Khảo Sát Một Số Tính Chất Của Protease Từ Trùn Quế (Perionyx Excavatus)

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu công nghệ sinh học thu nhận và khảo sát một số tính chất của protease từ trùn quế perionyx excavatus, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên

• Tác giả: Trương Thị Thùy Liên
• Người hướng dẫn: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
• Trường học: Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP. HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Tính Chất Protease Từ Trùn Quế (Perionyx Excavatus)
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Trùn quế
• 1.2. Đặc tính sinh học
• 1.3. Sự sinh sản và phát triển
• 1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng trùn quế
• 1.5. Tổng quan về protease
• 1.5.1. Giới thiệu chung
• 1.5.2. Phân loại protease
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp phân tích
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Khảo sát thông số ban đầu của dung dịch trùn quế
• 3.2. Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động protease trong quá trình tự phân
• 3.3. Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến việc thu nhận protease
• 3.4. Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm (phần mềm Design Expert 8.2) của giai đoạn tự phân
• 3.5. Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm (phần mềm Design Expert 8.2) của giai đoạn thu nhận protease
• 3.6. Khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH đến protease trùn
• 3.6.1. Khảo sát nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đến hoạt tính protease
• 3.6.2. Khảo sát nhiệt độ phản ứng đến độ bền protease
• 3.6.3. Khảo sát pH ảnh hưởng đến hoạt tính protease
• 3.6.4. Khảo sát pH ảnh hưởng đến độ bền hoạt tính protease
• 3.7. Tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel
• 3.8. Cố định protease bằng phương pháp CLEA
• 3.9. Kết luận và kiến nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về khảo sát tính chất protease từ trùn quế

Khảo sát tính chất protease từ trùn quế (Perionyx Excavatus) là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong công nghệ sinh học. Protease là enzyme có khả năng thủy phân protein thành các amino acid, đóng vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình sinh học. Trùn quế, với hàm lượng đạm cao và khả năng sinh sản nhanh, đã trở thành nguồn nguyên liệu quý giá cho việc sản xuất enzyme này. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tính chất enzyme mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.

1.1. Đặc điểm sinh học của trùn quế và protease

Trùn quế (Perionyx Excavatus) có kích thước nhỏ, sống trong môi trường ẩm ướt và có khả năng sinh sản nhanh. Enzyme protease từ trùn quế có khả năng chịu nhiệt và hoạt động tốt ở pH trung tính, giúp thủy phân protein hiệu quả. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có thể được thu nhận và tinh sạch để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

1.2. Tầm quan trọng của protease trong công nghiệp

Protease được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và nông nghiệp. Enzyme này không chỉ giúp cải thiện chất lượng sản phẩm mà còn tăng cường khả năng tiêu hóa cho động vật. Việc khai thác protease từ trùn quế có thể giảm chi phí sản xuất và nâng cao giá trị dinh dưỡng cho thức ăn chăn nuôi.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu protease từ trùn quế

Mặc dù trùn quế là nguồn cung cấp enzyme tiềm năng, nhưng việc thu nhận và tối ưu hóa hoạt động của protease vẫn gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như nhiệt độ, pH và thời gian phản ứng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất enzyme. Nghiên cứu cần phải tìm ra các điều kiện tối ưu để đảm bảo hoạt động của protease đạt hiệu quả cao nhất.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của protease. Nghiên cứu cho thấy enzyme này hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 45°C và pH 6. Việc điều chỉnh các yếu tố này có thể giúp tối ưu hóa hoạt động của enzyme trong quá trình thu nhận.

2.2. Thách thức trong việc thu nhận protease

Quá trình thu nhận protease từ trùn quế gặp khó khăn do sự biến đổi của enzyme trong môi trường. Việc sử dụng các phương pháp tối ưu hóa như Design Expert có thể giúp cải thiện hiệu suất thu nhận và bảo tồn hoạt tính của enzyme trong thời gian dài.

