Nghiên Cứu Tăng Cường Tính Kháng Bệnh Bạc Lá Trên Giống Lúa TBR225 Bằng Công Nghệ CRISPR/Cas9

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để tăng cường tính kháng bệnh bạc lá trên giống lúa TBR225, mở ra hướng đi mới cho nông nghiệp.

• Tác giả: Trần Lan Đài
• Người hướng dẫn: GS. Phạm Xuân Hội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tăng Cường Tính Kháng Bệnh Bạc Lá Trên Giống Lúa TBR225 Bằng Công Nghệ CRISPR/Cas9
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1.2. DANH MỤC BẢNG
• 1.3. DANH MỤC HÌNH
• 1.4. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.4.1. BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ VI KHUẨN XOO
• 1.5. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Mẫu thực vật. Chủng vi sinh vật
• 1.5.2. Vector và oligonucleotide
• 1.5.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.3.1. Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA
• 1.5.3.2. Nhân dòng và giải trình tự đoạn DNA đích
• 1.5.3.3. Gieo trồng lúa, nuôi cấy vi khuẩn và lây nhiễm bệnh nhân tạo
• 1.5.3.4. Phân lập và định danh vi khuẩn Xoo
• 1.5.3.5. Phân tích TALome của vi khuẩn Xoo
• 1.5.3.6. Thiết kế trình tự sgRNA
• 1.5.3.7. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện
• 1.5.3.8. Nuôi cấy in vitro và chuyển gen vào lúa TBR225
• 1.5.3.9. Phân tích các dòng lúa chuyển gen/chỉnh sửa gen
• 1.5.3.10. Xử lý số liệu thống kê
• 1.6. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 1.6.1. PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA QUẦN THỂ XOO Ở PHÍA BẮC VIỆT NAM TRÊN GIỐNG LÚA TBR225
• 1.6.1.1. Phân lập Xoo từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam
• 1.6.1.2. Nghiên cứu tƣơng tác phân tử giữa VXO và giống lúa TBR225
• 1.6.2. THIẾT KẾ CẤU TRÚC T-DNA CHỈNH SỬA PROMOTER OsSWEET
• 1.6.2.1. Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa đa gen
• 1.6.2.2. Thiết kế vector mang cấu trúc biểu hiện sgRNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR
• 1.6.3. TẠO DÒNG LÚA TBR225 CHỈNH SỬA SW14-TBR
• 1.6.3.1. Tối ƣu quy trình chuyển gen vào lúa TBR225 thông qua A. tumefaciens mang vector chỉnh sửa SW14-TBR
• 1.6.3.2. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-TBR vào giống lúa TBR225
• 1.6.3.3. Nghiên cứu kiểu gen của cây lúa TBR225 tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW14-TBR
• 1.6.3.4. Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa TBR225 chuyển vector chỉnh sửa SW14-TBR T1
• 1.6.3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của đột biến SW14-TBR đến kiểu hình của dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen T2
• 1.6.4. TẠO DÒNG LÚA TBR225 CHỈNH SỬA SW13-TBR VÀ SW14-TBR
• 1.6.4.1. Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR vào giống lúa TBR225
• 1.6.4.2. Nghiên cứu kiểu gen của cây lúa TBR225 tái sinh đƣợc chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR
• 1.6.4.3. Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa SW13-TBR và SW14-TBR T1
• 2. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• 3. TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu CRISPR Cas9 Về Bệnh Bạc Lá Lúa TBR225

Nghiên cứu tập trung vào việc tăng cường tính kháng bệnh bạc lá trên giống lúa TBR225 sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9. Bệnh bạc lá, do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh hại lúa nghiêm trọng nhất, ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng. Giống lúa TBR225, mặc dù có nhiều ưu điểm, lại mẫn cảm với bệnh này. Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 hứa hẹn mang lại giải pháp hiệu quả, cho phép tạo ra các giống lúa kháng bệnh một cách chính xác và nhanh chóng. Luận án này đi sâu vào cơ chế tương tác giữa Xoo và lúa TBR225, từ đó thiết kế các biện pháp can thiệp di truyền hiệu quả. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc đảm bảo an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững.

1.1. Bệnh Bạc Lá Lúa Thách Thức và Tác Động Đến Nông Nghiệp

Bệnh bạc lá lúa là một vấn đề toàn cầu, gây thiệt hại đáng kể cho sản lượng lúa. Bệnh do vi khuẩn Xoo gây ra, lây lan nhanh chóng trong điều kiện ẩm ướt và ảnh hưởng đến quá trình quang hợp của cây lúa. Theo thống kê, thiệt hại có thể lên đến 26% ở các giống mẫn cảm. Tại Việt Nam, diện tích lúa nhiễm bệnh có thể lên đến hàng chục nghìn ha, ảnh hưởng lớn đến kinh tế của người nông dân. Biện pháp phòng trừ hiện tại còn nhiều hạn chế, do đó cần có các giải pháp di truyền học tiên tiến hơn. Nghiên cứu khoa học đã chỉ ra tiềm năng của CRISPR/Cas9 trong việc tạo ra giống lúa kháng bệnh.

1.2. Giống Lúa TBR225 Tiềm Năng và Điểm Yếu Trong Sản Xuất

Giống lúa TBR225 là một giống lúa chủ lực ở nhiều tỉnh phía Bắc Việt Nam, được ưa chuộng nhờ chất lượng gạo thơm ngon và năng suất ổn định. Tuy nhiên, giống lúa này lại rất mẫn cảm với bệnh bạc lá. Khi bệnh bùng phát, năng suất của TBR225 có thể giảm đáng kể, gây thiệt hại lớn cho người trồng lúa. Do đó, việc cải thiện tính kháng bệnh cho giống lúa này là vô cùng quan trọng. Công nghệ sinh học, đặc biệt là CRISPR/Cas9, có thể giúp khắc phục nhược điểm này, tạo ra giống TBR225 vừa năng suất cao vừa kháng bệnh tốt.

II. Giải Mã Cơ Chế Gây Bệnh Bạc Lá Trên Lúa TBR225 Nghiên Cứu Xoo

Hiểu rõ cơ chế gây bệnh của Xoo trên giống lúa TBR225 là bước quan trọng để phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả. Vi khuẩn Xoo sử dụng các protein effector, đặc biệt là TALE, để xâm nhập và thao túng tế bào cây lúa. Các TALE này liên kết với vùng promoter của các gen mẫn cảm (gen S) như OsSWEET, kích hoạt sự biểu hiện của chúng và tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh trưởng. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích TALome của các chủng Xoo phân lập từ Việt Nam, từ đó xác định các gen mục tiêu quan trọng và thiết kế các công cụ chỉnh sửa gen phù hợp.

2.1. Vai Trò của Protein TALE Trong Quá Trình Xâm Nhiễm Bệnh Bạc Lá

TALE là các protein quan trọng trong cơ chế gây bệnh của Xoo. Chúng hoạt động như các yếu tố phiên mã, liên kết với vùng promoter của các gen S trong cây lúa. Sự liên kết này kích hoạt biểu hiện của các gen S, tạo điều kiện cho vi khuẩn Xoo hấp thụ chất dinh dưỡng và phát triển. Nghiên cứu xác định các trình tự EBE (effector binding element) cụ thể mà các TALE liên kết, giúp định hướng cho việc chỉnh sửa gen mục tiêu. Việc vô hiệu hóa các EBE này bằng CRISPR/Cas9 có thể làm giảm tính mẫn cảm của lúa với bệnh bạc lá.

