CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu tạo của β-glucosidase Enzym β-glucosidase (EC.21), còn có các tên khác là cellobiase, gentiobiase, là enzym thuỷ phân các liên kết 1,4-β-D-glucozit ở phía tận cùng đầu không khử của chuỗi glucozit giải phóng ra β-D-glucose. Nhờ có phổ tác dụng rộng enzym này tác động không những trên các diglucozit, oligosaccarit mà còn trên cả các liên kết alkyl, aryl glucozit nên ngày nay β-glucosidase được sử dụng với nhiều mục đích và trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó hai lĩnh vực sử dụng β- glucosidase nhiều nhất là phân giải cellulose và công nghiệp thực phẩm.
Cấu trúc của β–glucosidase Những thông tin về cấu tạo của enzym này còn chưa đầy đủ. Dựa theo đặc tính và trình tự acid amin chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzym thủy phân cellulose được chia làm 3 nhóm Cel-1, Cel-2 và Cel-3. Trong đó β–glucosidase thuộc Cel-2, có khối lượng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do của Cel-2 chưa được xác định (Yamane ed al. Một vài β-glucosidase của Aspergillus là các glucoprotein chứa glucoamin hoặc manose.
Chẳng hạn β-glucosidase từ A.wentii chứa 22% hydratcacbon và do khoảng 910-1300 acid amin hợp thành, trong đó acid amin đầu tiên trong chuỗi là axit aspartic, đây cũng là axit chiếm phần lớn trong cấu trúc của enzym [28, 39,49]. Cho đến nay, các thông tin về các nhóm chức tham gia vào trung tâm hoạt động của enzym này đã được công bố rất nhiều, tuy vậy chúng cũng rất khác nhau và thay đổi tuỳ thuộc vào chủng giống và nguồn thu enzym. Một số công trình nghiên cứu cho thấy rằng, hoạt tính của β-glucosidase không bị ảnh hưởng bởi p-CMB hoặc DTT, là những chất kìm hãm đặc hiệu nhóm –SH, điều đó chứng tỏ trung tâm hoạt động của enzym không chứa nhóm này. Trong trường hợp β-glucosidase của Cladostorium resinae NK1 và A.ozyae[13] hoạt tính của enzym bị kìm hãm mạnh bởi một số ion kim loại (Ag+, Fe2+, Fe3+, P P P P P P 6 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan Mn2+, Hg2+, Zn2+, Cu2+.) chứng tỏ nhóm – SH có liên quan trong hoạt động xúc P P P P P P P P tác của enzym, mặc dù vậy năng lực xúc tác của chúng không bị ảnh hưởng bởi p- CMB hoặc DTT, do đó trong trường hợp này nhóm –SH chỉ có thể đóng vai trò làm ổn định cấu trúc lập thể của phân tử enzym.
Hai nhóm tryptophan và hystidin cũng tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động của một vài β-glucosidase này bởi chúng bị vô hoạt hoàn toàn khi xử lý với n-bromosuccinimid và diethylpyrocarbonat. Do đó có thể kết luận enzym này không chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động và không thuộc nhóm enzym kim loại. Theo nghiên cứu của Sanz - Aparicio J và cộng sự thì cấu trúc bậc 2 và bậc 4 của β-glucosidase từ vi khuẩn Bacillus polymyxa như hình 1.1: Cấu trúc bậc 2 của β-glucosidase của vi khuẩn Bacilluspolymyxa Hình 1.2: Cấu trúc bậc 4 của β-glucosidase từ vi khuẩn Bacilluspolymyxa 7 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan 1. Khối lượng phân tử Nhìn chung các β-glucosidase được sinh tổng hợp từ các nguồn và chủng loại khác nhau thì có khối lượng phân tử khác nhau.