III. Phương pháp thu nhận và khảo sát tính chất protease

Để thu nhận protease từ trùn quế, nghiên cứu đã áp dụng các phương pháp như tủa bằng ammonium sulfate và sắc ký lọc gel. Các phương pháp này giúp tách biệt và tinh sạch enzyme, từ đó khảo sát các tính chất hoạt động của protease. Kết quả cho thấy enzyme có hoạt tính cao và ổn định trong điều kiện nhất định.

3.1. Quy trình thu nhận protease từ trùn quế

Quy trình thu nhận bao gồm các bước như thu hoạch trùn quế, chiết xuất enzyme và tinh sạch bằng sắc ký. Các điều kiện như tỷ lệ dịch trùn và dung môi cũng được tối ưu hóa để đạt được hoạt tính enzyme cao nhất.

3.2. Phân tích tính chất enzyme sau thu nhận

Sau khi thu nhận, protease được phân tích để xác định hoạt tính và độ bền. Kết quả cho thấy enzyme có khả năng hoạt động tốt trong nhiều điều kiện khác nhau, mở ra cơ hội ứng dụng trong thực tiễn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protease từ trùn quế

Protease từ trùn quế có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. Enzyme này không chỉ giúp cải thiện chất lượng thức ăn chăn nuôi mà còn có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng. Việc khai thác enzyme này có thể mang lại lợi ích kinh tế lớn cho người nông dân và doanh nghiệp.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Protease từ trùn quế có thể được sử dụng để cải thiện khả năng tiêu hóa của động vật, từ đó tăng trưởng và sản lượng chăn nuôi. Việc bổ sung enzyme này vào thức ăn giúp giảm chi phí và nâng cao hiệu quả sản xuất.

4.2. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Enzyme protease có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng và hương vị. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có khả năng thủy phân protein hiệu quả, tạo ra các peptide có lợi cho sức khỏe.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu protease từ trùn quế

Nghiên cứu về protease từ trùn quế (Perionyx Excavatus) đã chỉ ra tiềm năng lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực. Việc tối ưu hóa quy trình thu nhận và khảo sát tính chất enzyme sẽ mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong thực tiễn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy protease từ trùn quế có hoạt tính cao và ổn định trong nhiều điều kiện. Việc thu nhận enzyme này có thể được tối ưu hóa để đạt hiệu suất tốt nhất.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ protease, cũng như ứng dụng enzyme này trong các lĩnh vực khác nhau. Việc khai thác triệt để tiềm năng của trùn quế sẽ mang lại lợi ích kinh tế lớn cho cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trùn quế (Perionyx excavatus) là loài giun đất có giá trị sinh học cao, được nuôi phổ biến tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và khu vực lân cận Thành phố Hồ Chí Minh. Với hàm lượng đạm cao, trùn quế không chỉ góp phần cải tạo đất mà còn là nguồn nguyên liệu quý giá để chiết xuất enzyme protease phục vụ nhiều ứng dụng công nghiệp và nông nghiệp. Enzyme protease từ trùn quế có khả năng thủy phân protein mạnh mẽ, thuộc nhóm serin protease, có tính chịu nhiệt và bền pH kiềm, phù hợp cho các quy trình sinh học trong điều kiện khắc nghiệt.

Nghiên cứu này nhằm thu nhận và khảo sát một số tính chất của protease từ trùn quế trong quá trình tự phân ở điều kiện đơn giản, phù hợp với quy mô hộ gia đình nuôi trùn, không điều chỉnh nhiệt độ và pH. Mục tiêu cụ thể là tối ưu hóa điều kiện hoạt động và thu nhận protease, đồng thời khảo sát các đặc tính sinh học của enzyme thu được. Thời gian nghiên cứu kéo dài từ tháng 7/2014 đến tháng 5/2015 tại Phòng BioLab, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, TP. Hồ Chí Minh.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển sản phẩm enzyme thô từ trùn quế, giúp người nuôi trùn chủ động dự trữ và tăng thu nhập, đồng thời mở ra hướng ứng dụng enzyme protease trong sản xuất các chế phẩm giàu đạm phục vụ nông nghiệp và công nghiệp sinh học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình enzyme protease, đặc biệt tập trung vào nhóm serin protease – loại enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide thông qua cơ chế acyl hóa và khử acyl hóa. Các khái niệm chính bao gồm:

• Protease: enzyme thủy phân protein thành các amino acid hoặc peptide nhỏ, phân loại theo vị trí tác động (endopeptidase, exopeptidase) và theo nhóm chức hoạt động (serin, cysteine, metallo, aspartic protease).
• Tự phân enzyme (autolysis): quá trình enzyme tự thủy phân trong điều kiện môi trường nhất định, ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme.
• Phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme: bao gồm tủa bằng dung môi hữu cơ (aceton), sắc ký lọc gel để phân tách enzyme theo kích thước phân tử.
• Cố định enzyme bằng kỹ thuật CLEA (Cross-Linked Enzyme Aggregates): tạo khối enzyme không hòa tan bằng liên kết chéo glutaraldehyde, giúp tăng độ bền và khả năng tái sử dụng enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Trùn quế được lấy từ trại chăn nuôi An Phú, Củ Chi, TP. Hồ Chí Minh. Enzyme protease được thu nhận từ dịch chiết trùn quế trong quá trình tự phân.
• Phương pháp phân tích:
  • Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford và đo quang phổ UV-Vis.
  • Đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến, sử dụng casein làm cơ chất và đo sản phẩm thủy phân tyrosine.
  • Tối ưu hóa điều kiện tự phân và thu nhận enzyme bằng phần mềm Design Expert 8.2, sử dụng thiết kế quy hoạch thực nghiệm Central Composite Design với các biến chính là nồng độ pha loãng, thời gian tự phân, tỷ lệ dịch trùn-aceton và thời gian tủa.
  • Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel Bio Gel P-30.
  • Cố định enzyme bằng kỹ thuật CLEA với glutaraldehyde 25%, thời gian cố định 3 giờ.
• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 7/2014 đến tháng 5/2015, gồm các giai đoạn chuẩn bị mẫu, khảo sát đơn yếu tố, tối ưu hóa điều kiện, tinh sạch và cố định enzyme.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng và thời gian tự phân đến hoạt tính protease:

   • Hoạt tính protease cao nhất đạt 0.75 U/ml ở nồng độ pha loãng 15% sau 10 ngày tự phân.
   • Hoạt tính riêng protease đạt giá trị tối ưu 0.8 U/mg protein tại nồng độ pha loãng 13% và thời gian 10 ngày.
   • Qua tối ưu hóa bằng Design Expert, giá trị cực đại được xác định ở nồng độ pha loãng 13% và thời gian 11 ngày.

2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trùn và aceton, thời gian tủa đến thu nhận protease:

   • Hoạt tính protease thu nhận cao nhất là 16 U/mg protein tại tỷ lệ dịch trùn-aceton 1:2 (v/v) và thời gian tủa 120 phút.
   • Tỷ lệ aceton quá cao làm giảm hoạt tính do tủa các tạp chất không mong muốn.
   • Tối ưu hóa bằng phần mềm xác định tỷ lệ dịch trùn-aceton 1:2 và thời gian tủa 90 phút là điều kiện tối ưu.

3. Điều kiện hoạt động tối ưu của protease trùn quế:

   • Nhiệt độ tối ưu hoạt động enzyme là 45°C.
   • pH tối ưu là 6, enzyme có độ bền cao trong khoảng pH trung tính.
   • Enzyme duy trì hoạt tính ổn định trong thời gian 3 giờ ở nhiệt độ 45-50°C.

4. Tinh sạch và cố định enzyme:

   • Sắc ký lọc gel tách được hai loại protease với hoạt tính riêng lần lượt là 16 U/mg và một giá trị thấp hơn.
   • Enzyme cố định dạng CLEA với glutaraldehyde 25% và thời gian cố định 3 giờ cho phép tái sử dụng enzyme nhiều lần, giảm thiểu tự phân hủy enzyme.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy hoạt tính protease phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ pha loãng và thời gian tự phân, phù hợp với cơ chế enzyme tự phân giải trong điều kiện môi trường tự nhiên. Việc tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert giúp xác định chính xác điều kiện hoạt động tối ưu, tăng hiệu suất thu nhận enzyme. So sánh với các nghiên cứu trước đây về protease từ trùn đất Lumbricus rubellus và các serin protease khác, protease từ trùn quế có đặc tính chịu nhiệt và pH tương tự, phù hợp cho ứng dụng công nghiệp.

