NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN PECTINASE TỪ NẤM MỐC TRONG Pichia pastoris

Nghiên cứu pectinase từ nấm mốc Aspergillus, biểu hiện trong Pichia pastoris. Ứng dụng tiềm năng trong chế biến thực phẩm, tăng hiệu suất và chất lượng.

• Tác giả: Phan Thị Thanh Diễm
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Quốc Dung
• Trường học: Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sàng Lọc Và Biểu Hiện Pectinase Từ Nấm Mốc Trong Pichia pastoris
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Huế

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 0.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 0.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 0.2.1. Mục tiêu chung
• 0.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 0.3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 0.3.1. Nội dung nghiên cứu
• 0.3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 0.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 0.5. CẤU TRÚC LUẬN ÁN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN
• 1.2. SƠ LƯỢC VỀ PECTINASE
• 1.3. NẤM MỐC Aspergillus SINH TỔNG HỢP PECTINASE
• 1.4. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN P. pastoris
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase
• 2.2.2. Xác định hàm lượng protein
• 2.2.3. Xác định một số đặc điểm hình thái và định danh loài
• 2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp pectinase
• 2.2.5. Tạo dòng gen mã hóa pectinase
• 2.2.6. Biểu hiện gen AspPecA trong P.
• 2.2.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện pectinase tái tổ hợp
• 2.2.8. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp
• 2.2.9. Xác định trọng lượng phân tử của pectinase
• 2.2.10. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ pectinase tái tổ hợp
• 2.2.11. Thử nghiệm ứng dụng pectinase tái tổ hợp
• 2.2.12. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP PECTINASE
• 3.1.1. Phân lập và xác định số lượng tế bào nấm mốc có khả năng phân giải pectin
• 3.1.2. Sơ tuyển chủng nấm mốc phân giải pectin và xác định hoạt độ enzyme
• 3.1.3. Định danh các chủng nấm mốc
• 3.1.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm mốc
• 3.2. TẠO DÒNG GEN PECTINASE VÀO HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN P.
• 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
• 3.2.2. Phân lập gen
• 3.2.3. Tạo dòng gen mã hóa pectinase trong vector pGEM®T-Easy
• 3.2.4. Giải trình tự gen mã hóa pectinase
• 3.2.5. Tạo dòng gen AspPecA vào vector biểu hiện pPICZαA
• 3.3. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN GEN
• 3.3.1. Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện rAspPecA
• 3.3.1.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào
• 3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
• 3.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
• 3.3.1.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
• 3.3.2. Khối lượng phân tử pectinase tái tổ hợp
• 3.3.3. Đánh giá tính chất lý hóa của rAspPecA
• 3.3.3.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ của rAspPecA
• 3.3.3.2. pH tối ưu và độ bền pH của rAspPecA
• 3.3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến độ bền của rAspPecA
• 3.3.3.4. Động học rAspPecA
• 3.4. THỬ NGHIỆM rAspPecA TRONG CHẾ BIẾN NƯỚC TRÁI CÂY VÀ KHẢ NĂNG BÓC VỎ TIÊU
• 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ rAspPecA đến quá trình làm trong nước ép táo
• 3.4.2. Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của rAspPecA
• 3.4.2.1. Hiệu suất bóc vỏ tiêu
• 3.4.2.2. Hàm lượng piperine
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Pectinase từ Nấm Mốc Tổng Quan Tiềm Năng Ứng Dụng

Pectinase là một nhóm enzyme quan trọng có khả năng phân giải pectin, một polysaccharide phức tạp cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Enzyme này có vai trò quan trọng trong nhiều ứng dụng công nghiệp, đặc biệt là trong chế biến thực phẩm, nơi nó được sử dụng để tăng hiệu suất chiết xuất, làm trong nước ép trái cây và cải thiện kết cấu sản phẩm. Nghiên cứu về pectinase từ nấm mốc đang thu hút sự quan tâm lớn, do khả năng sản xuất enzyme với chi phí thấp và hiệu quả cao. Các chủng nấm mốc, đặc biệt là từ chi Aspergillus, được biết đến với khả năng sinh tổng hợp pectinase mạnh mẽ, mở ra tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Việc nghiên cứu sàng lọc và cải thiện các chủng nấm mốc sản xuất pectinase là rất cần thiết để tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme.

1.1. Cấu trúc và Phân loại Enzyme Pectinase Khái niệm cơ bản

Pectinase là thuật ngữ chung cho một họ enzyme thủy phân pectin, bao gồm nhiều loại enzyme khác nhau, mỗi loại có cơ chế hoạt động riêng. Các enzyme này có thể được phân loại dựa trên cơ chế xúc tác (ví dụ: esterase, lyase) hoặc vị trí tấn công trên phân tử pectin (ví dụ: endo- hoặc exo-). Hiểu rõ cấu trúc và phân loại enzyme pectinase là rất quan trọng để lựa chọn và ứng dụng enzyme phù hợp cho từng mục đích cụ thể.

1.2. Ứng dụng Công nghiệp của Pectinase Thực phẩm và hơn thế nữa

Ứng dụng của pectinase rất đa dạng, trải dài từ ngành công nghiệp thực phẩm đến dệt may và sản xuất giấy. Trong công nghiệp thực phẩm, pectinase được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nước ép trái cây, rượu vang và các sản phẩm chế biến từ trái cây và rau quả khác. Pectinase giúp cải thiện hiệu suất chiết xuất, làm trong sản phẩm và nâng cao chất lượng cảm quan. Ngoài ra, enzyme này còn được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi và xử lý chất thải nông nghiệp. Theo tài liệu gốc, trong lĩnh vực chế biến trái cây, pectinase được sử dụng nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng và có tác dụng làm trong dịch quả

II. Thách Thức Sản Xuất Pectinase Chi Phí và Năng Suất

Mặc dù pectinase có nhiều ứng dụng tiềm năng, nhưng chi phí sản xuất cao và năng suất thấp vẫn là những thách thức lớn đối với việc ứng dụng rộng rãi enzyme này. Các phương pháp sản xuất pectinase truyền thống thường dựa vào việc nuôi cấy các chủng nấm mốc tự nhiên, dẫn đến năng suất không ổn định và chi phí thu hồi enzyme cao. Do đó, việc phát triển các phương pháp sản xuất pectinase hiệu quả hơn, chẳng hạn như sử dụng kỹ thuật di truyền và biểu hiện protein tái tổ hợp, là rất quan trọng để giảm chi phí và tăng năng suất. Đồng thời, việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và quy trình thu hồi enzyme cũng đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất.

2.1. Giới hạn từ Aspergillus niger Độc tố và Hoạt tính Tự nhiên thấp

Aspergillus niger được FDA công nhận là GRAS (Generally Recognized As Safe), là một trong những chủng nấm mốc được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất pectinase. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme tự nhiên của A. niger thường không đủ cao cho các ứng dụng công nghiệp và việc tinh sạch enzyme từ chủng này cũng gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, một số chủng A. niger có thể sản xuất độc tố nấm, gây lo ngại về an toàn thực phẩm. Vì vậy, việc sàng lọc các chủng A. niger không sinh độc tố và có hoạt tính pectinase cao là rất quan trọng.