Đối với enzym thực vật, qua một số nghiên cứu cho thấy khối lượng phân tử rất khác nhau, dao động từ 55–400 kDa và bao gồm các phần dưới đơn vị, đơn cử như khối lượng phân tử của β-glucosidase trong nhân hạt mơ đã được xác định vào khoảng 126 kDa [21] và bao gồm 2 dưới đơn vị, khối lượng phân tử của enzym β- glucosidase được tách từ hạt của cây gỗ hồng sắc (rosewood) được trồng ở Thái Lan có khối lượng phân tử là 330 kDa bao gồm 4-6 phần dưới đơn vị, mỗi phần dưới đơn vị có khối lượng phân tử là 66 kDa[32], còn enzym được tách chiết và tinh chế từ họ Citrus có phân tử lượng 55-64 kDa [12]. Khối lượng phân tử của β-glucosidase thu nhận từ nấm mốc thường nằm trong khoảng 39. Các kết quả nghiên cứu của Himmel và cộng sự cho thấy β-glucosidase của A.niger có khối lượng phân tử là 330 kDa bao gồm 3 dưới đơn vị có khối lượng khoảng 100 kDa [23]. Theo kết quả nghiên cứu của Galas E, Romanawska I cho thấy β-glucosidase của A.niger IBT-90 có khối lượng phân tử 200 kDa được tạo thành từ 2 dưới đơn vị 100 kDa.
Gần đây Christine và CS [13] đã tách được hệ β-glucosidase khác nhau từ chủng nấm mốc A.ozyzae CBZ -12559 nuôi trong môi trường lỏng có khối lượng phân tử khoảng 130 kDa. Cũng theo kết quả nghiên cứu của Arunik Sanyal và CS đã tách chiết được β-glucosidase ngoại bào từ A.japonicus có khối lượng phân tử > 240 kDa [9]. Các β-glucosidase từ nấm men có khối lượng phân tử rất khác nhau phụ thuộc vào chủng giống và điều kiện nuôi cấy, enzym từ Candida pelliculosa có khối lượng phân tử là 360 kDa bao gồm 4 phần dưới đơn vị với khối lượng là 90 kDa/phần dưới đơn vị [30] và β-glucosidase từ Piromyces.sp có khối lượng phân tử là 45.000Da, đây là monomer (có chứa 1 phần dưới đơn vị) [45]. Trong khi đó, khối lượng phân tử của một số vi khuẩn lại dao động trong khoảng hẹp 340-380 kDa, β-glucosidase từ Aureobasidium pullulans có phân tử lượng là 340 kDa, gồm 8 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan 2 phần dưới đơn vị có phân tử lượng như nhau vào khoảng 165 ka [10].
Theo nghiên cứu của Rodionova và CS thì khối lượng phân tử của β-glucosidase từ Trichoderma longibrachiatum khoảng 350 kDa chứa ít nhất là 2 phần dưới đơn vị [41]. β-glucosidase từ Botryodiplodia 13theobromae có khối lượng phân tử từ 350- 38 kDa bao gồm 8 phần dưới đơn vị [13]. Cơ chế xúc tác của β-glucosidase Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(14) glucozit. Nói T 01 chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccarit này cần có các enzymcellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt.
Hệ enzym thủy phân cellulose gồm 3 loại hoạt tính enzym:endoglucanase- EG (EC.4), T 01 exoglucanase- CBH (EC 3.91) và β-glucosidase (EC 3. Ba enzym này xúc tác cho các giai đoạn nối tiếp nhau nhưng phụ thuộc lẫn nhau của quá trình thuỷ phân cellulose đến glucose.Nhiều tác giả cho rằng enzym cellobiasenày có vai trò rất quan trọng khi đường hoá cellulose.Bởi lẽ khi cellobiose không được phân giải kịp thời, tích tụ lại sẽ tạo ra cơ chế kìm hãm ngược đối với endoglucanase và exoglucanase. Vì vậy tốc độ chung của cả quá trình phụ thuộc chặt chẽ vào hoạt độ của β-glucosidase. CBH Cellulose tinh thể EG + CBH Cellobiose Glucose EG β-glucosidase Cellulose vô định hình và EG hoặc CBH biến tính Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát của các hướng thuỷ phân cellulose 9 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan Enzym β-glucosidase thủy phân các liên kết 1,4-β-glucozit ở phía tận cùng đầu không khử của chuỗi glucozit nên có khả năng thuỷ phân cellobiose và nhiều loại saccarit như CMC, Salisin, β-D-Galactozit.
cũng như các aryl, alkyl glucozit như p-NPG, p-Nitrophenyl-β-D-Xylozit.4: Cơ chế quá trình thủy phân cellulose bởi hệ enzym cellulase Đối với quá trình thủy phân, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và T 01 cellulase: Lignocellulose sau khi tiến hành tiền xử lý bằng các phương pháp nhằm T 01 tạo điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân cellulose qua việc phá vỡ sự bảo vệ của lignin xung quanh cellulose. Phản ứng thủy phân cellulose thành glucose thì cần có mặt của cellulase, một phức hệ enyme có khả năng thủy phân cả cellulose lẫn hemicellulose. Mỗi dạng enzym trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucozit theo những cách khác nhau. Ban đầu endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do.