Phương pháp cố định enzyme bằng CLEA đã chứng minh hiệu quả trong việc tăng độ bền và khả năng tái sử dụng enzyme, giảm chi phí sản xuất. Các biểu đồ đường cong hoạt tính enzyme theo thời gian, nồng độ pha loãng và tỷ lệ dung môi có thể được trình bày để minh họa mối quan hệ này rõ ràng hơn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình tối ưu hóa thu nhận protease trong quy mô hộ gia đình:

   • Thực hiện tự phân trùn quế với nồng độ pha loãng 13% trong 11 ngày để đạt hoạt tính enzyme cao nhất.
   • Chủ thể thực hiện: Người nuôi trùn, thời gian áp dụng: ngay sau khi hoàn thành nghiên cứu.

2. Sử dụng tỷ lệ dịch trùn-aceton 1:2 và thời gian tủa 90 phút để thu nhận enzyme hiệu quả:

   • Giảm thiểu tạp chất và tăng hoạt tính enzyme thu nhận.
   • Chủ thể thực hiện: Nhà sản xuất enzyme, thời gian áp dụng: trong vòng 6 tháng.

3. Triển khai kỹ thuật cố định enzyme CLEA để tăng độ bền và tái sử dụng enzyme:

   • Giảm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả sử dụng enzyme trong công nghiệp.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp công nghệ sinh học, thời gian áp dụng: 1 năm.

4. Phát triển sản phẩm enzyme thô từ trùn quế phục vụ nông nghiệp và công nghiệp chế biến:

   • Tạo nguồn nguyên liệu enzyme ổn định, không phụ thuộc mùa vụ và thương lái.
   • Chủ thể thực hiện: Doanh nghiệp chế biến sinh học, thời gian áp dụng: 2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học:

   • Hiểu rõ về quy trình thu nhận, tinh sạch và cố định enzyme protease từ nguồn sinh học tự nhiên.
   • Áp dụng kiến thức vào các đề tài nghiên cứu enzyme và ứng dụng sinh học.

2. Người nuôi trùn quế và doanh nghiệp sản xuất enzyme:

   • Nắm bắt kỹ thuật tối ưu hóa thu nhận enzyme, nâng cao giá trị sản phẩm trùn quế.
   • Tăng hiệu quả kinh tế và phát triển sản phẩm mới.

3. Chuyên gia trong lĩnh vực công nghiệp chế biến thực phẩm và nông nghiệp:

   • Ứng dụng enzyme protease trong xử lý nguyên liệu, sản xuất phân bón hữu cơ giàu đạm.
   • Tối ưu hóa quy trình sản xuất sinh học.

4. Các nhà quản lý và hoạch định chính sách về phát triển công nghệ sinh học:

   • Đánh giá tiềm năng phát triển enzyme từ nguồn tài nguyên địa phương.
   • Hỗ trợ phát triển ngành công nghiệp enzyme bền vững.

Câu hỏi thường gặp

1. Protease từ trùn quế có đặc điểm gì nổi bật so với các nguồn enzyme khác?
   Protease từ trùn quế thuộc nhóm serin protease, có khả năng chịu nhiệt đến 45°C và hoạt động tối ưu ở pH 6, phù hợp với nhiều ứng dụng công nghiệp. Enzyme này có hoạt tính thủy phân protein mạnh và bền trong điều kiện tự nhiên.

2. Tại sao cần tối ưu hóa nồng độ pha loãng và thời gian tự phân trong thu nhận enzyme?
   Vì hoạt tính enzyme phụ thuộc vào nồng độ protein và thời gian tự phân, tối ưu hóa giúp đạt được hoạt tính riêng cao nhất, tránh hiện tượng enzyme bị ức chế hoặc tự phân hủy quá mức.