2.2. Gen SWEET Mục Tiêu Chỉnh Sửa Gen CRISPR Cas9 Trên Lúa TBR225

Các gen thuộc họ SWEET đóng vai trò quan trọng trong vận chuyển đường trong cây lúa. Một số gen SWEET, như OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14, đã được chứng minh là gen S đối với Xoo. Khi bị TALE kích hoạt, chúng sẽ vận chuyển đường ra ngoài tế bào, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn Xoo phát triển. Do đó, việc chỉnh sửa gen SWEET bằng CRISPR/Cas9 là một chiến lược hứa hẹn để tạo ra giống lúa kháng bệnh. Nghiên cứu tập trung vào việc chỉnh sửa OsSWEET13 và OsSWEET14 trên giống lúa TBR225.

III. Phương Pháp CRISPR Cas9 Chỉnh Sửa Gen Kháng Bệnh Cho Lúa TBR225

Công nghệ CRISPR/Cas9 được sử dụng để chỉnh sửa gen OsSWEET13 và OsSWEET14 trên giống lúa TBR225. Quá trình này bao gồm thiết kế các sgRNA (single guide RNA) đặc hiệu, tạo vector biểu hiện Cas9 và sgRNA, chuyển gen vào tế bào lúa, và sàng lọc các dòng lúa đã được chỉnh sửa gen thành công. Mục tiêu là tạo ra các đột biến nhỏ tại vùng promoter của OsSWEET13 và OsSWEET14, làm giảm hoặc loại bỏ khả năng liên kết của TALE, từ đó giảm tính mẫn cảm của lúa với Xoo. Hiệu quả CRISPR/Cas9 phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm thiết kế sgRNA, hệ thống chuyển gen và phương pháp sàng lọc.

3.1. Thiết Kế sgRNA Mục Tiêu Gen SWEET Quy Trình Tối Ưu Hóa

Thiết kế sgRNA là bước quan trọng nhất trong chỉnh sửa gen bằng CRISPR/Cas9. Các sgRNA phải có tính đặc hiệu cao đối với gen mục tiêu (OsSWEET13 và OsSWEET14) và ít khả năng liên kết với các gen khác trong hệ gen lúa. Nghiên cứu sử dụng các công cụ tin sinh học để lựa chọn các trình tự sgRNA phù hợp, đảm bảo hiệu quả chỉnh sửa gen cao nhất và giảm thiểu các tác dụng ngoài ý muốn (đột biến gen ngoài mục tiêu). Các trình tự PAM (protospacer adjacent motif) cũng được xem xét kỹ lưỡng trong quá trình thiết kế.

3.2. Tạo Dòng và Chuyển Gen Quy Trình Biến Nạp Hiệu Quả TBR225

Sau khi thiết kế sgRNA, các vector biểu hiện Cas9 và sgRNA được tạo dòng. Các vector này sau đó được chuyển vào tế bào lúa TBR225 thông qua phương pháp biến nạp Agrobacterium tumefaciens. Quá trình biến nạp được tối ưu hóa để đạt hiệu quả cao nhất. Các cây lúa tái sinh từ mô sẹo được sàng lọc bằng PCR và giải trình tự để xác định các dòng đã được chỉnh sửa gen thành công. Các dòng mang biến đổi gen mong muốn được chọn lọc để đánh giá tính kháng bệnh.

3.3. Đánh Giá Off Target Xác Định Tính An Toàn Chỉnh Sửa Gen TBR225

Việc đánh giá đột biến gen ngoài mục tiêu (off-target) là vô cùng quan trọng để đảm bảo tính an toàn của các giống lúa được chỉnh sửa gen bằng CRISPR/Cas9. Nghiên cứu sử dụng các phương pháp tin sinh học và phân tích trình tự để xác định các vị trí tiềm năng mà sgRNA có thể liên kết ngoài mục tiêu. Các vị trí này được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự để xác định xem có xảy ra đột biến hay không. Chỉ các dòng lúa có ít hoặc không có đột biến ngoài mục tiêu mới được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Đảm bảo an toàn sinh học là ưu tiên hàng đầu trong nghiên cứu.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Dòng Lúa TBR225 Kháng Bệnh Bạc Lá Nhờ CRISPR

Nghiên cứu đã tạo ra thành công các dòng lúa TBR225 mang các đột biến tại vùng promoter của OsSWEET13 và OsSWEET14 thông qua công nghệ CRISPR/Cas9. Các dòng lúa này thể hiện khả năng kháng bệnh bạc lá cao hơn so với giống lúa gốc khi được lây nhiễm với vi khuẩn Xoo. Phân tích biểu hiện gen cho thấy sự giảm biểu hiện của OsSWEET13 và OsSWEET14 trong các dòng lúa đã được chỉnh sửa gen, chứng tỏ sự can thiệp thành công vào cơ chế gây bệnh của Xoo. Các kết quả này chứng minh tiềm năng của CRISPR/Cas9 trong việc cải thiện tính kháng bệnh cho các giống lúa quan trọng.

4.1. Đánh Giá Khả Năng Kháng Bệnh Thí Nghiệm Lây Nhiễm Xoo Thực Tế

Khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa TBR225 đã được chỉnh sửa gen được đánh giá thông qua các thí nghiệm lây nhiễm Xoo thực tế. Các cây lúa được lây nhiễm với các chủng Xoo khác nhau, và mức độ phát triển của bệnh được theo dõi và đánh giá. Các dòng lúa mang đột biến OsSWEET13 và OsSWEET14 thể hiện các triệu chứng bệnh nhẹ hơn và chậm hơn so với giống lúa gốc, cho thấy khả năng kháng bệnh đã được cải thiện. Đánh giá kháng bệnh được thực hiện theo thang điểm tiêu chuẩn để đảm bảo tính khách quan.

4.2. Phân Tích Biểu Hiện Gen Cơ Chế Kháng Bệnh ở Mức Độ Phân Tử

Để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng bệnh ở các dòng lúa TBR225 đã được chỉnh sửa gen, phân tích biểu hiện gen OsSWEET13 và OsSWEET14 đã được thực hiện. Kết quả cho thấy sự giảm đáng kể trong biểu hiện của hai gen này ở các dòng lúa đã được chỉnh sửa gen so với giống lúa gốc. Điều này chứng tỏ rằng việc chỉnh sửa gen đã làm giảm khả năng của vi khuẩn Xoo trong việc kích hoạt các gen S, từ đó giảm khả năng gây bệnh. Sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc giải thích cơ chế kháng bệnh.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng CRISPR Cas9 Trong Nông Nghiệp Tương Lai

Nghiên cứu này mở ra triển vọng lớn cho việc ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong cải tiến giống lúa và các cây trồng khác. Việc tạo ra các giống lúa kháng bệnh một cách nhanh chóng và chính xác sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh hại, tăng năng suất và giảm sự phụ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật. Tiềm năng ứng dụng thực tiễn của CRISPR/Cas9 là rất lớn, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu và các thách thức an ninh lương thực. Cần có thêm các nghiên cứu về đánh giá hiệu quả kinh tế và an toàn sinh học để đảm bảo việc ứng dụng CRISPR/Cas9 được thực hiện một cách bền vững.

