MỞ ĐẦU Cây dƣợc liệu là nguồn thuốc thiết yếu đối với con ngƣời. Chúng có tác dụng chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe và góp phần xóa đói giảm nghèo. Theo tổ chức Y tế Thế Giới ƣớc tính khoảng 80% dân số thế giới phụ thuộc vào hệ thống chăm sóc truyền thống kết hợp với các sản phẩm từ tự nhiên bên cạnh đó, nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y - dƣợc ngày càng đƣợc quan tâm, phát triển, nhiều mô hình trồng cây dƣợc liệu đem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế nông nghiệp, tạo nguồn nguyên liệu ổn định cho ngành dƣợc phẩm. Thạch hộc tía Dendrobium officinale là một trong những loài lan rừng thuộc chi Dendrobium, vừa là cây làm cảnh vừa là cây làm thuốc quý hiếm, đã đƣợc đƣa vào “công ƣớc quốc tế về động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng”.
Về mặt y học, Thạch hộc tía có nhiều tác dụng nhƣ chống ung thƣ, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, chữa bệnh tiểu đƣờng, cao huyết áp (Chu, 2014; Nguyễn Thị Sơn và cộng sự, 2014). Vì sử dụng đƣợc tất cả các bộ phận của cây nên sau mỗi đợt thu hoạch cần lƣợng lớn cây giống để trồng mới lại. Các phƣơng pháp nhân giống vô tính ngoài tự nhiên có hệ số nhân giống thấp, không đồng đều, do vậy việc chọn lọc và tạo nguồn giống in vitro để đáp ứng nhu cầu của thị trƣờng là việc hết sức cần thiết. Với mục tiêu tạo ra nguồn cây giống đạt chất lƣợng cao, đồng đều, số lƣợng lớn, chúng tôi đề xuất thực hiện nội dung nghiên cứu: “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Thạch hộc tía Dendrobium officinale” 5 Chƣơng I.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về thạch hộc tía Dendrobium officinale Phân loại thực vật: Thạch hộc tía thuộc: - Giới: Plantae - Ngành: Magnoliophyta - Bộ: Asparagales - Họ: Orchidaceae - Chi: Dendrobium - Loài: Dendrobium officinale Hình 1. Cây và hoa thạch hộc tía Đặc điểm hình thái của Thạch hộc tía Thạch hộc tía là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30 – 50cm, thƣờng mọc thành bụi. Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5 – 3cm, có vân dọc.
Lá mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân, hầu nhƣ không có cuống, đầu lá hơi cuộn hình mỏng, có 5 gân dọc, dài 12 cm, rộng 2 - 3cm, cụm hoa ở kẽ lá. Hoa to, mọc thành chùm trên những cuống dài, mang 2 – 4 hoa có cánh môi hình bầu dục nhọn, cuốn thành phễu trong hoa, ở họng hoa có những điểm màu tím. Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở, hạt nhiều, mùa hoa bắt đầu nở từ tháng 2 đến 6 tháng 4, mùa quả bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 6. Cây mọc hoang ở rừng núi, trên cây gỗ và đƣợc trồng làm cảnh ở Việt Nam.
Đặc điểm phân bố Thạch hộc đƣợc phân bố ở nhiều nƣớc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ: Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma Hiện nay, Viên Nghiên cứu và Phát triển Nông lâm nghiệp Thành Tây đã khảo nghiệm và trồng Thạch hộc tía ở Hà Nội và Lâm Đồng (http://nongnghiep.vn) Thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý: Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Thạch hộc tía giàu polysacharide thạch hộc, alkaloid thạch hộc, các acid amine và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi lƣợng. Trong đó polysacharide thạch hộc chiếm tới 22%, hàm lƣợng các acid amine nhƣ glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lƣợng acid amine. Ngoài ra Thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù nhƣ phenanthryn, bibenzyl, keton, este và các chất nhầy, hợp chất amidon.
Trong thân Thạch hộc tía có hàm lƣợng alkaloid sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất amine đã đƣợc giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N- methyl-dendrobium, 8-epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng. Thân Thạch hộc có tinh dầu bay hơi, trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%. Theo y học hiện đại, thạch hộc tía có tác dụng chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, đƣợc sử dụng rộng rãi trong lâm sàng và làm các bài thuốc (thạch hộc tía có thể dùng đơn độc hoặc phối trộn với các dƣợc liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ thạch hộc đƣợc thị trƣờng đón nhận). Trong dƣợc điển có đề cập đến nhiều loài Thạch hộc nhƣng tốt nhất vẫn là Thạch hộc tía (http://nongnghiep.
Một số phƣơng pháp nuôi cấy trong nhân giống lan Dendrobium 1. Nuôi cấy trên môi trƣờng thạch (rắn) 7 Đây là phƣơng pháp nuôi cấy phổ biến nhất của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc sử dụng trong hầu hết các quy trình nhân giống nuôi cấy mô. Phƣơng pháp này có một số hạn chế nhƣ: tỷ lệ thất thoát cao do nhiễm khuẩn, nấm trong quá trình nuôi cấy; tỷ lệ sống thấp của cây cấy mô trong giai đoạn vƣờn ƣơm; chi phí nhân công cấy chuyền cao,… Phƣơng pháp nuôi cấy mô hoa lan chủ yếu là phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng thạch. Nhiều đối tƣợng Dendrobium đƣợc nhân giống in vitro trên môi trƣờng thạch nhƣ: Dendrobium Fimbriatum Hook (Nguyễn Thị Sơn và cộng sự, 2012; Hajong và cộng sự, 2013; Shi và cộng sự, 2013).
Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng Hiện nay, phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng trên đối tƣợng lan Dendrobium vẫn chƣa thấy công bố rộng rãi. Việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy này trên một số đối tƣợng khác nhƣ: Phalaenopsis (Jorge và cộng sự, 2007), Musa (Alvard và cộng sự, 1993) đã cho thấy hiệu quả rõ rệt. Khi nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng, mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn với môi trƣờng nên hấp thu tốt các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng (do đó sự phân chia tế bào và tăng sinh cơ quan, gia tăng hệ số nhân chồi, rễ, củ và phôi soma,…) Bên cạnh đó, trong môi trƣờng lỏng, các chất độc do mô tiết ra môi trƣờng xung quanh sẽ bị biến đổi nhanh chóng trƣớc khi chất độc ảnh hƣởng đến mô cấy. Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng thƣờng sử dụng nhằm mục đích nâng cao hệ số nhân chồi, PLBs, rễ, củ, nâng cao khả năng phát sinh phôi ở rất nhiều loài thực vật (Dƣơng Tấn Nhựt, 2007).
Phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng rắn, lỏng tĩnh và lỏng lắc cũng đƣợc khảo sát trên một số đối tƣợng khác nhƣ cây Sậy (Cavallaro, 2014), Hồ tiêu (Nguyễn Thị Huyền Trang và cộng sự, 2015). Kết quả cho thấy nuôi cấy lỏng lắc thích hợp cho giai đoạn tăng sinh chồi Vũ Thị Ngọc Lan và cộng sự (2013) đã tiến hành nhân giống in vitro lan Dendrobium Nobile Lindl. Tác giả đã khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức nuôi 8 cấy lỏng tĩnh, lỏng lắc và nuôi cấy trên môi trƣờng rắn. Hình thức nuôi cấy lỏng lắc sau 4 tuần nuôi cấy, hệ số nhân chồi cao hơn (2,26 lần) so với nuôi cấy lỏng tĩnh (1,2 lần) và nuôi cấy đặc (1,86 lần).
Trong khi đó, trên vật liệu nuôi cấy ban đầu là PLBs thì phƣơng thức nuôi cấy lỏng tĩnh không hiệu quả, PLBs không tăng sinh. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát sinh chồi 1. Chất điều hòa sinh trƣởng Nuôi cấy mô thực vật chủ yếu là kỹ thuật phối hợp sử dụng các chất điều hoà sinh trƣởng thực vật. Chất điều hoà sinh trƣởng thực vật nội sinh là những hợp chất hữu cơ đƣợc tổng hợp trong mô thực vật, với nồng độ rất thấp có thể gây ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật.
Nhiều chất tổng hợp đƣợc nhận thấy là có hoạt tính tƣơng tự nhƣ chất điều hoà sinh trƣởng nội sinh. Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, chất điều hoà sinh trƣởng ngoại sinh đƣợc thêm vào nhằm gây ảnh hƣởng lên sự phát triển. Tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà chúng ta sử dụng chất điều hoà riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau. Auxins Gồm dạng tự nhiên IAA (indole – 3- acetic acid) và dạng tổng hợp IBA (indole- 3-butyric acid), NAA (Naphthalene acetic acid) và 2,4 – D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid).
Trong các auxin thì NAA và IBA là 2 loại đƣợc sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô. IAA ít đƣợc sử dụng vì ít bền trong khi hấp khử trùng môi trƣờng. Auxin dạng tổng hợp có hoạt tính cao hơn so với IAA và có thêm thuận lợi là chúng không bị phân huỷ bởi enzyme hiện diện trong tế bào thực vật. Ngƣời ta còn sử dụng phối hợp với cytokinin trong việc tạo mô sẹo, nhân chồi… Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trƣởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trƣởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trƣởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2002).
Auxin chẳng những kích thích sự tăng trƣởng của chồi non mà còn khởi phát cho sự tạo mới. Ở nồng độ thấp và thƣờng dùng kết hợp với cytokinin thì 9 auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vƣợt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên. Sự kéo dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ƣu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao.
Nếu trong môi trƣờng chỉ cho chất điều hòa sinh trƣởng là auxin thì mô nuôi cấy chỉ xuất hiện rễ mà thôi. Còn nếu muốn tạo chồi để có cây hoàn chỉnh thì phải bổ sung vào môi trƣờng chất tạo chồi là cytokinin (Bùi Trang Việt, 2002). Cytokinins Cytokinin làm cho mô phồng lên, cảm ứng sự phát triển của chồi nách và chồi bất định, điều khiển sự phân chia tế bào. Cytokinin bền nhiệt và có thể bổ sung vào môi trƣờng trƣớc khi hấp vô trùng.
Nhóm cytokinin bao gồm dạng tự nhiên 2iP [dimethylallyl)aminopurine)aminopurine], zeatin và dạng tổng hợp là BAP (N6- benzylaminopurine) và Kinetin (6-furfurylaminopurine). Dạng tổng hợp có hoạt tính sinh học rất cao nên đƣợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô.Trong nhân giống thƣờng sử dụng BA nhiều hơn so với các chất khác trong nhóm cytokinin vì hoạt tính của nó cao và giá thành thấp. Sự sinh tổng hợp cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ). Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ.
Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thƣơng thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với auxin.