3. Phương pháp CLEA có ưu điểm gì trong cố định enzyme?
   CLEA tạo ra khối enzyme không hòa tan, tăng độ bền enzyme với nhiệt độ và pH, đồng thời cho phép tái sử dụng nhiều lần, giảm chi phí sản xuất và hạn chế tự phân hủy enzyme.

4. Có thể áp dụng quy trình thu nhận protease này trong quy mô công nghiệp không?
   Có thể, quy trình được thiết kế phù hợp với quy mô hộ gia đình nhưng có thể mở rộng quy mô với điều chỉnh thiết bị và điều kiện kiểm soát môi trường để đảm bảo hiệu quả và ổn định.

5. Enzyme protease thu nhận từ trùn quế có thể ứng dụng trong lĩnh vực nào?
   Enzyme này có thể ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, sản xuất phân bón hữu cơ, xử lý chất thải sinh học, và các quy trình sinh học cần thủy phân protein.

Kết luận

• Nghiên cứu đã xác định được điều kiện tối ưu cho hoạt động protease từ trùn quế là nồng độ pha loãng 13% và thời gian tự phân 11 ngày, với hoạt tính riêng cao nhất đạt 0.8 U/mg protein.
• Tỷ lệ dịch trùn-aceton 1:2 và thời gian tủa 90 phút là điều kiện tối ưu để thu nhận enzyme với hoạt tính riêng lên đến 16 U/mg protein.
• Protease trùn quế hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 45°C và pH 6, có độ bền cao trong điều kiện này.
• Kỹ thuật cố định enzyme CLEA giúp tăng độ bền và khả năng tái sử dụng enzyme, giảm thiểu tự phân hủy.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản phẩm enzyme thô từ trùn quế, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và ứng dụng trong công nghiệp sinh học.

Tiếp theo, cần triển khai thử nghiệm quy mô lớn và phát triển sản phẩm ứng dụng thực tế. Mời các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm hợp tác để phát huy tiềm năng của enzyme protease từ trùn quế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Lời mở đầu Trùn qué là loài sinh sản nhanh, dé dang thu hoạch. Trin lam tăng độ phì nhiêu của đất. Phân trùn góp phần làm giảm mức sử dụng phân hoá học, giúp cây trồng phát triển tốt, tăng khả năng chống sâu bệnh, giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu, nhờ đó bảo vệ được môi trường. Hiện nay, trùn qué (Perionyx excavatus) đã được nuôi phố biến ở các tỉnh đồng băng sông Cửu Long và các vùng lân cận Thành phố Hỗ Chí Minh, nhất là có hàm lượng đạm rất cao nên được xem là nguồn b6 sung đạm quý giá cho cây trồng, vật nuôi.

Một số nước ở Châu Á như nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc đã chiết xuất enzyme protease t trun c 6 khả năng thủy phân mạnh. Enzyme này thuộc nhóm serin protease có khả năng chịu nhiệt và bên ở pH kiêm. Chúng tôi đ thực hiện đ é tài “Thu nhận và khảo sát một số tinh chat của protease từ trim qué (Perionyx Excavatus) nhằm mục đích đánh giá hoạt động hệ protease có sẵn trong đường ruột trùn qué trong quá trình tự phân ở điều kiện đơn giản mức độ qui mô hộ gia đình nuôi trùn (không điều chỉnh nhiệt độ và pH) để có thé tạo ra sản phẩm thô để bán và dự trữ (tăng thu nhập, không phụ thuộc mùa vụ và thương lái), làm tiền đề cho việc sản xuất các sản phẩm giàu đạm. Nội dung nghiên cứu gồm: - Khảo sát điều kiện hoạt động của protease trong quá trình tự phân - Khao sat diéu kién thu nhan protease - Khao sat một sô tinh chat cua protease Phân 1: TÔNG QUAN 1.

