Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trên lúa hiện nay, xuất hiện phổ biến ở nhiều quốc gia trồng lúa trên thế giới trong đó có Việt Nam. Bệnh gây hại chủ yếu ở vụ lúa Mùa khi điều kiện thời tiết ẩm ƣớt, nhiều sƣơng mù và độ ẩm không khí cao. Thiệt hại do bệnh bạc lá lúa gây ra đã làm ảnh hƣởng nặng nề đến sản lƣợng lúa gạo vào những năm xảy ra dịch bệnh.
Ở một số tỉnh phía Bắc nƣớc ta, TBR225 là giống lúa chủ lực có diện tích canh tác chiếm tỉ trọng khá lớn trong sản xuất lúa với nhiều ƣu điểm nhƣ: chất lƣợng gạo thơm, ngon và cho năng suất khá cao. Tuy nhiên, nhƣợc điểm lớn nhất của giống lúa này là mẫn cảm với bệnh bạc lá, dẫn đến năng suất bị ảnh hƣởng nghiêm trọng khi xảy ra dịch bệnh. Vì vậy, bên cạnh những biện pháp phòng trừ bệnh nhƣ thay đổi phƣơng thức canh tác, sử dụng thuốc hóa học hay biện pháp khống chế sinh học, nghiên cứu nâng cao khả năng kháng bệnh bạc lá trên giống lúa này là yêu cầu cấp thiết, giúp đảm bảo tính bền vững và hiệu quả của sản xuất lúa gạo ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Cho đến nay, cùng với những phƣơng pháp lai tạo truyền thống, các phƣơng pháp chọn giống chính xác mới dựa trên công nghệ sinh học hiện đại, bao gồm công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9), đang dần chứng minh đƣợc tính hiệu quả vƣợt trội trong các chƣơng trình chọn/tạo giống cây trồng kháng bệnh, có năng suất và chất lƣợng cao.
Công nghệ CRISPR/Cas9 là một phát minh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với công nghệ sinh-y học nói chung và sinh học nông nghiệp nói riêng. Công nghệ này cho phép tạo đột biến có lợi ở bất cứ vị trí nào trong hệ gen một cách đơn giản và nhanh chóng; vì vậy đƣợc xem là một bƣớc phát triển mang tính đột phá trong thao tác di truyền trên hệ gen sinh vật, đặc biệt đối với các ứng dụng cải tiến tính trạng nông sinh học cây trồng thông qua kiểm soát biểu hiện của (các) gen liên quan. Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mới ra đời gần 10 năm nhƣng đã có những bƣớc phát triển vƣợt bậc, đƣợc áp dụng rộng khắp trong 9 các nghiên cứu về cải tiến tính trạng nông sinh học của nhiều loại cây trồng nông nghiệp có giá trị quan trọng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng, cam, cà chua, thuốc lá… Cơ chế gây bệnh bạc lá của vi khuẩn Xoo đã đƣợc chứng minh là có liên quan chặt chẽ với các TALE (Transcription activator-like effector) thuộc nhóm protein tiết loại III đặc trƣng của vi khuẩn Xoo. TALE sau khi đi vào tế bào cây chủ sẽ hoạt động nhƣ một nhân tố phiên mã, liên kết với vùng promoter của gen nhiễm/gen mẫn cảm (susceptiblilty gene – gen S) và hoạt hóa sự biểu hiện của chúng, tạo điều kiện cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn hay phát triển triệu chứng bệnh.
Một số gen thuộc họ SWEET (Sugar will eventually be exported transporter) - mã hóa protein vận chuyển đƣờng ở lúa đã đƣợc chứng minh là gen S đối với vi khuẩn Xoo, bao gồm OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14. Nhiều đột biến (tự nhiên hay nhân tạo) xuất hiện tại vị trí TALE liên kết với promoter (gọi là EBE - effector binding element) của các gen S nhƣ vậy đã tạo nên tính kháng vi khuẩn Xoo cho cây lúa. Thực tế này đã cho thấy tiềm năng to lớn của việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để can thiệp vào các gen S thuộc họ OsSWEET nhằm cải tiến tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa phổ biến trong sản xuất nhƣ giống TBR225. Với mục tiêu cải tiến tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa TBR225 bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dựa trên các nghiên cứu về tƣơng tác phân tử giữa vi khuẩn Xoo và cây lúa, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tăng cƣờng tính kháng bệnh bạc lá trên giống lúa TBR225 bằng công nghệ CRISPR/Cas9”.
Mục tiêu nghiên cứu 2. Mục tiêu chung Tăng cƣờng tính kháng bệnh bạc lá của giống lúa TBR225 thông qua sử dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để gây đột biến chính xác các gen S có liên quan đến sự xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo. Mục tiêu cụ thể Phân lập, nghiên cứu TALome và xác định đƣợc cơ chế gây bệnh trên giống lúa TBR225 của vi khuẩn Xoo thu thập từ các tỉnh phía Bắc Việt Nam. 10 Thiết kế đƣợc cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET trên giống lúa TBR225.
Tạo đƣợc các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen mang đột biến có khả năng kháng vi khuẩn Xoo Việt Nam. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là cây lúa TBR225 và vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xoo ở Việt Nam (VXO) Các nội dung nghiên cứu chính: Phân lập và nghiên cứu cơ chế gây bệnh của quần thể Xoo ở phía Bắc Việt Nam trên giống lúa TBR225. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET. Tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 (SW14-TBR).
Tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa đồng thời hai promoter OsSWEET13 (SW13-TBR) và SW14-TBR. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản (cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử của vi khuẩn Xoo trên cây lúa TBR225) theo định hƣớng ứng dụng (cải tiến tính kháng bệnh bạc lá của giống lúa TBR225). Kết quả luận án đã cho thấy sự đa dạng của quần thể Xoo Việt Nam, ít nhất là về hệ protein tiết loại III TALE liên quan đến độc tính của vi khuẩn trên cây lúa. Kết quả nghiên cứu là nguồn tài liệu tham khảo tốt cho các nghiên cứu về đa dạng sinh học quần thể Xoo Việt Nam.
Trên cơ sở xác định OsSWEET13 và OsSWEET14 của giống lúa TBR225 là hai gen S chính của các isolate VXO, nghiên cứu đã gây đột biến các trình tự EBE PthXo2(A) và AvrXa7 nằm trên hai gen này bằng công nghệ CRISPR/Cas9, kết quả thu đƣợc một số dòng lúa mang đột biến đơn gen và đa gen bất hoạt khi lây nhiễm với các isolate VXO đại diện. Nhƣ vậy, luận án đã thành công trong việc sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tạo đột biến chính xác trên giống lúa TBR225 của Việt Nam. Đây là nguồn tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu liên quan đến chỉnh sửa gen bằng công nghệ CRISPR/Cas9. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên tạo ra đƣợc các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen kháng phổ rộng với các isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá đại diện.
Dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen kháng bạc lá phổ rộng này nếu phát triển có thể góp phần nâng cao năng suất cho giống lúa chủ lực ở phía Bắc Việt Nam nói riêng và cải thiện đời sống ngƣời dân nói chung. Đây là một trong số ít những nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 vào cải tạo tính kháng bệnh trên giống lúa thuần ở Việt Nam. Thành công của luận án đã mở ra triển vọng rất lớn về hƣớng nghiên cứu chỉnh sửa gen nhằm nâng cao năng suất, tính chống chịu và chất lƣợng của các giống cây trồng khác ở Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ VI KHUẨN XOO 1. Giới thiệu chung về bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá là một trong những bệnh hại lúa đƣợc phát hiện từ rất sớm, các nghiên cứu cho thấy nó xuất hiện đầu tiên ở Fukuoka, Nhật Bản vào năm 1884, sau đó dần lan rộng ra các vùng trồng lúa của nƣớc này. Tại Trung Quốc, bệnh đƣợc ghi nhận sớm nhất vào những năm 1930 và phát triển rộng khắp mƣời tỉnh khác vào cuối những năm 1950. Tuy nhiên, bệnh bạc lá chƣa thực sự đƣợc lƣu tâm cho đến những năm 1970, khi có sự mở rộng gieo trồng các giống lúa lai và lúa cao sản, cũng nhƣ sử dụng một lƣợng lớn phân đạm vào canh tác.
Bệnh bắt đầu phổ biến ở các nƣớc châu Á khác trong thời kỳ này, bao gồm Ấn Độ, Philippines, Nepal, Indonesia, Sri Lanka và bắt đầu trở thành đại dịch ảnh hƣởng đến nông nghiệp toàn cầu. Sau đó, bệnh cũng xuất hiện và gây hại cho các vùng trồng lúa ở Úc, Hoa Kỳ và các nƣớc Tây Phi. Đến nay, bệnh bạc lá đã có mặt ở hầu hết các quốc gia trồng lúa trên thế giới [30, 91]. Thiệt hại sản lƣợng lúa do bệnh bạc lá gây ra lên đến 26% đối với các giống lúa mẫn cảm với bệnh.
Vào những năm xảy ra dịch bệnh, Ấn Độ sụt giảm đến 60% sản lƣợng lúa; con số này ở Philippines là 22,5% [30]. Bệnh không chỉ ảnh hƣởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lƣợng gạo do tác động đến các quá trình chuyển hóa trong cây (hô hấp, quang hợp.) ở giai đoạn trổ bông, làm tăng tỉ lệ hạt lép, hạt dễ dập nát khi xay [63]. Riêng ở Việt Nam, theo số liệu Cục Bảo vệ thực vật, diện tích lúa nhiễm bệnh bạc lá năm 2013 là 72.343 ha; năm 2016 con số này lên đến 149.045 ha bị nhiễm nặng. Năm 2018, diện tích nhiễm bệnh bạc lá là 24.542 ha trong đó nhiễm nặng trên 1.592 ha [http://ppd.
Các số liệu thống kê này cho thấy mặc dù đã đƣợc phát hiện từ lâu nhƣng cho đến nay, bệnh bạc lá vẫn đƣợc xếp là bệnh hại nghiêm trọng trong sản xuất lúa gạo không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới Ghi chú: Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới năm 2018. Vị trí phân bố bệnh bạc lá lúa được thể hiện bằng chấm màu vàng [62]. Nhiều nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa đã bắt đầu đƣợc thực hiện từ những năm 1901 nhƣng đến năm 1922 các nhà khoa học mới phát hiện đƣợc nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn.
Năm 1990, tác nhân gây bệnh bạc lá lúa đƣợc xác định là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Bệnh bạc lá còn có một số tên gọi khác nhƣ bệnh BLB (bacterial leaf blight), bệnh kresek [114]. Xoo xâm nhiễm vào cây lúa thông qua các thủy khổng (hydathode) nằm ở ngọn và rìa lá. Vi khuẩn nhân lên trong khoảng gian bào của tế bào biểu mô có thành mỏng, sau đó đi vào mạch xylem, di chuyển dọc theo gân lá và lan rộng trong toàn bộ cây [73].
Xoo cũng có thể xâm nhập trực tiếp vào xylem tại các vết thƣơng ở lá và rễ.