2.2. Tạo dòng Biểu hiện gen Giải pháp cho sản xuất Pectinase

Để giải quyết các thách thức liên quan đến sản xuất pectinase, kỹ thuật di truyền và biểu hiện protein tái tổ hợp đã được sử dụng rộng rãi. Bằng cách tạo dòng và biểu hiện gen pectinase từ các chủng nấm mốc khác nhau trong các tế bào chủ khác nhau, người ta có thể sản xuất enzyme với năng suất cao, dễ tinh sạch và có các đặc tính mong muốn. Phương pháp này cho phép lựa chọn chủng loại pectinase và định hướng sinh tổng hợp pectinase ngoại bào, mở ra tiềm năng phát triển thành sản phẩm thương mại. Ở Việt Nam hiện vẫn chưa có công bố nào nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen pectinase

2.3. Chi phí sản xuất enzyme Làm sao để tối ưu và giảm chi phí

Chi phí sản xuất là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng cạnh tranh của enzyme pectinase. Để giảm chi phí sản xuất, cần tối ưu hóa tất cả các khâu trong quy trình, từ sàng lọc chủng nấm mốc đến thu hồi và tinh sạch enzyme. Sử dụng các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền, cải thiện hiệu quả sử dụng năng lượng và tái chế chất thải có thể giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất. Việc nghiên cứu các phương pháp biểu hiện enzyme hiệu quả hơn cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giảm chi phí sản xuất.

III. Pichia pastoris Nền tảng Biểu Hiện Pectinase Tái Tổ Hợp Tiềm Năng

Pichia pastoris là một loại nấm men được sử dụng rộng rãi làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp do có nhiều ưu điểm so với các hệ thống khác. P. pastoris có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng thao tác di truyền, có thể đạt được mật độ tế bào cao trong quá trình nuôi cấy, và có khả năng tiết protein ngoại bào, giúp đơn giản hóa quá trình thu hồi enzyme. Việc sử dụng P. pastoris để biểu hiện pectinase tái tổ hợp từ nấm mốc có thể giúp tăng năng suất, giảm chi phí và cải thiện chất lượng enzyme.

3.1. Ưu điểm của Pichia pastoris Năng suất cao dễ dàng di truyền

Pichia pastoris có nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện protein khác. P. pastoris có khả năng sinh trưởng nhanh và đạt được mật độ tế bào cao trong quá trình nuôi cấy, giúp tăng năng suất protein. P. pastoris cũng dễ dàng thao tác di truyền, cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các chủng nấm men biểu hiện protein với năng suất cao và các đặc tính mong muốn. Hơn nữa, P. pastoris có khả năng tiết protein ngoại bào, giúp đơn giản hóa quá trình thu hồi và tinh sạch enzyme.

3.2. Tối ưu hóa Nuôi cấy Pichia pastoris Yếu tố then chốt để thành công

Để đạt được năng suất pectinase cao trong Pichia pastoris, cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen và nồng độ oxy hòa tan có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào và hiệu quả biểu hiện protein. Bằng cách điều chỉnh các yếu tố này, người ta có thể tạo ra các điều kiện tối ưu cho việc sản xuất pectinase trong P. pastoris.

3.3. Vector Biểu Hiện và Gen Mục Tiêu AspPecA AspPecB AspPecC

Việc lựa chọn vector biểu hiện và gen mục tiêu phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả biểu hiện pectinase trong P. pastoris. Các vector biểu hiện thường chứa các promoter mạnh, các tín hiệu khởi đầu dịch mã hiệu quả và các gen đánh dấu chọn lọc. Các gen pectinase từ nấm mốc, chẳng hạn như AspPecA, AspPecB và AspPecC từ Aspergillus niger, đã được biểu hiện thành công trong P. pastoris, cho thấy tiềm năng của hệ thống này trong sản xuất enzyme quy mô công nghiệp.

IV. Sàng Lọc Pectinase từ Nấm Mốc Phương Pháp Kết Quả Nghiên Cứu

Quá trình sàng lọc pectinase từ nấm mốc đòi hỏi một quy trình chặt chẽ để xác định các chủng có khả năng sản xuất enzyme với hoạt tính cao. Các phương pháp sàng lọc thường bao gồm việc phân lập nấm mốc từ các nguồn tự nhiên, kiểm tra khả năng phân giải pectin trên môi trường thạch và định lượng hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số chủng nấm mốc, đặc biệt là từ chi Aspergillus, có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính cao, mở ra tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau.

4.1. Phân lập Nấm Mốc Tìm kiếm chủng sản xuất Pectinase hiệu quả

Việc phân lập nấm mốc từ các nguồn tự nhiên là bước đầu tiên trong quá trình sàng lọc pectinase. Các mẫu được thu thập từ các nguồn giàu pectin, chẳng hạn như vỏ trái cây và rau quả, và được nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc để phân lập các chủng nấm mốc có khả năng phân giải pectin. Các chủng nấm mốc phân lập được sau đó được kiểm tra khả năng sản xuất pectinase bằng các phương pháp sàng lọc khác nhau. Theo tài liệu gốc, các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh pectinase được phân lập từ một số mẫu vỏ, quả trái cây giàu pectin

4.2. Môi trường Thạch Pectin Đánh giá khả năng phân giải Pectin

Môi trường thạch chứa pectin được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng phân giải pectin của các chủng nấm mốc. Khi một chủng nấm mốc có khả năng sản xuất pectinase được nuôi cấy trên môi trường này, enzyme sẽ phân giải pectin xung quanh khuẩn lạc, tạo ra một vùng trong suốt. Đường kính của vùng trong suốt này tỉ lệ thuận với hoạt tính enzyme của chủng nấm mốc, cho phép các nhà nghiên cứu đánh giá khả năng sản xuất pectinase của các chủng khác nhau.

4.3. Định lượng Hoạt tính Enzyme Xác định chủng Pectinase tiềm năng

Để xác định các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất pectinase tiềm năng, cần định lượng hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy. Các phương pháp định lượng hoạt tính enzyme thường dựa trên việc đo lượng sản phẩm được tạo ra từ quá trình phân giải pectin bởi pectinase. Các chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cao được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và phát triển.

V. Ứng Dụng Pectinase Tái Tổ Hợp Chế Biến Thực Phẩm Bóc Vỏ Tiêu

Pectinase tái tổ hợp được sản xuất từ Pichia pastoris có nhiều ứng dụng tiềm năng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong ngành công nghiệp thực phẩm, pectinase được sử dụng để làm trong nước ép trái cây, cải thiện hiệu suất chiết xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm. Ngoài ra, pectinase còn được ứng dụng trong quá trình bóc vỏ tiêu, giúp giảm thời gian và chi phí sản xuất. Việc sử dụng pectinase tái tổ hợp có thể mang lại nhiều lợi ích so với việc sử dụng các chế phẩm pectinase truyền thống, bao gồm năng suất cao hơn, chất lượng ổn định hơn và chi phí thấp hơn.