Trùn quế Trun quê có hàm lượng đạm cao, sông va ân nau dưới các thảm thực vật day, dưới viên gạch, hòn đá, các mi éng gô hoặc ngay dưới lớp phân, rãnh m ớc cạnh chuông gia súc, gia cam. Phan loai: ¢ Ngành: Annelides ¢ Phân ngành: Clitellata ¢ Lớp: Olygochaeta ¢ Họ: Megascocidae ¢ Chi: Pheretima ¢ Loài: Perionyx excavatus Trùn qué là một trong những gidng trun đã được thuân hóa, nhập nội và dua vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ, dê sinh san, dé bat băng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch.1: Hình thái trùn quế 1. Đặc tính sinh học Trùn qué có kích thước tương đối nhỏ, thân hoi det, bề ngang của con trưởng thành có thể đạt 0,1 — 0,2 em, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dai nối với nhau bởi nhiêu dot, trên moi dot có một vành tơ.

- Co thể trùn có hình thon dài nỗi với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ. Trùn qué hô hấp qua da, chúng có kha năng hấp thu oxy va thai CO, trong môi trường nước. - Kich thước trùn qué trưởng thành từ 10 — 15 em, nước chiếm khoảng 80 — 85%, chất khô khoảng 15 — 20%. Hàm lượng các chất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau: Protein: 68 —70%, lipid: 7 — 8%, chất đường: 12 —14 %, tro 11 —12% - Hap thu O, va thai CO, trong môi trường nước.

Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac va ure. Dac tinh sinh ly - Trin qué rat nhạy cảm, chúng phan ứng mạnh với ánh sáng. nhiệt độ va biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn. Nhiệt độ thích hợp nhất với trùn qué nam trong khoảng từ 20 — 30°C, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh.

- Trin qué qué rất thích sống trong môi trường 4m ướt và có độ pH ồn định, thích hợp nhất vào khoảng 7. - Trin quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bat kỳ chất thải hữu cơ nào có thé phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm. Sự sinh sản và phát triển - Trin quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối 6n định và có độ âm cao như điều kiện của khu vực phía Nam. Từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hop có thé tạo ra từ 1.500 cá thé trong một năm.

- Trin qué là sinh vật lưỡng tinh, chúng có dai và các lỗ sinh dục năm ở phía đầu của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 — 20 trứng, mỗi kén có thé nở từ 2 — 10 con. - - Khi mới nở trùn con như dau kim có màu trang, dài khoảng 2 — 3mm, sau 5 — 7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một van đỏ thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 —30 ngay sau, chúng trưởng thành va bắt đầu xuất hiện đai sinh dục và chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản 1. Các nghiên cứu và ứng dụng trùn quế Các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu va chiết tách thành công từ trun đất (Lumbricus Rubellus) về lumbrokinase.

Một hướng nghiên cứu khác về sự ổn định và ứng dụng các serine protease của loài trùn Lumbricus Rubellus. Kết quả cho thay enzyme này 6n định trong dung dịch đệm Tris-HCI 100mM trong thời gian 5 năm ở nhiệt độ phòng và có khả năng chịu được các dung môi hữu cơ tốt, kế cả toluene va n-hexane và dich thủy phân chính protein của loài trùn đất này và tạo ra dung dịch đạm có thành phần tương tự như nước tương và được ứng dụng làm môi trường nuôi cây vi sinh vật. Tương tự những nghiên cứu trên, trùn quế ở Việt Nam theo nghiên cứu của PGS-TS Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự ở Viện Khoa học Và Công nghệ Việt Nam nói rằng loài Peryonix Excavatus chữa hàm lượng enzyme thủy phân cao hơn loài giun khác. Vi thé các tỉnh phía Nam và đồng bang sông Cửu Long tiến hành nuôi trên quy mô lớn dé cung cấp sinh khối trùn cho chăn nuôi và dich trùn dé bón cây.