5.1. Tiềm Năng Phát Triển Giống Lúa Kháng Bệnh Hướng Đi Mới

Việc phát triển các giống lúa kháng bệnh bằng CRISPR/Cas9 là một hướng đi đầy hứa hẹn. Các giống lúa này có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh bạc lá, tăng năng suất và cải thiện thu nhập cho người nông dân. Ngoài ra, việc giảm sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cũng sẽ góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng. Cải thiện giống lúa bằng công nghệ chỉnh sửa gen mở ra một kỷ nguyên mới trong nông nghiệp.

5.2. Nghiên Cứu An Toàn Sinh Học Đảm Bảo Ứng Dụng CRISPR Bền Vững

Mặc dù CRISPR/Cas9 là một công nghệ đầy tiềm năng, nhưng việc đánh giá an toàn sinh học là vô cùng quan trọng. Cần có các nghiên cứu kỹ lưỡng về các tác động tiềm ẩn của chỉnh sửa gen lên môi trường và sức khỏe con người. Các quy trình nghiên cứu khoa học phải tuân thủ các tiêu chuẩn an toàn sinh học nghiêm ngặt để đảm bảo rằng việc ứng dụng CRISPR/Cas9 được thực hiện một cách có trách nhiệm và bền vững.

VI. Kết Luận CRISPR Cas9 Mở Ra Kỷ Nguyên Mới Cho Lúa TBR225

Nghiên cứu này đã chứng minh tính hiệu quả của công nghệ CRISPR/Cas9 trong việc cải thiện tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa TBR225. Các dòng lúa đã được chỉnh sửa gen thể hiện khả năng kháng bệnh cao hơn so với giống lúa gốc, đồng thời không có các tác dụng phụ đáng kể. Kết quả này mở ra triển vọng lớn cho việc ứng dụng CRISPR/Cas9 trong cải tiến giống lúa và các cây trồng khác, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và phát triển nông nghiệp bền vững. Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng bệnh và đánh giá hiệu quả kinh tế để tối ưu hóa việc ứng dụng công nghệ này.

6.1. Tóm tắt Kết quả chính Chỉnh sửa gen thành công trên TBR225

Nghiên cứu đã thành công trong việc áp dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tạo ra các dòng lúa TBR225 có khả năng kháng bệnh bạc lá tốt hơn. Điều này được thực hiện bằng cách chỉnh sửa các gen OsSWEET13 và OsSWEET14, là những yếu tố quan trọng trong quá trình lây nhiễm bệnh của vi khuẩn Xoo.

6.2. Hướng Nghiên cứu Tiếp Theo Tối ưu hóa ứng dụng và đánh giá rủi ro

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chỉnh sửa gen, đánh giá các rủi ro tiềm ẩn và mở rộng ứng dụng của công nghệ CRISPR/Cas9 sang các giống lúa khác và các loại cây trồng khác. Ngoài ra, việc đánh giá hiệu quả kinh tế của các giống lúa đã được chỉnh sửa gen cũng rất quan trọng để đảm bảo tính khả thi trong thực tế.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh hại nguy hiểm đối với sản xuất lúa gạo tại nhiều quốc gia trên thế giới, bao gồm Việt Nam. Bệnh thường phát sinh và gây hại nặng trong vụ lúa Mùa khi độ ẩm không khí cao, mưa nhiều và sương mù dày đặc. Thiệt hại năng suất do bệnh gây ra có thể lên đến 26% ở các giống lúa mẫn cảm; tại Ấn Độ, dịch bệnh từng làm sụt giảm 60% sản lượng, trong khi ở Philippines mức tổn thất ghi nhận là 22,5%. Số liệu thống kê từ Cục Bảo vệ thực vật cho thấy diện tích lúa nhiễm bệnh bạc lá tại Việt Nam năm 2013 là 72.343 ha, năm 2016 tăng lên 149.045 ha bị nhiễm nặng và năm 2018 là 24.542 ha (trong đó có 1.592 ha nhiễm nặng).

TBR225 là giống lúa thuần chất lượng được công nhận giống Quốc gia năm 2015, có thời gian sinh trưởng ngắn (vụ Xuân 120–125 ngày, vụ Mùa 105–110 ngày), năng suất trung bình 70–75 tạ/ha (thâm canh đạt 85–90 tạ/ha), tỷ lệ gạo xay xát 72–74%, hàm lượng amylose 13,7% và phẩm chất gạo thơm mềm. Mặc dù là giống chủ lực tại các tỉnh phía Bắc, TBR225 lại mang nhược điểm lớn là mẫn cảm với bệnh bạc lá. Các biện pháp canh tác, hóa học và sinh học hiện hành bộc lộ nhiều hạn chế về hiệu quả dài hạn, nguy cơ ô nhiễm môi trường và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Phương pháp chọn giống truyền thống hoặc chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và có thể làm suy giảm các đặc tính nông học vốn có của giống gốc. Do đó, việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 để can thiệp chính xác vào các gen mẫn cảm (gen S) của cây lúa là giải pháp khoa học nhằm nâng cao tính kháng bệnh.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định: Các nghiên cứu chỉnh sửa gen trước đây chủ yếu tập trung vào các giống lúa mô hình hoặc giống quốc tế (Kitaake, Nipponbare, IR64) với các chủng Xoo phân lập từ Philippines hay Châu Phi. Cơ chế tương tác phân tử giữa các chủng Xoo bản địa tại miền Bắc Việt Nam (VXO) với giống lúa thuần TBR225 chưa được làm rõ một cách có hệ thống, và chưa có công trình nào sử dụng CRISPR/Cas9 để tạo đột biến trên vùng promoter của các gen mẫn cảm OsSWEET trên giống lúa này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

• Mục tiêu chung: Tăng cường tính kháng bệnh bạc lá của giống lúa TBR225 thông qua sử dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để gây đột biến chính xác các gen S có liên quan đến sự xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo.
• Mục tiêu cụ thể:
  1. Phân lập, nghiên cứu TALome và xác định được cơ chế gây bệnh trên giống lúa TBR225 của vi khuẩn Xoo thu thập từ các tỉnh phía Bắc Việt Nam.
  2. Thiết kế được cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET trên giống lúa TBR225.
  3. Tạo được các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen mang đột biến có khả năng kháng vi khuẩn Xoo Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cây lúa TBR225 và các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae thu thập tại Việt Nam (VXO).
• Phạm vi không gian: Các mẫu lúa nhiễm bệnh bạc lá thu thập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (khu vực đồng bằng sông Hồng và trung du miền núi phía Bắc).
• Phạm vi thời gian: Các mẫu bệnh phẩm thu thập từ năm 2016 đến năm 2018; các nội dung thực nghiệm và phân tích phân tử hoàn thành năm 2023.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh bạc lá, hệ thống gen kháng/nhiễm, tương tác phân tử TALE–SWEET và công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9:

1. Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn Xoo và hệ thống gen kháng (gen R)

Tác nhân gây bệnh bạc lá được xác định từ năm 1922 và được Swings (1990) thống nhất tên khoa học là Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Tại Việt Nam, nhiều công trình đã khảo sát thành phần nòi vi khuẩn Xoo:

• Tạ Minh Sơn và cộng sự (1987) xác định 4 nhóm nòi phổ biến trên toàn quốc.
• Lưu Văn Quyết (1999) xác định 7 nhóm nòi (I–VII) ở đồng bằng sông Hồng; đến năm 2016, tác giả và cộng sự phân lập và chia Xoo phía Bắc thành 3 nhóm, trong đó nhóm II có độc tính mạnh.
• Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy (2003) phân loại 64 isolate thành 12 nhóm dựa trên bộ dòng cận đẳng gen (NIL), ghi nhận nhóm 2A và 2B chiếm 73,8%. Bùi Trọng Thủy (2005) xác định 12 nhóm và Nguyễn Văn Viết và cộng sự (2008) ghi nhận 13 nòi tại miền Bắc.
• Hoang và cộng sự (2008) phân lập 41 chủng ở Đồng bằng sông Cửu Long thành 6 nhóm (A–F). Furuya và cộng sự (2012) xác định 4 nhóm (G1–G4) tại miền Bắc. Tran và cộng sự (2017) xác định 4 nòi (5, 7, 5*, 5**) tại Cần Thơ.
• Nguyễn Thị Tho và cộng sự (2022) phân lập 47 isolate ở đồng bằng sông Hồng, ghi nhận 56,2% isolate vượt qua được dòng mang đơn gen kháng, 26,8% vượt qua dòng mang 2 gen kháng và 17% vượt qua tổ hợp 3–5 gen kháng.

Về gen kháng, kể từ công bố đầu tiên của Sagaguchi và cộng sự (1967), hơn 46 gen Xa/xa đã được ghi nhận (29 gen trội như Xa1, Xa3/Xa26, Xa27; 17 gen lặn như xa5, xa13, xa25(t), xa41(t)). Các nghiên cứu tích hợp đa gen kháng bằng MAS đã được triển khai trên thế giới (Chen và cs., 2000; Reinke và cs., 2018; Xu và cs., 2012; Zhang và cs., 2016; Yap và cs., 2016; Chukwu và cs., 2020; Hsu và cs., 2020) và tại Việt Nam (Phan Hữu Tôn và cs., 2005; Lã Vinh Hoa và cs., 2010; Nguyễn Thị Minh Nguyệt, 2013; Dương Đức Huy và cs., 2016; Phạm Thiên Thành và cs., 2020). Tuy nhiên, phương pháp lai truyền thống và MAS gặp trở ngại khi mầm bệnh biến đổi nhanh làm gãy tính kháng, đồng thời khó duy trì hoàn toàn nền di truyền mong muốn.

2. Tương tác phân tử TALE–SWEET và ứng dụng CRISPR/Cas9

Chen và cộng sự (2010) phát hiện họ gen SWEET mã hóa protein vận chuyển đường qua màng. Trong tương tác bệnh học, vi khuẩn Xoo tiết các protein TALE qua hệ thống tiết loại III (T3SS) đi vào nhân tế bào lúa, liên kết đặc hiệu với trình tự EBE (effector binding element) nằm ở vùng promoter của các gen OsSWEET nhóm III (OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14) để kích hoạt biểu hiện gen, cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn (Bogdanove, 2009; Boch, 2009). Mã liên kết giữa cặp amino acid biến đổi RVD (vị trí 12, 13) của TALE với nucleotide trên EBE gồm: HD–C, NN–G, NI–A, NG–T.

Nghiên cứu của Li và cộng sự (2012), Blanvillain và cộng sự (2017), Oliva và cộng sự (2019) và Xu và cộng sự (2019) chứng minh rằng việc gây đột biến các vị trí EBE trên promoter OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14 bằng TALEN hoặc CRISPR/Cas9 giúp cây lúa kháng lại các chủng Xoo mang TALE tương ứng mà không làm suy giảm các đặc tính sinh trưởng.

3. Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết bài toán thực tiễn tại Việt Nam: Xác định cấu trúc TALome của các chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh tại miền Bắc tác động lên giống lúa TBR225; làm rõ hai gen mẫn cảm chủ lực là OsSWEET13 và OsSWEET14; thiết kế vector và áp dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để gây đột biến định hướng vùng promoter SW13-TBR và SW14-TBR, từ đó tạo ra dòng lúa TBR225 mang tính kháng bạc lá phổ rộng, ổn định di truyền và không chứa DNA ngoại lai.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Khung lý thuyết và phân tích

Luận án dựa trên cơ chế bệnh học phân tử của mối tương tác cây chủ – mầm bệnh:

• Cơ chế hoạt hóa gen S bởi TALE: TALE của Xoo hoạt động như nhân tố phiên mã, liên kết với promoter của gen OsSWEET tại vị trí EBE tương ứng.
• Cơ chế chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9: Phức hệ sgRNA (gồm crRNA nhận diện đích 18–22 nt và tracrRNA liên kết Cas9) dẫn đường enzyme nuclease Cas9 (từ Streptococcus pyogenes) nhận diện trình tự PAM (5'-NGG-3') và tạo vết cắt đứt gãy sợi đôi (DSB) cách PAM 3 nucleotide. Tế bào thực vật tự sửa chữa thông qua cơ chế ghép nối tận cùng không tương đồng (NHEJ), tạo ra các đột biến chèn/mất đoạn nhỏ (indel) tại EBE. Điều này làm mất vị trí bám của TALE, vô hiệu hóa khả năng kích hoạt gen SWEET của vi khuẩn mà không làm thay đổi vùng mã hóa protein của cây lúa.

Thành phần / Yếu tố phân tử	Đặc điểm và chức năng trong nghiên cứu
Enzyme nuclease Cas9	Protein từ Streptococcus pyogenes, nhận diện motif PAM 5'-NGG-3', tạo DSB tại điểm đích
sgRNA dẫn đường	Gồm crRNA thiết kế đặc hiệu nhận diện EBE trên SW13-TBR và SW14-TBR kết hợp với tracrRNA
Vùng đích SW13-TBR	Promoter gen OsSWEET13 trên giống lúa TBR225, chứa trình tự EBE nhận diện bởi TALE PthXo2
Vùng đích SW14-TBR	Promoter gen OsSWEET14 trên giống lúa TBR225, chứa trình tự EBE nhận diện bởi TALE AvrXa7
Cơ chế sửa chữa DNA	Ghép nối tận cùng không tương đồng (NHEJ), tạo đột biến indel gây mất nhận diện TALE–EBE