5.1. Làm trong Nước Ép Táo Pectinase cải thiện độ trong như thế nào

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của pectinase trong ngành công nghiệp thực phẩm là làm trong nước ép trái cây. Pectin là một polysaccharide tự nhiên có trong trái cây, có thể gây ra hiện tượng đục trong nước ép. Bằng cách phân giải pectin, pectinase giúp cải thiện độ trong và làm tăng giá trị cảm quan của nước ép trái cây.

5.2. Bóc Vỏ Tiêu Hiệu quả và Hàm lượng Piperine sau xử lý

Pectinase cũng được sử dụng trong quá trình bóc vỏ tiêu, giúp loại bỏ lớp vỏ ngoài của hạt tiêu một cách dễ dàng. Việc sử dụng pectinase có thể giúp giảm thời gian và chi phí sản xuất, đồng thời cải thiện chất lượng sản phẩm. Điều quan trọng là phải kiểm soát quá trình bóc vỏ tiêu bằng pectinase để đảm bảo rằng hàm lượng piperine, một hợp chất quan trọng có trong hạt tiêu, không bị ảnh hưởng.rAspPecA có khả năng làm trong nước ép táo và làm tăng khả năng bóc vỏ tiêu

5.3. Ứng dụng khác Cải thiện quy trình trong công nghiệp thực phẩm

Ngoài làm trong nước ép táo và bóc vỏ tiêu, pectinase còn được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác trong ngành công nghiệp thực phẩm, bao gồm sản xuất rượu vang, mứt, và các sản phẩm chế biến từ trái cây và rau quả khác. Pectinase giúp cải thiện hiệu suất chiết xuất, làm tăng độ nhớt và nâng cao chất lượng cảm quan của sản phẩm. Việc nghiên cứu và phát triển các ứng dụng mới của pectinase trong ngành công nghiệp thực phẩm đang tiếp tục được tiến hành.

VI. Nghiên Cứu Pectinase Kết Luận và Hướng Phát Triển Tương Lai

Nghiên cứu về pectinase từ nấm mốc đã đạt được nhiều tiến bộ đáng kể trong những năm gần đây. Việc sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính cao, biểu hiện pectinase tái tổ hợp trong Pichia pastoris và phát triển các ứng dụng mới của enzyme trong ngành công nghiệp thực phẩm đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc ứng dụng pectinase trong quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần được giải quyết, bao gồm giảm chi phí sản xuất, cải thiện độ ổn định của enzyme và mở rộng phạm vi ứng dụng.

6.1. Nghiên cứu sâu về enzyme Pectinase Cấu trúc Chức năng Cơ chế

Để hiểu rõ hơn về pectinase và tối ưu hóa hiệu quả sử dụng enzyme, cần tiếp tục nghiên cứu sâu về cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của pectinase. Các nghiên cứu về cấu trúc protein có thể giúp xác định các vùng quan trọng cho hoạt tính enzyme và độ ổn định, từ đó giúp thiết kế các enzyme pectinase có các đặc tính mong muốn.

6.2. Tạo đột biến cải thiện enzyme Pectinase Bước tiến mới trong kỹ thuật

Kỹ thuật tạo đột biến có thể được sử dụng để cải thiện các đặc tính của pectinase, chẳng hạn như hoạt tính enzyme, độ ổn định và khả năng chịu nhiệt. Bằng cách tạo ra các đột biến ngẫu nhiên hoặc có định hướng trong gen pectinase, người ta có thể tạo ra các enzyme có các đặc tính vượt trội so với enzyme tự nhiên. rAspPecA với nồng độ 2.400 U/L đã làm giảm độ đục của nước ép táo 29%; đồng thời với nồng độ 1.800 U/L cho hiệu suất bóc vỏ tiêu cao hơn 90% sau 96 giờ so với đối chứng

6.3. Ứng dụng Pectinase trong công nghiệp Xu hướng phát triển

Việc mở rộng phạm vi ứng dụng của pectinase trong các ngành công nghiệp khác nhau là một xu hướng phát triển quan trọng. Ngoài ngành công nghiệp thực phẩm, pectinase còn có tiềm năng ứng dụng trong các ngành công nghiệp dệt may, giấy, và xử lý chất thải nông nghiệp. Nghiên cứu và phát triển các ứng dụng mới của pectinase có thể giúp tạo ra các sản phẩm và quy trình sản xuất thân thiện với môi trường và tiết kiệm chi phí.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 9 42 02 01) của nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Diễm, được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Quốc Dung và PGS. Phạm Thị Ngọc Lan (năm 2024), có tên đề tài: "Nghiên cứu sàng lọc và biểu hiện pectinase từ nấm mốc trong Pichia pastoris". Công trình được biên soạn trong 135 trang A4 (không kể tài liệu tham khảo), bao gồm: Mở đầu (4 trang), Tổng quan tài liệu (35 trang), Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu (19 trang), Kết quả nghiên cứu và thảo luận (63 trang), Kết luận và Kiến nghị (2 trang), Danh mục công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (22 trang); đi kèm 9 bảng số liệu và 52 hình vẽ, đồ thị, ảnh điện di.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Pectinase là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân các cơ chất pectin, phân cắt polygalacturonic acid thành monogalacturonic acid thông qua việc mở các liên kết glycosid và phá vỡ liên kết ester giữa các nhóm carboxyl và methyl. Enzyme này giữ vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, lên men cotton, tách sợi thực vật, lên men trà, cà phê và sản xuất thức ăn gia súc. Đặc biệt, trong ngành chế biến quả, pectinase được ứng dụng để tăng hiệu suất thu hồi dịch bào, nâng cao chất lượng và làm trong dịch quả.

Trên thực tế, nấm mốc chi Aspergillus, đặc biệt là loài Aspergillus niger—vi sinh vật được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận đạt chuẩn GRAS (Generally Recognized As Safe)—đã được sử dụng để sản xuất pectinase nhờ đặc tính không sinh độc tố nấm hoặc kháng sinh trong điều kiện sản xuất enzyme. Tuy nhiên, hoạt độ của pectinase tự nhiên sinh tổng hợp từ các chủng hoang dại chưa đủ cao cho các quy trình công nghiệp và quy trình tinh sạch gặp nhiều phức tạp, dẫn tới giá thành chế phẩm thương phẩm ở mức cao.