Sau đó, exoglucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các 10 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan cellooligosacharit mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiose sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose. Nhiều tài liệu đã khẳng định vai trò rất quan trọng của enzym cellobiose trong đường hoá cellulose.
Bởi lẽ khi cellobiose không được phân giải kịp thời, tích tụ lại sẽ tạo ra cơ chế kìm hãm ngược đối với endoglucanase và exoglucanase. Vì vậy tốc độ chung của cả quá trình phụ thuộc chặt chẽ vào hoạt độ của β-glucosidase. Đối với nhóm aryl glucozit như p-NPG, p-Nitrophenyl-β-D-cylozit. Enzym β-glucosidase trực tiếp phân cắt các liên kết β-glucozide tạo ra p-nitropenol Hình 1.5: Sơ đồ thủy phân pNPG của β-glucosidase Đối với các tiền chất thơm, những nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng sự thuỷ phân các hợp chất này bởi β-glucosidase gồm hai bước: - Enzym α-L-arabinofuranosidase hoặc α-L-rhamnosidase sẽ phá huỷ một phần liên kết nội đường, giải phóng aglycol hoặc các monoterpenyl β-D-glucozit tương ứng.
- Enzym β-glucosidase sẽ tiếp tục thuỷ phân nốt phần liên kết còn lại, tác dụng lên các monoterpenyl-β-D-glucozit vừa được tạo ra giải phóng các cấu tử thơm dạng monoterpen [29,56]. 11 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan Hình 1.6: Sơ đồ thủy phân Naringin bởi β-glucosidase 1. Một vài đặc tính của β-glucosidase 1. Tính đặc hiệu cơ chất Mỗi enzym chỉ có khả năng xúc tác làm chuyển hoá một cơ chất hoặc một số cơ chất nhất định cũng như một kiểu nối hoá học nhất định.
Đồng thời ái lực của enzym đối với mỗi cơ chất phụ thuộc vào bản chất của nguồn thu nhận chúng. Enzym β-glucosidase là enzym thuỷ phân có khả năng phân cắt các liên kết β-1,4- glucozit gốc tận cùng không khử β-D-glucozit giải phóng ra D-glucose [39]. Enzym này có phổ tác động khá rộng. Đây là yếu tố quyết định sự có mặt của một số enzym khác trong hệ, làm phong phú thêm khả năng tác động của β-glucosidase.
Ngoài khả năng thuỷ phân cellobiose, enzym β-glucosidase còn có thể thuỷ phân nhiều loại saccarit khác như CMC, Salisin, β-D-Galactozit. và các Cyanogen glycozit như Amygdalin, prunasin, linamarin (có nhiều trong thực vật), cũng như các aryl, alkyl glucozit như p-NPG, p-Nitrophenyl-β-D-Xylozit. Thông thường β-glucosidase thu được từ vi khuẩn hoạt động mạnh trên cả cellobiose cũng như các aryl glucozit. Theo kết quả nghiên cứu của Badal.Saha 12 Nguyễn Vũ Hoài Phương Đại học Bách Khoa Hà Nội Tổng quan và CS [10] thì enzym β-glucosidase được tách chiết và tinh chế từ chủng vi khuẩn Aureobasidium pullulans có cơ chất thích hợp nhất là cellobiose và p-NPG, sau đó là với lactose và có hoạt lực thấp nhất với para-nitrophenyl-β-D-cellobiozit, ngoài ra nó có khả năng thuỷ phân rất nhiều các cellooligosacharit.
Như vậy, enzym β- glucosidase từ Aureobasidium pullulans thuộc nhóm enzym có khả năng thuỷ phân cả aryl-β-D-glucozit và cellooligosaccarit [10]. Các β-glucosidase từ nấm sợi hoạt động mạnh trên cellobiose, các saccarit và một số aryl glucozit, ngoài ra nó còn hoạt động trên một số cơ chất khác có mặt trong quá trình công nghệ sản xuất nước quả và rượu vang.