2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập, phân lập và định danh: Phân lập các isolate vi khuẩn Xoo từ mẫu lúa nhiễm bệnh thu thập tại miền Bắc (2016–2018), nuôi cấy trên môi trường thạch chứa glucose, định danh loài bằng kỹ thuật PCR đa mồi.
• Phân tích TALome và tương tác phân tử: Giải trình tự gen mã hóa TALE (AvrXa7, PthXo2) của các isolate VXO; sử dụng các công cụ tin sinh học (PrediTALE, Talvez, AnnoTALE) để phân tích cấu trúc RVD và dự đoán EBE đích trên promoter OsSWEET của giống lúa TBR225; phân tích biểu hiện gen OsSWEET bằng RT-qPCR sau khi lây nhiễm vi khuẩn.
• Thiết kế vector chỉnh sửa gen: Sử dụng công cụ CRISPR-P và CRISPR-PLANT để thiết kế các trình tự crRNA; phân tích off-target trên hệ gen lúa; xây dựng các vector trung gian (pEN-V0, pEN-V1, pEN-V2) và vector nhị phân hoàn chỉnh (pCas9/sgRNA-SW14 chỉnh sửa đơn gen, pCas9/SW13-SW14 chỉnh sửa đồng thời 2 gen) điều khiển bởi promoter U6 (cho sgRNA) và Ubiquitin (cho Cas9).
• Nuôi cấy mô và chuyển gen: Tạo mô sẹo từ hạt lúa TBR225 chín sinh lý, tối ưu hóa môi trường tái sinh với chất điều hòa sinh trưởng BAP và mật độ vi khuẩn; biến nạp cấu trúc T-DNA vào mô sẹo thông qua Agrobacterium tumefaciens.
• Sàng lọc phân tử và đánh giá di truyền: Tách chiết DNA tổng số từ lá cây tái sinh; kiểm tra sự có mặt của T-DNA (gen chỉ thị HPT và gen Cas9) bằng PCR; khuếch đại và giải trình tự Sanger đoạn promoter SW13-TBR và SW14-TBR để xác định kiểu gen đột biến ở các thế hệ T0, T1 và T2; sàng lọc các cá thể phân ly không mang gen chuyển (transgene-free).
• Đánh giá tính kháng bệnh và chỉ tiêu nông sinh học: Lây nhiễm nhân tạo các chủng vi khuẩn VXO đại diện bằng phương pháp cắt lá và tiêm lá; đo chiều dài vết bệnh sau 14 ngày theo thang điểm chuẩn; đánh giá các chỉ tiêu nông học (chiều cao cây, số bông/khóm, tỷ lệ hạt chắc, khối lượng 1.000 hạt, năng suất) ở điều kiện nhà lưới.
• Xử lý số liệu: Phân tích thống kê các số liệu đo đếm bằng phần mềm chuyên dụng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp cơ sở lý thuyết và các nghiên cứu liên quan đến bệnh bạc lá lúa, tác nhân vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae, cấu trúc hệ thống tiết loại III và các protein T3E (đặc biệt là TALE). Tác giả phân tích chi tiết cấu trúc vùng lặp trung tâm RVD của TALE, nguyên lý nhận diện mã nucleotide trên EBE của promoter gen chủ, cũng như vai trò sinh học của họ gen vận chuyển đường SWEET (đặc biệt là các gen nhóm III gồm OsSWEET11, OsSWEET13, OsSWEET14). Chương 1 cũng trình bày toàn diện về cơ chế hoạt động của phức hệ CRISPR/Cas9, cấu trúc sgRNA, domain chức năng của Cas9 (REC và NUC), cơ chế sửa chữa DSB qua NHEJ và HDR, cùng các tiến bộ trong thiết kế vector chuyển gen thực vật và các công cụ tin sinh học hỗ trợ thiết kế sgRNA.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu nghiên cứu gồm giống lúa thuần TBR225, tập hợp các chủng vi khuẩn Xoo thu thập tại các tỉnh phía Bắc giai đoạn 2016–2018, các chủng Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, hệ thống plasmid mang phức hệ CRISPR/Cas9 và danh mục các mồi oligonucleotide. Tác giả trình bày quy trình thực nghiệm từ tách chiết DNA/RNA, phản ứng PCR đa mồi định danh vi khuẩn, giải trình tự Sanger, RT-qPCR, quy trình nuôi cấy mô sẹo in vitro của lúa TBR225, phương pháp biến nạp qua A. tumefaciens, các bước sàng lọc kiểu gen đột biến và đánh giá kiểu hình kháng bệnh bằng phương pháp cắt/tiêm lá nhân tạo.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

1. Phân lập và nghiên cứu cơ chế gây bệnh của quần thể Xoo ở phía Bắc Việt Nam trên giống lúa TBR225

Tác giả đã phân lập và làm thuần các isolate vi khuẩn Xoo từ các mẫu lá lúa nhiễm bệnh thu thập tại các tỉnh phía Bắc. Kết quả định danh bằng PCR đa mồi xác nhận các isolate phân lập được đều thuộc loài Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Đánh giá độc tính trên giống lúa TBR225 cho thấy các isolate này gây bệnh nghiêm trọng với các vết cháy dọc theo mép và gân lá.

Phân tích TALome của các isolate đại diện (ký hiệu VXO) bằng giải trình tự và công cụ tin sinh học cho thấy sự hiện diện phổ biến của hai TALE độc lực chính là AvrXa7 và PthXo2. Phân tích vùng promoter của các gen OsSWEET trên giống TBR225 cho thấy:

• Promoter OsSWEET14 (SW14-TBR) chứa vùng trình tự EBE tương thích hoàn toàn với TALE AvrXa7.
• Promoter OsSWEET13 (SW13-TBR) chứa trình tự EBE tương thích với TALE PthXo2.
• Kết quả phân tích RT-qPCR xác nhận sự biểu hiện mạnh của OsSWEET13 và OsSWEET14 trong mô lá lúa TBR225 sau khi bị lây nhiễm bởi các isolate VXO mang TALE tương ứng, khẳng định đây là hai gen S chủ lực quyết định tính mẫn cảm của TBR225 đối với quần thể Xoo phía Bắc.

Promoter lúa TBR225:        SW14-TBR (EBE AvrXa7) & SW13-TBR (EBE PthXo2)
Biểu hiện gen S:            OsSWEET14 & OsSWEET13 tăng cao

2. Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET

Trên cơ sở phân tích trình tự vùng EBE của SW13-TBR và SW14-TBR, các đoạn crRNA đặc hiệu dài 20 nucleotide đã được thiết kế nằm sát cạnh các motif PAM phù hợp:

• crRNA chỉnh sửa SW14-TBR định vị chính xác tại vùng EBE của AvrXa7.
• crRNA chỉnh sửa SW13-TBR định vị tại vùng EBE của PthXo2.
• Kiểm tra in silico xác nhận các crRNA này không bắt cặp sai lệch (không có vị trí off-target tiềm tàng) trong toàn bộ hệ gen lúa.

Tác giả đã lắp ráp thành công các cấu trúc biểu hiện vào vector:

• Vector đơn gen pCas9/sgRNA-SW14 chứa cụm biểu hiện sgRNA-SW14 dưới sự điều khiển của promoter U6 và gen Cas9 dưới promoter Ubiquitin.
• Hệ thống vector đa gen pCas9/SW13-SW14 chứa đồng thời hai cụm biểu hiện sgRNA điều khiển bởi promoter U6 độc lập, cho phép định hướng cắt đồng thời cả hai promoter SW13-TBR và SW14-TBR. Cấu trúc vector được kiểm tra chính xác bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự.

3. Tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa SW14-TBR

Tác giả đã tiến hành tối ưu hóa quy trình nuôi cấy mô sẹo lúa TBR225: Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP thích hợp cho khả năng tái sinh chồi và xác định mật độ vi khuẩn A. tumefaciens tối ưu cho hiệu quả biến nạp gen vào mô sẹo.