Để khắc phục rào cản này, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tạo dòng và biểu hiện ngoại bào gen mã hóa pectinase trong các tế bào chủ dị chủng như nấm men Pichia pastoris là giải pháp cho phép định hướng sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính cao, thuận lợi cho tinh sạch và phát triển thành sản phẩm thương mại. Tại thời điểm nghiên cứu, ở Việt Nam chưa có bất kỳ công bố nào về việc tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa pectinase từ nấm mốc trong tế bào chủ nấm men. Luận án được triển khai nhằm lấp đầy khoảng trống kỹ thuật này bằng việc khai thác nguồn gen pectinase bản địa và biểu hiện thành công trong hệ thống P. pastoris.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hệ thống mục tiêu nghiên cứu cụ thể như sau:

• Mục tiêu chung: Tạo được nguồn pectinase tái tổ hợp từ nấm mốc có tiềm năng ứng dụng trong công nghệ chế biến thực phẩm.
• Mục tiêu cụ thể:
  1. Phân lập và tuyển chọn được chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao.
  2. Phân lập, tạo dòng và biểu hiện được gen mã hóa pectinase từ chủng nấm mốc được tuyển chọn trong P. pastoris.
  3. Đánh giá được khả năng ứng dụng chế phẩm pectinase tái tổ hợp trong lĩnh vực chế biến thực phẩm (làm trong nước ép táo và tăng hiệu suất bóc vỏ tiêu).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao phân lập từ tự nhiên; các gen mã hóa pectinase (AspPecA, AspPecB, AspPecC); hệ thống vector biểu hiện và chủng nấm men Pichia pastoris X33; chế phẩm pectinase tái tổ hợp (rAspPecA); dịch nước ép táo và hạt tiêu đen nguyên liệu.
• Phạm vi không gian: Các mẫu vỏ quả giàu pectin (cam, chanh, bưởi, quýt, chuối, xoài, táo, khoai tây, cà rốt, thanh long) được thu thập tại 4 chợ truyền thống trên địa bàn thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế: Chợ Bến Ngự, Chợ An Cựu, Chợ Cống, Chợ Phước Vĩnh. Các thí nghiệm ứng dụng bóc vỏ tiêu được thực hiện trên các nguồn hạt tiêu có xuất xứ từ Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Kon Tum. Toàn bộ các nội dung nghiên cứu thực nghiệm được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
• Phạm vi thời gian: Mẫu nấm mốc được thu thập và phân lập qua 8 đợt trong năm 2017 (từ ngày 01/6/2017 đến ngày 02/8/2017). Luận án được hoàn thành và bảo vệ vào năm 2024.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước trong và ngoài nước

Trong phần tổng quan tài liệu, tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cấu trúc pectin, hệ enzyme pectinase, đặc điểm sinh học của nấm mốc chi Aspergillus, các hệ thống biểu hiện dị chủng và tình hình tạo dòng gen pectinase:

• Nghiên cứu về hệ thống biểu hiện P. pastoris: Trích dẫn công trình của Kielkopf và cộng sự (2021) khẳng định P. pastoris là một trong những hệ thống hữu ích và linh hoạt nhất để biểu hiện protein dị chủng, sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội so với Saccharomyces cerevisiae về khả năng biểu hiện mức độ cao và tiết trực tiếp protein ngoại bào vào môi trường nuôi cấy.
• Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectinase trên thế giới:
  • Liu và cộng sự (2014) đã tạo dòng thành công gen endo-galacturonase A (pgaA) từ chủng A. niger JL-15 và biểu hiện trong P. pastoris.
  • Xu và cộng sự khuếch đại gen mã hóa pectin lyase (PNL-ZJ5A) từ A. niger.
  • Abdulrachman và cộng sự (2017) đã biểu hiện thành công gen endo-polygalacturonase (endoPG) từ A. niger.
  • Zhang và cộng sự (2018) tạo dòng và biểu hiện gen pectin methylesterase (PME-ZJ5A) từ A. niger ZJ5 trong P. pastoris.
  • Famotemi và cộng sự (2021) đã thực hiện tinh sạch và xác định đặc tính sinh hóa của pectinase từ chủng nấm mốc hoang dại A. niger F7-02.
  • Liu và cộng sự (2022) cùng Zhang và cộng sự (2018) tiếp tục công bố các nghiên cứu biểu hiện các gen pectin lyase và pectin methylesterase từ chủng A. niger ZJ5 trong hệ thống nấm men P. pastoris.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết

Tổng quan tài liệu cho thấy, dù trên thế giới việc tạo dòng các gen mã hóa các phân lớp pectinase từ nấm mốc Aspergillus sang P. pastoris đã đạt được nhiều kết quả, tại Việt Nam chưa có bất kỳ công trình nào công bố việc phân lập, tạo dòng và biểu hiện gen pectinase từ nấm mốc trong tế bào chủ nấm men. Các ứng dụng thực tế trong nước chủ yếu dùng chế phẩm enzyme thương phẩm nhập nội hoặc dịch chiết thô từ nấm hoang dại với độ tinh khiết và hoạt tính không ổn định. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách: tuyển chọn chủng A. niger bản địa có hoạt tính phân giải pectin tốt; tách dòng và giải trình tự 3 gen pectinase (AspPecA, AspPecB, AspPecC); tối ưu biểu hiện gen cAspPecA trong P. pastoris X33; xác định các đặc tính lý hóa của enzyme tái tổ hợp rAspPecA và thử nghiệm xử lý làm trong nước quả cũng như hỗ trợ bóc vỏ tiêu.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết cấu trúc pectin và cơ chế thủy phân của pectinase: Pectin là polysaccharide cấu trúc có mặt tại vách tế bào sơ cấp và phiến giữa của mô thực vật bậc cao (quả, củ, thân), cấu tạo chủ yếu từ mạch homopolymer poly-α-(1,4)-D-galacturonic acid được methyl hóa một phần. Pectinase thủy phân các liên kết glycosid α-(1,4) hoặc liên kết ester giữa carboxyl và methyl, giải phóng các sản phẩm gồm galacturonic acid, galactose, arabinose, methanol.
• Đặc điểm phân loại nấm mốc chi Aspergillus: Nhận diện dựa trên cơ quan sinh bào tử trần đặc trưng phát sinh từ tế bào chân (podocyte) có vách dày, phát triển thành giá bào tử trần (conidiophore/stipe) mang bọng đỉnh (vesicle) và thể bình.
• Hệ thống biểu hiện P. pastoris X33: Dựa trên cơ chế điều hòa phiên mã mạnh của promoter AOX1 (alcohol oxidase 1) cảm ứng bằng methanol, sử dụng peptide tín hiệu tiết để bài xuất enzyme tái tổ hợp ra ngoài tế bào, tạo thuận lợi cho quá trình thu nhận và tinh chế.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp đồng bộ các phương pháp vi sinh học cổ điển, sinh học phân tử, hóa sinh học enzyme và đánh giá ứng dụng thực nghiệm:

• Phương pháp vi sinh học và sinh lý nuôi cấy:
  • Thu thập mẫu từ các loại vỏ quả giàu pectin; phân lập trên môi trường chọn lọc.
  • Sơ tuyển trực tiếp khả năng phân giải pectin trên môi trường thạch Czapek-pectin, đo đường kính vòng phân giải pectin (ĐKVPGP, mm) sau khi nhuộm chỉ thị.
  • Sơ tuyển gián tiếp trong môi trường dịch thể; thu sinh khối khô (mg/mL); xác định hoạt độ pectinase (U/mL) và hàm lượng protein tổng số.
  • Định danh nấm mốc bằng phương pháp hình thái học khuẩn lạc và quan sát hiển vi cấu trúc giá bào tử, thể bình, bọng đỉnh.
  • Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp enzyme: thời gian nuôi cấy (24–144 giờ), pH ban đầu của môi trường (từ pH 4,0 đến 8,0), nguồn carbon (glucose, sucrose, pectin...) và nguồn nitrogen (cao men, peptone, urê, ammonium sulfat...).
• Phương pháp sinh học phân tử và tạo dòng gen:
  • Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc bằng đệm CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide).
  • Phản ứng PCR khuếch đại các gen mã hóa pectinase (AspPecA, AspPecB, AspPecC) sử dụng cặp mồi đặc hiệu; kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 0,8% cùng thang chuẩn GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
  • Tạo dòng gen vào vector tách dòng pGEM®-T Easy (Promega); biến nạp vào tế bào vi khuẩn Escherichia coli; kiểm tra dòng tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc và phản ứng cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI (thang chuẩn PreciGene 1 kb DNA Ladder).
  • Giải trình tự nucleotide bằng phương pháp Sanger; phân tích tin sinh học: xác định peptide tín hiệu bằng phần mềm SignalP-4.0; mô hình hóa cấu trúc không gian 3D của protein bằng công cụ Phyre2.
  • Chuyển gen cAspPecA (gen tổng hợp nhân tạo tối ưu mã bộ ba) vào vector biểu hiện pPICZαA (cắt nối bằng EcoRI và XbaI); biến nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris X33; sàng lọc thể tái tổ hợp mang vector pPICZαA/cAspPecA bằng PCR cặp mồi đặc hiệu và cặp mồi AOX1, đối chứng với chủng hoang dại GS115 và X33.
• Phương pháp biểu hiện và hóa sinh enzyme:
  • Tối ưu hóa điều kiện lên men cảm ứng sinh tổng hợp rAspPecA: khảo sát mật độ tế bào ban đầu ($OD_{600}$), thời gian cảm ứng methanol (24–96 giờ), nồng độ chất cảm ứng methanol (0,5%–2,0%), tốc độ lắc (150–250 rpm).
  • Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel/trao đổi ion thu hồi từng phân đoạn.
  • Phân tích khối lượng phân tử và độ sạch của rAspPecA bằng điện di SDS-PAGE sử dụng thang protein PageRuler™ Prestained Protein (Thermo Scientific) và nhuộm zymogram với dung dịch Lugol 0,05% và Coomassie Brilliant Blue.
  • Xác định các đặc tính lý hóa của enzyme rAspPecA: dải nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt; pH tối ưu và độ bền pH; ảnh hưởng của các ion kim loại ($Na^+$, $K^+$, $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Zn^{2+}$) và chất ức chế EDTA; xác định thông số động học enzyme ($K_m$, $V_{max}$).
• Phương pháp thử nghiệm ứng dụng:
  • Làm trong nước ép táo: xử lý dịch nước ép với các nồng độ rAspPecA khác nhau, đo độ giảm độ đục quang học.
  • Bóc vỏ hạt tiêu: ủ hạt tiêu đen từ 3 vùng (Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum) với chế phẩm rAspPecA ở các nồng độ và thời gian khác nhau; đánh giá tỷ lệ bóc vỏ sạch vỏ ngoài; định lượng hàm lượng hoạt chất piperine sau xử lý bằng phương pháp quang phổ/HPLC.
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê, so sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép kiểm nghiệm Duncan (Duncan's multiple range test) ở mức ý nghĩa $p < 0,05$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần Mở đầu (4 trang) thiết lập cơ sở khoa học của đề tài: tổng quan vai trò của pectinase trong công nghiệp chế biến; phân tích tính an toàn của chủng Aspergillus niger (GRAS); chỉ rõ nhược điểm của enzyme tự nhiên và khẳng định tính cấp thiết của việc áp dụng kỹ thuật di truyền biểu hiện pectinase trong nấm men P. pastoris. Phần này xác lập mục tiêu chung, 3 mục tiêu cụ thể, nội dung nghiên cứu, phạm vi nghiên cứu và công bố 3 điểm đóng góp mới của luận án.

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 (35 trang) trình bày có hệ thống 5 chuyên đề lý thuyết:

1. Giới thiệu chung về pectin: Cấu trúc hóa học homopolymer poly-α-(1,4)-galacturonic acid, vị trí phân bố tại phiến giữa và vách sơ cấp tế bào thực vật.
2. Sơ lược về pectinase: Phân loại, cơ chế xúc tác phân cắt liên kết glycosid và ester tạo monogalacturonic acid, galactose, arabinose, methanol; ứng dụng trong thu hồi và làm trong dịch quả.
3. Nấm mốc Aspergillus sinh tổng hợp pectinase: Đặc điểm hình thái học phân loại (tế bào chân, giá bào tử conidiophore, bọng đỉnh, thể bình); năng lực tiết enzyme của chi Aspergillus.
4. Hệ thống biểu hiện P. pastoris: Đặc tính di truyền, ưu thế phiên mã dưới promoter AOX1, khả năng bài xuất ngoại bào, quá trình cuộn gập và biến đổi sau dịch mã so với S. cerevisiae.
5. Tình hình nghiên cứu sàng lọc và biểu hiện gen pectinase: Lịch sử các nghiên cứu quốc tế từ năm 2014 đến 2022 (Liu, Xu, Abdulrachman, Zhang, Famotemi); khẳng định chưa có nghiên cứu trong nước nào về biểu hiện pectinase trong P. pastoris.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 (19 trang) mô tả toàn bộ nguồn gốc sinh phẩm, hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm:

• Vật liệu: 20 mẫu vỏ quả thu thập tại 4 chợ ở Huế qua 8 đợt; chủng P. pastoris X33; vector tách dòng pGEM®-T Easy, vector biểu hiện pPICZαA; các mẫu hạt tiêu đen Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum; dịch ép táo.
• Phương pháp: Trình bày chi tiết 12 quy trình nghiên cứu từ phân lập, xác định hàm lượng protein, định danh hình thái, khảo sát điều kiện nuôi cấy, tách chiết DNA bằng CTAB, phản ứng PCR, tạo dòng, giải trình tự, biến nạp nấm men, tối ưu lên men cảm ứng, tinh sạch enzyme, điện di SDS-PAGE, xác định tính chất lý hóa, động học enzyme đến quy trình xử lý nước ép táo và bóc vỏ tiêu kèm phương pháp phân tích thống kê Duncan ($p < 0,05$).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 (63 trang) là phần nội dung chính của luận án, được chia thành 3 phần thực nghiệm lớn:

3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp pectinase

• Số lượng tế bào nấm mốc trong các mẫu: Tác giả phân lập được 113 chủng nấm mốc từ 20 mẫu vỏ quả qua 8 đợt thu mẫu. Mật độ nấm mốc phân giải pectin dao động từ $6,3 \times 10^3$ CFU/g (mẫu cam sành MA2) đến $35,1 \times 10^3$ CFU/g (mẫu bưởi đỏ Huế MA19).