Ngoài ra các tỉnh miền Tây sử dụng nguồn thức ăn trực tiếp từ trùn tươi cho tôm ở giai đoạn âu trùng, tăng sản lượng chăn nuôi. Phan Thị Bích Trâm, Duong Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm thi Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh tiễn hành “ Tinh sạch và khảo sát các đặc tính của serin protease từ Trùn Quế (2007).” Bước dau tinh sạch sơ bộ bang tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ 30-80%. Trong nghiên cứu tại đại học Huế (2012) về tạo dòng và phân tích trình tự serin protease của trùn qué Doan cDNA có kích thước 726 bp được tao dòng với vector pCR®2. Trinh tự nucleotide của cDNA được so sánh với trình tự của gen lumbrokinase của các loài giun dat Eisenia fetida, Lumbricus bimastus va Lumbricus rubellus có độ tương đồng lần lượt là 52/02%; 50,06% va 48,03%.11:16) Hiện nay người nuôi trùn và người sản xuất bị động trong việc tạo các sản phẩm từ trùn do nhiệt độ môi trường, lượng trùn khô ban dau, pH.

Vi thé dé người sản xuất tăng nguôn thu nhập cũng như chủ động việc dự trữ dịch trùn, dé tài đánh giá hệ protease trong quá trình tự phân, tối ưu hóa bằng phần mén dé dự đoán hoạt động enzyme qua phương tinh tối ưu, đồng thời thực hiện phương pháp có định CLEA dé hạn chế mức độ tư phân hủy của protease. Tổng quan về protease 1. Giới thiệu chung Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân có kha năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp. Protease là nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi trong cacthh v uc khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xả phòng.

Nguồn thu nhận protease vô cùng phong phú như thực vật, động vật và vi sinh vật. Phân loại protease 1. Protease được phán thành hai loại endopeptidase và exopeptidase Vi trí tac dong trên mach polypeptide, exopeptidase chia thành hai loại: - Aminopeptidase: thủy phân liên kết peptide đầu N tự do của chuỗi polypeptide giải phóng ra amino acid/ dipeptide hoặc tripeptide. - Cacboxypeptidase: thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide giải phóng ra amino acid/ dipeptide Động hoc của co chế xúc tac, endopeptidase chia thành bốn loại: (a) Serin protease: chữa nhóm —OH của gốc serin trung tâm hoạt động.

Là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật. Những enzyme này đều có chung một cơ chế phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): - Acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. - Khw acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phan tử H;O theo chiêu ngược lại của bước một. + Các loại serin protease thông dụng hiện nay - Trypsin: vị trí cat ở Arg, Lys có ở hệ thống tiêu hóa của động vật và một số loài khác - Chymotrypsin: vị trí cắt ở Tyr, Trp, Phe có ở hệ thống tiêu hóa của động vật và một số loài khác - Plasmin: vị trí cắt ở Arg, Lys có ở máu - Thrombin: vị trí cắt ở Arg có ở máu - Lys-C: vị trí cat Lys có ở Lysobacter enzymogene - Subtilisin: Tyr, Phe, Leu các chung Bacilli khác nhau - Cacboxypeptidase: vị trí cắt ở đầu C các amin có ở hệ tiêu hóa động vat.

6 Hie, SOT 56 ASP. we ={ năm rene eek ee | | ị ° — Na+ renOo—e '& ° H H N (1) o-" a Ba _-- 3 H ` H ——>- a o p. 9 comptex en—c —G =e —C-® "lệ 4 : Michee(ls complex sa 8U 1) — (2) SPY ves Sere, Hy, ‘in { A804; His, \ Ser Asp (3) - = = O—H en al Homo 1 + ! =: =—{ vân mm. O at Cc H;O | „ a Me " c—o s." "—c—o=® 4 H | Ï ( hở 3 L ° Acyl-erzyrrre intermediate Hình 1.2: Cac bước xúc tac co bản cua serin protease (b) Cysteine protease: chữa nhóm —SH trung tâm hoạt động.

Nhóm nay bao gồm các profease từ thực vật; một vài enzyme từ động vật và ký sinh trùng. Các enzyme này thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. (c) Metallo protease: được tìm thay ở vi khuẩn, nam mốc, thường hoạt động ở pH trung tính và hoạt động giảm mạnh khi có sự hiện diện của EDTA, có ion kim loại ở tâm hoạt động. (d) Aspartic protease: thuộc nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymotrypsin, renin; chứa nhóm COO’ ở tâm hoạt động.