Tiến hành chuyển cấu trúc pCas9/sgRNA-SW14 vào mô sẹo lúa TBR225:

• Thu nhận các cây tái sinh thế hệ T0 và sàng lọc bằng PCR gen HPT và Cas9.
• Giải trình tự đoạn SW14-TBR của các dòng T0 xác định được nhiều dạng đột biến indel (mất đoạn hoặc chèn nucleotide) tại đúng vị trí cắt dự đoán của phức hệ CRISPR/Cas9.
• Ở thế hệ T1, phân tích phân ly di truyền đã phát hiện các cá thể mang đột biến đồng hợp tử tại vùng EBE AvrXa7 và đã đào thải hoàn toàn cấu trúc T-DNA ngoại lai (dòng transgene-free).
• Đánh giá thế hệ T2: Các dòng lúa TBR225 đột biến SW14-TBR duy trì kiểu hình sinh trưởng, thời gian trỗ, chiều cao cây, cấu trúc bông và các chỉ tiêu nông học tương đương với cây đối chứng TBR225 không chuyển gen. Khi lây nhiễm nhân tạo với chủng VXO mang TALE AvrXa7, mức độ biểu hiện gen OsSWEET14 bị ức chế rõ rệt, chiều dài vết bệnh giảm có ý nghĩa, chứng minh tính kháng bệnh bạc lá đã được cải thiện.

4. Tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa đồng thời SW13-TBR và SW14-TBR

Để mở rộng phổ kháng đối với các chủng vi khuẩn Xoo mang cả AvrXa7 và PthXo2, tác giả tiến hành biến nạp cấu trúc đa gen pCas9/SW13-SW14 vào mô sẹo TBR225:

• Sàng lọc các cây tái sinh T0 bằng PCR và phân tích giải trình tự Sanger đoạn SW13-TBR và SW14-TBR. Kết quả ghi nhận các dòng mang đột biến đồng thời trên cả hai promoter với các kiểu đột biến mất đoạn hoặc chèn base tại các vùng EBE tương ứng.
• Theo dõi thế hệ T1: Sàng lọc kiểu gen xác định được các dòng lúa mang đột biến kép đồng hợp tử ở cả hai locus SW13-TBR và SW14-TBR, đồng thời phân ly chọn lọc được các cá thể sạch gen chuyển (không còn mang T-DNA).
• Đánh giá kiểu hình và tính kháng ở thế hệ T1: Các dòng chỉnh sửa đa gen biểu hiện tính kháng phổ rộng đối với tập hợp các isolate VXO đại diện mang TALE AvrXa7 và PthXo2 (chiều dài vết bệnh ngắn, phản ứng kháng cao), trong khi vẫn duy trì ổn định các đặc điểm hình thái và nông học đặc trưng của giống lúa TBR225.

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt khoa học và lý luận

• Là công trình nghiên cứu có hệ thống đầu tiên tại Việt Nam kết hợp từ nghiên cứu cơ bản (cơ chế phân tử tương tác giữa vi khuẩn Xoo và giống lúa thuần TBR225) đến nghiên cứu ứng dụng (chỉnh sửa hệ gen cải tiến tính kháng bệnh).
• Cung cấp dẫn liệu khoa học về tính đa dạng TALome của quần thể vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam, chứng minh AvrXa7 và PthXo2 là hai TALE độc lực chủ yếu, đồng thời xác định OsSWEET13 và OsSWEET14 là hai gen mẫn cảm (gen S) chính trên giống lúa TBR225.
• Đóng góp dẫn liệu thực nghiệm về việc ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để gây đột biến chính xác các vùng cis-element (EBE) trên vùng promoter của thực vật mà không làm tổn hại đến vùng mã hóa của gen.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn

• Thiết kế thành công hệ thống vector đơn gen và đa gen phục vụ công tác chỉnh sửa promoter OsSWEET trên cây lúa.
• Tạo ra các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen mang đột biến đơn (SW14-TBR) và đột biến kép (SW13-TBR và SW14-TBR) có khả năng kháng phổ rộng với các isolate vi khuẩn Xoo đại diện ở miền Bắc Việt Nam.
• Chọn lọc được các dòng lúa đột biến thế hệ T1, T2 sạch gen ngoại lai (transgene-free), duy trì được các đặc tính nông sinh học, năng suất và phẩm chất gạo quý của giống gốc TBR225, tạo nguồn vật liệu di truyền phục vụ sản xuất và chọn tạo giống lúa.

3. Đề xuất và giải pháp

• Đề xuất tiếp tục theo dõi, đánh giá độ ổn định di truyền của các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen ở các thế hệ tiếp theo trên quy mô đồng ruộng tại nhiều vùng sinh thái khác nhau.
• Ứng dụng quy trình thiết kế vector và chỉnh sửa promoter gen SWEET đã hoàn thiện để nâng cao tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa thuần thương mại khác đang bị nhiễm bệnh trong sản xuất.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

1. Hạn chế của luận án

• Tập hợp mẫu vi khuẩn Xoo phân lập và phân tích TALome tập trung chủ yếu ở một số tỉnh phía Bắc trong giai đoạn 2016–2018, chưa bao quát toàn bộ các vùng sinh thái trồng lúa trên phạm vi cả nước.
• Các đánh giá về kiểu hình và tính kháng bệnh chủ yếu được thực hiện trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo ở phòng thí nghiệm và nhà lưới, chưa có số liệu khảo nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng qua nhiều mùa vụ.

2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Triển khai khảo nghiệm đánh giá tính kháng bệnh và các chỉ tiêu kinh tế - nông học của các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen trên đồng ruộng tại các vùng có áp lực bệnh bạc lá cao.
• Mở rộng phân lập, giám sát sự biến đổi TALome của quần thể Xoo tại các vùng trồng lúa khác nhau để kịp thời thiết kế các cấu trúc sgRNA bổ sung nếu phát hiện các TALE mới kích hoạt các gen S khác (như OsSWEET11).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cao:

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học, Bảo vệ thực vật: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp tiếp cận bệnh học phân tử thực vật, kỹ thuật phân tích TALome, phương pháp thiết kế sgRNA đa đích và quy trình nuôi cấy mô, biến nạp di truyền trên giống lúa thuần.
• Đối với các nhà chọn tạo giống và cơ quan quản lý nông nghiệp: Cung cấp nguồn vật liệu dòng lúa TBR225 kháng bạc lá sạch gen chuyển (transgene-free) để phát triển vào sản xuất; đồng thời minh chứng cho hiệu quả ứng dụng của công nghệ chỉnh sửa gen chính xác trong cải tiến giống cây trồng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lại chọn chỉnh sửa vùng promoter (EBE) thay vì chỉnh sửa vùng mã hóa (exon) của các gen OsSWEET?
Các gen OsSWEET đóng vai trò sinh lý thiết yếu trong việc vận chuyển đường nội sinh phục vụ quá trình phát triển phấn hoa, nuôi hạt và đáp ứng stress của cây lúa. Nếu đột biến làm mất chức năng vùng mã hóa (exon), cây lúa có thể bị ảnh hưởng tiêu cực về sinh trưởng và năng suất. Việc chỉnh sửa chính xác vùng promoter (EBE) chỉ làm mất vị trí liên kết của TALE do vi khuẩn tiết ra, ngăn chặn vi khuẩn kích hoạt gen để lấy dinh dưỡng, trong khi cây lúa vẫn duy trì biểu hiện sinh lý bình thường.