Đợt phân lập	Loại mẫu (vỏ)	Ký hiệu mẫu	Số chủng nấm mốc	pH mẫu	CFU/g mẫu ($\times 10^3$)
Đợt 1 (01/6/2017)	Bưởi da xanh	MA1	M1–M5	6,7	$18,1^g$
	Cam sành	MA2	M6–M7	4,5	$6,3^l$
	Bưởi da xanh	MA3	M8–M13	6,4	$20,2^f$
Đợt 2 (12/6/2017)	Quýt đường	MA4	M14–M17	4,8	$14,6^i$
	Chuối ba lùn	MA5	M18–M20	5,8	$7,1^k$
Đợt 3 (14/6/2017)	Bưởi đỏ	MA6	M21–M23	6,1	$10,2^j$
	Cam sành	MA7	M24–M25	5,1	$6,6^{kl}$
Đợt 4 (28/6/2017)	Bưởi da xanh	MA8	M26–M32	6,9	$16,2^h$
	Bưởi năm roi	MA9	M33–M39	5,1	$17,4^{gh}$
Đợt 5 (04/7/2017)	Cam dòng	MA10	M40–M45	4,5	$22,2^e$
	Chuối tiêu	MA11	M46–M49	5,9	$20,1^f$
	Chanh	MA12	M50–M53	4,1	$16,6^h$
Đợt 6 (08/7/2017)	Táo	MA13	M54–M59	5,2	$14,1^i$
	Xoài	MA14	M60–M61	4,7	$10,3^j$
	Thanh long	MA15	M62–M65	5,1	$18,1^g$
Đợt 7 (11/7/2017)	Khoai tây	MA16	M66–M74	5,8	$26,1^c$
	Cà rốt	MA17	M75–M81	6,5	$24,3^d$
	Bưởi Thanh trà Huế	MA18	M82–M92	6,1	$30,3^b$
Đợt 8 (02/8/2017)	Bưởi đỏ Huế	MA19	M93–M107	6,21	$35,1^a$
	Bưởi đỏ	MA20	M108–M113	6,02	$26,1^c$

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với $p < 0,05$ theo Duncan's test).

• Sơ tuyển khả năng phân giải pectin:
  • Sơ tuyển trực tiếp: Kiểm tra 113 chủng trên thạch Czapek-pectin phân loại thành 4 nhóm năng lực:

Khả năng phân giải pectin	Đường kính vòng phân giải pectin (ĐKVPGP, mm)	Số chủng	Tỷ lệ (%)
Yếu	$\le 5$	62	54,9
Trung bình	$> 5$ và $\le 10$	27	23,9
Mạnh	$> 10$ và $\le 15$	14	12,3
Rất mạnh	$> 15$	10	8,9

• Sơ tuyển gián tiếp: Đánh giá chi tiết 11 chủng đại diện có hoạt tính cao về sinh khối khô, ĐKVPGP và hoạt độ pectinase:

Chủng nấm mốc	Sinh khối khô (mg/mL)	Đường kính vòng phân giải pectin (mm)	Hoạt độ pectinase (U/mL)
M1	$8,6^a$	$32,7^a$	$112,1^a$
M4	$5,6^b$	$28,7^b$	$24,8^d$
M8	$4,4^d$	$19,0^i$	$34,3^c$
M10	$5,4^b$	$27,8^e$	$10,9^e$
M13	$4,2^e$	$28,5^c$	$9,9^g$
M45	$6,0^a$	$29,3^a$	$110,2^a$
M46	$4,8^c$	$28,3^d$	$7,4^i$
M68	$5,6^b$	$24,3^g$	$98,5^b$
M95	$4,8^c$	$21,2^h$	$8,4^h$
M108	$4,0^f$	$24,3^g$	$10,4^f$
M111	$3,4^g$	$26,2^f$	$10,9^e$

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$ theo Duncan's test).

• Định danh loài: Dựa trên đặc điểm hình thái học khuẩn lạc và cấu trúc vi học, 4 chủng nấm mốc ưu tú được phân loại:
  • Chủng M1: Aspergillus oryzae
  • Chủng M13: Aspergillus niger (phân lập từ mẫu vỏ bưởi da xanh MA3)
  • Chủng M45: Aspergillus oryzae
  • Chủng M68: Aspergillus flavus
• Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase:
  • Thời gian: Chủng A. oryzae M1 đạt sinh khối và hoạt tính cực đại tại 72 giờ; A. niger M13 đạt sinh khối cực đại tại 48 giờ; A. oryzae M45 đạt cực đại tại 120 giờ.
  • pH môi trường: Cả 3 chủng A. oryzae M1, A. niger M13 và A. oryzae M45 đều có giá trị pH tối ưu là 6,5.
  • Nguồn carbon và nitrogen: Các chủng thể hiện sự tích lũy sinh khối và kích thước vòng phân giải pectin khác nhau khi thay đổi nguồn cơ chất bổ sung. Chủng A. niger M13 được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu sinh học phân tử do thuộc loài an toàn vi sinh học (GRAS).

