men bề mặt và lên men chìm cũng có thể cải thiện hiệu quả sản xuất enzyme.

4.1. Thành Phần Môi Trường Nuôi Cấy Tối Ưu Cho Bacillus Subtilis

Thành phần môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzyme protease từ Bacillus subtilis. Các nguồn carbon như glucose, sucrose, và tinh bột, và các nguồn nitrogen như casein, peptone, và bột đậu nành thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Việc tối ưu hóa tỷ lệ carbon/nitrogen (C/N) có thể làm tăng đáng kể sản lượng protease. Ngoài ra, việc bổ sung các ion kim loại như Mg2+ và Ca2+ cũng có thể cải thiện hoạt tính của enzyme.

4.2. Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Nuôi Cấy Đến Sản Lượng Protease

Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, tốc độ lắc, và thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sản lượng enzyme protease. Bacillus subtilis thường phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30-37°C và pH trung tính hoặc hơi kiềm. Tốc độ lắc cần được tối ưu hóa để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho sự phát triển của vi khuẩn và sản xuất enzyme. Thời gian nuôi cấy thường kéo dài từ 24 đến 72 giờ, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy.

4.3. Các Phương Pháp Lên Men Tiên Tiến Để Tăng Sản Lượng

Các phương pháp lên men tiên tiến như lên men bề mặt (SSF) và lên men chìm (SmF) có thể được sử dụng để tăng sản lượng enzyme protease. SSF sử dụng chất nền rắn như cám gạo hoặc bã mía, trong khi SmF sử dụng môi trường lỏng. SmF thường được ưa chuộng trong công nghiệp do dễ kiểm soát các điều kiện nuôi cấy và có thể sản xuất enzyme với số lượng lớn. Tuy nhiên, SSF có thể là một lựa chọn kinh tế hơn cho các ứng dụng quy mô nhỏ.

V. Ứng Dụng Protease Từ Bacillus Subtilis Trong Thực Tế 60

Enzyme protease từ Bacillus subtilis có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong công nghiệp thực phẩm, protease được sử dụng để cải thiện chất lượng bánh mì, làm mềm thịt, và sản xuất nước mắm. Trong công nghiệp tẩy rửa, protease kiềm được sử dụng để loại bỏ vết bẩn protein trên quần áo. Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong công nghiệp dược phẩm và y học để sản xuất các loại thuốc và chế phẩm hỗ trợ tiêu hóa.

5.1. Ứng Dụng Trong Công Nghiệp Thực Phẩm Đa Dạng

Enzyme protease từ Bacillus subtilis được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Chúng có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng bột mì và bánh mì bằng cách thủy phân gluten, làm mềm thịt bằng cách phá vỡ các liên kết collagen, và sản xuất nước mắm bằng cách thủy phân protein cá. Protease cũng có thể được sử dụng để sản xuất phô mai và các sản phẩm sữa khác.

5.2. Vai Trò Quan Trọng Trong Công Nghiệp Tẩy Rửa

Protease kiềm từ Bacillus subtilis là một thành phần quan trọng trong nhiều loại bột giặt và nước giặt. Chúng có khả năng thủy phân các vết bẩn protein trên quần áo, như vết máu, sữa, và trứng. Protease giúp loại bỏ các vết bẩn cứng đầu và làm cho quần áo sạch hơn. Protease kiềm hoạt động hiệu quả ở pH cao, phù hợp với điều kiện giặt tẩy.

5.3. Ứng Dụng Tiềm Năng Trong Dược Phẩm Y Học

Enzyme protease có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp dược phẩm và y học. Chúng có thể được sử dụng để sản xuất các loại thuốc điều trị các bệnh liên quan đến tiêu hóa, như bệnh xơ nang và bệnh viêm tụy. Protease cũng có thể được sử dụng để làm tan cục máu đông và hỗ trợ quá trình phục hồi sau phẫu thuật. Ngoài ra, protease còn có tiềm năng trong điều trị ung thư.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Enzyme Protease 55

Nghiên cứu về enzyme protease từ Bacillus subtilis đã mang lại nhiều kết quả quan trọng và ứng dụng thực tiễn trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức và cơ hội để tiếp tục nghiên cứu và phát triển. Các hướng nghiên cứu tiềm năng bao gồm cải thiện hiệu quả sản xuất enzyme, tối ưu hóa các điều kiện hoạt động của enzyme, và khám phá các ứng dụng mới của enzyme trong các lĩnh vực như năng lượng sinh học và xử lý chất thải.

6.1. Thách Thức Cơ Hội Nghiên Cứu Protease Bacillus Subtilis

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về enzyme protease từ Bacillus subtilis, vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Một trong những thách thức lớn nhất là cải thiện hiệu quả sản xuất enzyme để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Ngoài ra, cần phải nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và cơ chế hoạt động của enzyme để tối ưu hóa các điều kiện hoạt động và mở rộng các ứng dụng của enzyme.

6.2. Các Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Trong Tương Lai

Các hướng nghiên cứu tiềm năng trong tương lai bao gồm phát triển các phương pháp lên men mới để tăng sản lượng enzyme, sử dụng kỹ thuật protein engineering để cải thiện tính ổn định và hoạt tính của enzyme, và khám phá các ứng dụng mới của enzyme trong các lĩnh vực như năng lượng sinh học và xử lý chất thải. Ngoài ra, cần phải tập trung vào việc phát triển các quy trình sản xuất enzyme bền vững và thân thiện với môi trường.

6.3. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Enzyme Protease

Nghiên cứu về enzyme protease từ Bacillus subtilis có tầm quan trọng lớn đối với nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Việc hiểu rõ hơn về cấu trúc, cơ chế hoạt động, và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease sẽ giúp chúng ta phát triển các ứng dụng mới và cải thiện các ứng dụng hiện có của enzyme. Điều này sẽ góp phần vào sự phát triển kinh tế và xã hội bền vững.