2. Hai gen mẫn cảm chính được xác định trên giống lúa TBR225 đối với vi khuẩn Xoo miền Bắc là gì?
Đó là OsSWEET13 (chứa EBE tương ứng với TALE PthXo2) và OsSWEET14 (chứa EBE tương ứng với TALE AvrXa7). Cả hai gen này đều bị các isolate VXO phân lập ở phía Bắc kích hoạt phiên mã mạnh mẽ trong quá trình xâm nhiễm.

3. Làm thế nào để thu được dòng lúa chỉnh sửa gen không chứa gen ngoại lai (transgene-free)?
Ở thế hệ T0, phức hệ Cas9/sgRNA thực hiện chức năng cắt và tạo đột biến indel tại promoter đích, đồng thời đoạn T-DNA mang gen chọn lọc HPT và gen Cas9 được chèn ngẫu nhiên vào hệ gen. Khi cho cây T0 tự thụ phấn sinh ra thế hệ T1, sự phân ly di truyền độc lập cho phép sàng lọc bằng PCR để chọn ra các cá thể vừa mang đột biến mong muốn ở trạng thái đồng hợp tử, vừa đào thải hoàn toàn đoạn T-DNA ngoại lai.

4. Dòng lúa chỉnh sửa đồng thời hai promoter SW13-TBR và SW14-TBR mang lại ưu thế gì so với dòng chỉnh sửa đơn gen?
Dòng chỉnh sửa đơn gen SW14-TBR chỉ kháng được các chủng Xoo gây bệnh qua TALE AvrXa7. Trong khi đó, quần thể vi khuẩn Xoo miền Bắc mang cả TALE AvrXa7 và PthXo2. Do vậy, dòng chỉnh sửa đồng thời cả hai vùng promoter (SW13-TBR và SW14-TBR) giúp cây lúa ngăn chặn cả hai con đường xâm nhiễm của vi khuẩn, mang lại tính kháng phổ rộng và ổn định hơn.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Trần Lan Đài đã làm rõ cơ chế tương tác phân tử giữa quần thể vi khuẩn Xoo miền Bắc và giống lúa TBR225, xác định OsSWEET13 và OsSWEET14 là hai gen mẫn cảm chủ lực bị kích hoạt bởi các TALE PthXo2 và AvrXa7. Bằng việc ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9, tác giả đã thiết kế thành công các cấu trúc vector đơn gen và đa gen, tối ưu hóa quy trình biến nạp và tạo ra các dòng lúa TBR225 mang đột biến indel chính xác tại các vùng EBE tương ứng. Các dòng lúa chỉnh sửa gen thế hệ T1, T2 đã đào thải sạch gen ngoại lai, thể hiện khả năng kháng phổ rộng với các chủng vi khuẩn Xoo đại diện mà vẫn giữ vững các đặc tính nông sinh học và chất lượng vốn có của giống lúa thuần TBR225.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra, là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trên lúa hiện nay, xuất hiện phổ biến ở nhiều quốc gia trồng lúa trên thế giới trong đó có Việt Nam. Bệnh gây hại chủ yếu ở vụ lúa Mùa khi điều kiện thời tiết ẩm ƣớt, nhiều sƣơng mù và độ ẩm không khí cao. Thiệt hại do bệnh bạc lá lúa gây ra đã làm ảnh hƣởng nặng nề đến sản lƣợng lúa gạo vào những năm xảy ra dịch bệnh.

Ở một số tỉnh phía Bắc nƣớc ta, TBR225 là giống lúa chủ lực có diện tích canh tác chiếm tỉ trọng khá lớn trong sản xuất lúa với nhiều ƣu điểm nhƣ: chất lƣợng gạo thơm, ngon và cho năng suất khá cao. Tuy nhiên, nhƣợc điểm lớn nhất của giống lúa này là mẫn cảm với bệnh bạc lá, dẫn đến năng suất bị ảnh hƣởng nghiêm trọng khi xảy ra dịch bệnh. Vì vậy, bên cạnh những biện pháp phòng trừ bệnh nhƣ thay đổi phƣơng thức canh tác, sử dụng thuốc hóa học hay biện pháp khống chế sinh học, nghiên cứu nâng cao khả năng kháng bệnh bạc lá trên giống lúa này là yêu cầu cấp thiết, giúp đảm bảo tính bền vững và hiệu quả của sản xuất lúa gạo ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam. Cho đến nay, cùng với những phƣơng pháp lai tạo truyền thống, các phƣơng pháp chọn giống chính xác mới dựa trên công nghệ sinh học hiện đại, bao gồm công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9), đang dần chứng minh đƣợc tính hiệu quả vƣợt trội trong các chƣơng trình chọn/tạo giống cây trồng kháng bệnh, có năng suất và chất lƣợng cao.

Công nghệ CRISPR/Cas9 là một phát minh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với công nghệ sinh-y học nói chung và sinh học nông nghiệp nói riêng. Công nghệ này cho phép tạo đột biến có lợi ở bất cứ vị trí nào trong hệ gen một cách đơn giản và nhanh chóng; vì vậy đƣợc xem là một bƣớc phát triển mang tính đột phá trong thao tác di truyền trên hệ gen sinh vật, đặc biệt đối với các ứng dụng cải tiến tính trạng nông sinh học cây trồng thông qua kiểm soát biểu hiện của (các) gen liên quan. Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mới ra đời gần 10 năm nhƣng đã có những bƣớc phát triển vƣợt bậc, đƣợc áp dụng rộng khắp trong 9 các nghiên cứu về cải tiến tính trạng nông sinh học của nhiều loại cây trồng nông nghiệp có giá trị quan trọng nhƣ lúa, ngô, đậu tƣơng, cam, cà chua, thuốc lá… Cơ chế gây bệnh bạc lá của vi khuẩn Xoo đã đƣợc chứng minh là có liên quan chặt chẽ với các TALE (Transcription activator-like effector) thuộc nhóm protein tiết loại III đặc trƣng của vi khuẩn Xoo. TALE sau khi đi vào tế bào cây chủ sẽ hoạt động nhƣ một nhân tố phiên mã, liên kết với vùng promoter của gen nhiễm/gen mẫn cảm (susceptiblilty gene – gen S) và hoạt hóa sự biểu hiện của chúng, tạo điều kiện cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn hay phát triển triệu chứng bệnh.

Một số gen thuộc họ SWEET (Sugar will eventually be exported transporter) - mã hóa protein vận chuyển đƣờng ở lúa đã đƣợc chứng minh là gen S đối với vi khuẩn Xoo, bao gồm OsSWEET11, OsSWEET13 và OsSWEET14. Nhiều đột biến (tự nhiên hay nhân tạo) xuất hiện tại vị trí TALE liên kết với promoter (gọi là EBE - effector binding element) của các gen S nhƣ vậy đã tạo nên tính kháng vi khuẩn Xoo cho cây lúa. Thực tế này đã cho thấy tiềm năng to lớn của việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để can thiệp vào các gen S thuộc họ OsSWEET nhằm cải tiến tính kháng bệnh bạc lá cho các giống lúa phổ biến trong sản xuất nhƣ giống TBR225. Với mục tiêu cải tiến tính kháng bệnh bạc lá cho giống lúa TBR225 bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dựa trên các nghiên cứu về tƣơng tác phân tử giữa vi khuẩn Xoo và cây lúa, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tăng cƣờng tính kháng bệnh bạc lá trên giống lúa TBR225 bằng công nghệ CRISPR/Cas9”.

Mục tiêu nghiên cứu 2. Mục tiêu chung Tăng cƣờng tính kháng bệnh bạc lá của giống lúa TBR225 thông qua sử dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để gây đột biến chính xác các gen S có liên quan đến sự xâm nhiễm của vi khuẩn Xoo. Mục tiêu cụ thể  Phân lập, nghiên cứu TALome và xác định đƣợc cơ chế gây bệnh trên giống lúa TBR225 của vi khuẩn Xoo thu thập từ các tỉnh phía Bắc Việt Nam. 10  Thiết kế đƣợc cấu trúc biểu hiện phức hệ CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET trên giống lúa TBR225.

 Tạo đƣợc các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen mang đột biến có khả năng kháng vi khuẩn Xoo Việt Nam. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là cây lúa TBR225 và vi khuẩn gây bệnh bạc lá Xoo ở Việt Nam (VXO) Các nội dung nghiên cứu chính:  Phân lập và nghiên cứu cơ chế gây bệnh của quần thể Xoo ở phía Bắc Việt Nam trên giống lúa TBR225.  Thiết kế cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET.  Tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 (SW14-TBR).

 Tạo dòng lúa TBR225 chỉnh sửa đồng thời hai promoter OsSWEET13 (SW13-TBR) và SW14-TBR. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản (cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử của vi khuẩn Xoo trên cây lúa TBR225) theo định hƣớng ứng dụng (cải tiến tính kháng bệnh bạc lá của giống lúa TBR225). Kết quả luận án đã cho thấy sự đa dạng của quần thể Xoo Việt Nam, ít nhất là về hệ protein tiết loại III TALE liên quan đến độc tính của vi khuẩn trên cây lúa. Kết quả nghiên cứu là nguồn tài liệu tham khảo tốt cho các nghiên cứu về đa dạng sinh học quần thể Xoo Việt Nam.

Trên cơ sở xác định OsSWEET13 và OsSWEET14 của giống lúa TBR225 là hai gen S chính của các isolate VXO, nghiên cứu đã gây đột biến các trình tự EBE PthXo2(A) và AvrXa7 nằm trên hai gen này bằng công nghệ CRISPR/Cas9, kết quả thu đƣợc một số dòng lúa mang đột biến đơn gen và đa gen bất hoạt khi lây nhiễm với các isolate VXO đại diện. Nhƣ vậy, luận án đã thành công trong việc sử dụng hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để tạo đột biến chính xác trên giống lúa TBR225 của Việt Nam. Đây là nguồn tài liệu tham khảo tốt cho công tác nghiên cứu liên quan đến chỉnh sửa gen bằng công nghệ CRISPR/Cas9. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên tạo ra đƣợc các dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen kháng phổ rộng với các isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá đại diện.

Dòng lúa TBR225 chỉnh sửa gen kháng bạc lá phổ rộng này nếu phát triển có thể góp phần nâng cao năng suất cho giống lúa chủ lực ở phía Bắc Việt Nam nói riêng và cải thiện đời sống ngƣời dân nói chung. Đây là một trong số ít những nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 vào cải tạo tính kháng bệnh trên giống lúa thuần ở Việt Nam. Thành công của luận án đã mở ra triển vọng rất lớn về hƣớng nghiên cứu chỉnh sửa gen nhằm nâng cao năng suất, tính chống chịu và chất lƣợng của các giống cây trồng khác ở Việt Nam. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

BỆNH BẠC LÁ LÚA VÀ VI KHUẨN XOO 1. Giới thiệu chung về bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá là một trong những bệnh hại lúa đƣợc phát hiện từ rất sớm, các nghiên cứu cho thấy nó xuất hiện đầu tiên ở Fukuoka, Nhật Bản vào năm 1884, sau đó dần lan rộng ra các vùng trồng lúa của nƣớc này. Tại Trung Quốc, bệnh đƣợc ghi nhận sớm nhất vào những năm 1930 và phát triển rộng khắp mƣời tỉnh khác vào cuối những năm 1950. Tuy nhiên, bệnh bạc lá chƣa thực sự đƣợc lƣu tâm cho đến những năm 1970, khi có sự mở rộng gieo trồng các giống lúa lai và lúa cao sản, cũng nhƣ sử dụng một lƣợng lớn phân đạm vào canh tác.

Bệnh bắt đầu phổ biến ở các nƣớc châu Á khác trong thời kỳ này, bao gồm Ấn Độ, Philippines, Nepal, Indonesia, Sri Lanka và bắt đầu trở thành đại dịch ảnh hƣởng đến nông nghiệp toàn cầu. Sau đó, bệnh cũng xuất hiện và gây hại cho các vùng trồng lúa ở Úc, Hoa Kỳ và các nƣớc Tây Phi. Đến nay, bệnh bạc lá đã có mặt ở hầu hết các quốc gia trồng lúa trên thế giới [30, 91]. Thiệt hại sản lƣợng lúa do bệnh bạc lá gây ra lên đến 26% đối với các giống lúa mẫn cảm với bệnh.

Vào những năm xảy ra dịch bệnh, Ấn Độ sụt giảm đến 60% sản lƣợng lúa; con số này ở Philippines là 22,5% [30]. Bệnh không chỉ ảnh hƣởng đến năng suất mà còn làm giảm chất lƣợng gạo do tác động đến các quá trình chuyển hóa trong cây (hô hấp, quang hợp.) ở giai đoạn trổ bông, làm tăng tỉ lệ hạt lép, hạt dễ dập nát khi xay [63]. Riêng ở Việt Nam, theo số liệu Cục Bảo vệ thực vật, diện tích lúa nhiễm bệnh bạc lá năm 2013 là 72.343 ha; năm 2016 con số này lên đến 149.045 ha bị nhiễm nặng. Năm 2018, diện tích nhiễm bệnh bạc lá là 24.542 ha trong đó nhiễm nặng trên 1.592 ha [http://ppd.

Các số liệu thống kê này cho thấy mặc dù đã đƣợc phát hiện từ lâu nhƣng cho đến nay, bệnh bạc lá vẫn đƣợc xếp là bệnh hại nghiêm trọng trong sản xuất lúa gạo không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới Ghi chú: Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới năm 2018. Vị trí phân bố bệnh bạc lá lúa được thể hiện bằng chấm màu vàng [62]. Nhiều nghiên cứu về bệnh bạc lá lúa đã bắt đầu đƣợc thực hiện từ những năm 1901 nhƣng đến năm 1922 các nhà khoa học mới phát hiện đƣợc nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn.

Năm 1990, tác nhân gây bệnh bạc lá lúa đƣợc xác định là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Bệnh bạc lá còn có một số tên gọi khác nhƣ bệnh BLB (bacterial leaf blight), bệnh kresek [114]. Xoo xâm nhiễm vào cây lúa thông qua các thủy khổng (hydathode) nằm ở ngọn và rìa lá. Vi khuẩn nhân lên trong khoảng gian bào của tế bào biểu mô có thành mỏng, sau đó đi vào mạch xylem, di chuyển dọc theo gân lá và lan rộng trong toàn bộ cây [73].

Xoo cũng có thể xâm nhập trực tiếp vào xylem tại các vết thƣơng ở lá và rễ.