3.2. Tạo dòng gen pectinase vào hệ thống vector biểu hiện P. pastoris

• Tách chiết DNA và phân lập gen: Tách thành công DNA tổng số từ A. niger M13 bằng đệm CTAB cho vạch đậm trên gel agarose ở kích thước $\ge 10$ kb. Phản ứng PCR nhân thành công 3 gen mã hóa pectinase: AspPecA, AspPecB, AspPecC.
• Tạo dòng trong pGEM®-T Easy: Cả 3 đoạn gen được gắn thành công vào vector pGEM®-T Easy, kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc và phản ứng cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI giải phóng đúng kích thước phân đoạn chèn.
• Giải trình tự gen và phân tích tin sinh học:
  • Kích thước trình tự: Gen AspPecA dài 1.237 bp (mã hóa chuỗi polypeptide gồm 362 amino acid); gen AspPecB dài 1.728 bp (mã hóa chuỗi polypeptide gồm 495 amino acid); gen AspPecC dài 1.338 bp (mã hóa chuỗi polypeptide gồm 384 amino acid).
  • Đăng ký GenBank: Ba gen được cấp mã số đăng ký quốc tế lần lượt là MT502411 (AspPecA), MT502412 (AspPecB) và MT502413 (AspPecC).
  • Phân tích bằng SignalP-4.0 cho thấy AspPecA, AspPecB, AspPecC mang trình tự peptide tín hiệu có độ dài lần lượt là 18, 16 và 19 amino acid.
  • Dự đoán cấu trúc không gian 3D của ba protein bằng công cụ Phyre2 cho thấy các nếp gấp đặc trưng của họ enzyme pectinase.
• Tạo dòng và biểu hiện trong P. pastoris X33:
  • Gen nhân tạo cAspPecA (tối ưu hóa theo bảng mã di truyền của nấm men) được cắt nối vào vector pPICZαA bằng cặp enzyme EcoRI và XbaI.
  • Biến nạp vector tái tổ hợp pPICZαA/cAspPecA vào nấm men P. pastoris X33. Thể biến nạp được xác nhận bằng PCR sử dụng cặp mồi gen đặc hiệu và cặp mồi AOX1.
  • Kiểm tra sự biểu hiện: Các thể biến nạp tạo vòng phân giải pectin rõ rệt trên đĩa thạch và sinh tổng hợp enzyme ngoại bào vào dịch nuôi cấy.
• Khảo sát điều kiện lên men cảm ứng và đặc tính rAspPecA:
  • Hoạt độ rAspPecA được khảo sát qua các yếu tố: mật độ tế bào ban đầu, thời gian cảm ứng methanol, nồng độ methanol cảm ứng và tốc độ lắc.
  • Khối lượng phân tử của rAspPecA xác định qua điện di SDS-PAGE và zymogram (nhuộm Lugol 0,05% và Coomassie Brilliant Blue) đạt khoảng 42 kDa.
  • Đánh giá tính chất hóa sinh: Xác định dải nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, pH tối ưu, độ bền pH, ảnh hưởng kích hoạt/ức chế của các ion kim loại và EDTA, cùng các thông số động học enzyme ($K_m, V_{max}$).

3.3. Thử nghiệm rAspPecA trong chế biến nước trái cây và khả năng bóc vỏ tiêu

• Làm trong nước ép táo: Chế phẩm rAspPecA thể hiện hoạt tính làm giảm độ đục rõ rệt; tại nồng độ enzyme 2.400 U/L, độ đục của nước ép táo giảm 29%.
• Hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen:
  • Thử nghiệm trên 3 nguồn tiêu: Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Kon Tum.
  • Tại nồng độ enzyme 1.800 U/L, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt trên 90% sau 96 giờ xử lý so với mẫu đối chứng không bổ sung enzyme.
• Hàm lượng piperine sau xử lý: Hàm lượng piperine bảo tồn trong ba mẫu tiêu sau khi bóc vỏ lần lượt là: 10,30% (tiêu Quảng Trị), 8% (tiêu Thừa Thiên Huế) và 8% (tiêu Kon Tum). Kết quả chỉ ra rằng thời gian ủ hạt tiêu với enzyme càng kéo dài thì hàm lượng piperine ghi nhận được có xu hướng càng giảm.

Kết luận và kiến nghị

Phần này đúc kết toàn bộ các chỉ số kỹ thuật đạt được của đề tài qua 4 kết luận chính và đưa ra 2 định hướng nghiên cứu tiếp theo ở quy mô công nghiệp.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

Luận án đã công bố 3 điểm mới về mặt khoa học và thực tiễn:

1. Tạo dòng và giải trình tự gen: Đã tạo dòng thành công và xác định chính xác trình tự của 3 gen AspPecA, AspPecB và AspPecC mã hóa pectinase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger M13 bản địa; các trình tự đã được đăng ký và chấp thuận trên cơ sở dữ liệu GenBank với mã số tương ứng: MT502411, MT502412 và MT502413.
2. Biểu hiện dị chủng thành công: Lần đầu tiên tại Việt Nam biểu hiện thành công gen mã hóa pectinase (cAspPecA) trong hệ thống tế bào chủ nấm men Pichia pastoris X33; enzyme tái tổ hợp rAspPecA được tinh sạch và xác định khối lượng phân tử khoảng 42 kDa cùng các đặc tính hóa lý quan trọng.
3. Hiệu quả ứng dụng thực nghiệm: Chứng minh chế phẩm rAspPecA có khả năng làm giảm độ đục nước ép táo 29% ở nồng độ 2.400 U/L và nâng cao hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen đạt trên 90% ở nồng độ 1.800 U/L sau 96 giờ xử lý trên các nguồn nguyên liệu thực tế.

Kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục nghiên cứu sản xuất và thu nhận rAspPecA ở quy mô công nghiệp nhằm nâng cao hiệu quả biểu hiện gen cAspPecA trong P. pastoris X33, hướng tới tạo nguồn enzyme sạch phục vụ các ứng dụng thực tiễn.
• Nghiên cứu các điều kiện tối ưu hóa bổ sung đối với enzyme rAspPecA để gia tăng hơn nữa hiệu suất thu hồi và khả năng làm trong các loại dịch quả khác nhau.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

Từ phạm vi nghiên cứu và các dữ liệu được công bố trong văn bản, luận án tồn tại một số giới hạn thực nghiệm:

• Trong số 3 gen pectinase được tách dòng và đăng ký GenBank (AspPecA, AspPecB, AspPecC), nghiên cứu mới chỉ tập trung biểu hiện và khảo sát tính chất sâu đối với gen AspPecA (dưới dạng gen tổng hợp cAspPecA), chưa thực hiện biểu hiện đồng thời hoặc so sánh đặc tính chức năng của hai gen còn lại (AspPecB, AspPecC).
• Toàn bộ các thử nghiệm biểu hiện nấm men, lên men cảm ứng bằng methanol và tinh sạch enzyme mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác/lắc), chưa được thử nghiệm vận hành trong các hệ thống bioreactor quy mô lớn.
• Thử nghiệm ứng dụng của rAspPecA mới chỉ giới hạn trên hai đối tượng là dịch nước ép táo và bóc vỏ hạt tiêu đen của 3 địa phương, chưa mở rộng trên đa dạng các loại quả có múi hoặc các nông sản giàu pectin khác.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy trình nuôi cấy nấm men tái tổ hợp lên quy mô pilot và công nghiệp nhằm kiểm soát chính xác các thông số cấp khí, nồng độ methanol duy trì và tốc độ sinh khối.
• Tiếp tục tạo dòng và biểu hiện hai gen AspPecB và AspPecC trong P. pastoris để đánh giá sự phối hợp hiệp đồng giữa các phân lớp pectinase khác nhau trong việc thủy phân các cơ chất pectin phức tạp.
• Khảo sát mở rộng khả năng ứng dụng của chế phẩm rAspPecA trong các lĩnh vực chế biến cà phê, xử lý sợi thực vật và sản xuất nước quả nhiệt đới.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị trong các lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, công nghệ enzyme và chế biến thực phẩm:

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh học: Cung cấp quy trình chi tiết từ khâu phân lập nấm hoang dại, tách chiết DNA bằng CTAB, kỹ thuật tạo dòng trên vector pGEM®-T Easy, biến nạp và sàng lọc thể tái tổ hợp trên P. pastoris X33 với vector pPICZαA, đến phương pháp điện di zymogram kiểm tra hoạt tính phân giải pectin.
• Đối với cán bộ nghiên cứu công nghệ enzyme và chế biến thực phẩm: Cung cấp thông số thực nghiệm định lượng về nồng độ sử dụng của rAspPecA (2.400 U/L làm trong nước táo; 1.800 U/L bóc vỏ hạt tiêu sau 96 giờ) và sự biến thiên hàm lượng piperine trong tiêu bóc vỏ (từ 8% đến 10,30%), làm cơ sở để phát triển các quy trình chế biến tiêu trắng (tiêu sọ) bằng phương pháp sinh học thay thế cho ngâm ủ truyền thống.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã lựa chọn chủng nấm mốc nào để tạo dòng và vì sao không chọn chủng có hoạt độ cao nhất?

Trong số các chủng nấm mốc phân lập, chủng M1 (A. oryzae) đạt hoạt độ cao nhất ($112,1 \pm 0,05$ U/mL) và M45 đạt $110,2$ U/mL. Tuy nhiên, luận án lựa chọn chủng M13 (Aspergillus niger, hoạt độ $9,9$ U/mL) phân lập từ vỏ bưởi da xanh để thực hiện tạo dòng gen. Lý do là Aspergillus niger là loài vi sinh vật an toàn được FDA công nhận chuẩn GRAS, không sinh độc tố nấm hoặc kháng sinh trong điều kiện sản xuất enzyme, là đối tượng an toàn và phù hợp cho các nghiên cứu tạo dòng biểu hiện enzyme ứng dụng trong thực phẩm.

2. Kích thước phân tử và số lượng amino acid của các gen pectinase được phát hiện là bao nhiêu?

Theo kết quả giải trình tự và phân tích tin sinh học của luận án:

• Gen AspPecA: kích thước 1.237 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 362 amino acid, peptide tín hiệu dài 18 amino acid (GenBank: MT502411).
• Gen AspPecB: kích thước 1.728 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 495 amino acid, peptide tín hiệu dài 16 amino acid (GenBank: MT502412).
• Gen AspPecC: kích thước 1.338 bp, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 384 amino acid, peptide tín hiệu dài 19 amino acid (GenBank: MT502413).

3. Khối lượng phân tử của pectinase tái tổ hợp rAspPecA là bao nhiêu và được xác định bằng phương pháp nào?

Khối lượng phân tử của rAspPecA được xác định vào khoảng 42 kDa. Kết quả này được xác định thông qua phương pháp điện di SDS-PAGE thu hồi từng phân đoạn và đối chiếu với thang chuẩn protein PageRuler™ Prestained Protein, kết hợp điện di zymogram nhuộm Lugol 0,05% và Coomassie Brilliant Blue.

4. Hiệu quả ứng dụng cụ thể của rAspPecA trong làm trong nước ép táo và bóc vỏ tiêu ra sao?

• Trong xử lý nước ép táo: rAspPecA ở nồng độ 2.400 U/L giúp làm giảm 29% độ đục của dịch quả.
• Trong xử lý hạt tiêu: rAspPecA ở nồng độ 1.800 U/L cho hiệu suất bóc vỏ đạt trên 90% sau 96 giờ xử lý trên cả ba mẫu tiêu Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Kon Tum.

5. Sự thay đổi hàm lượng piperine trong hạt tiêu sau khi bóc vỏ bằng enzyme diễn ra như thế nào?

Sau khi bóc vỏ bằng rAspPecA, hàm lượng piperine ghi nhận ở 3 mẫu tiêu lần lượt là: tiêu Quảng Trị đạt 10,30%; tiêu Thừa Thiên Huế đạt 8% và tiêu Kon Tum đạt 8%. Kết quả thực nghiệm của luận án khẳng định thời gian ủ hạt tiêu với enzyme càng kéo dài thì hàm lượng piperine tồn dư trong hạt tiêu sẽ càng suy giảm.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Phan Thị Thanh Diễm đã tuyển chọn thành công chủng nấm mốc Aspergillus niger M13 từ vỏ bưởi da xanh tại Thừa Thiên Huế và giải trình tự 3 gen mã hóa pectinase (AspPecA, AspPecB, AspPecC) đăng ký thành công trên GenBank. Công trình đã thực hiện biểu hiện ngoại bào gen cAspPecA trong hệ thống nấm men Pichia pastoris X33, thu nhận enzyme tái tổ hợp rAspPecA có khối lượng phân tử khoảng 42 kDa. Ở điều kiện thực nghiệm, enzyme rAspPecA thể hiện hiệu quả giảm 29% độ đục nước ép táo ở liều lượng 2.400 U/L và đạt hiệu suất bóc vỏ tiêu trên 90% ở liều lượng 1.800 U/L sau 96 giờ, cung cấp các dẫn liệu khoa học giá trị cho việc ứng dụng công nghệ enzyme tái tổ hợp trong chế biến nông sản tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 35 trang; Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 19 trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 63 trang; Kết luận và Kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình liên quan đến luận án đã công bố 1 trang; Tài liệu tham khảo 22 trang. Luận án có 9 bảng và 52 hình. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như: quả, củ, thân.

Trong màng tế bào pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và ở vách tế bào sơ cấp. Pectin là một polysaccharide cấu trúc được tìm thấy trong thành tế bào sơ cấp và phiến giữa của trái cây và rau quả. Cấu trúc chủ yếu của pectin là homopolymer, được tạo thành từ poly-α-(1,4)-galacturonic acid được methyl hóa một phần. SƠ LƯỢC VỀ PECTINASE Pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin.

Dưới tác dụng của pectinase, pectin bị thủy phân tạo thành các sản phẩm như galacturonic acid, galactose, arabinose, methanol… Pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong dịch quả. NẤM MỐC Aspergillus SINH TỔNG HỢP PECTINASE Chi Aspergillus phân biệt với các chi khác trong lớp nấm bất toàn nhờ chúng có hệ bào tử đính phát sinh từ thể bình. Cơ quan sinh bào tử trần phát triển từ một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần (condiosphore hay stipe).

Bọng đỉnh giá có thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng để phân loại Aspergillus với các loại nấm khác 1. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN P. pastoris Theo Kielkopf và cs (2021) các P. pastoris được báo cáo là một trong những hệ thống hữu ích và linh hoạt nhất cho biểu hiện 4 protein dị chủng, do đó chúng đã trở thành một trong những nấm men nghiên cứu rộng rãi nhất.

pastoris là hệ thống biểu hiện được sử dụng phổ biến để sản xuất các loại protein tái tổ hợp với nhiều ưu điểm hơn so với Saccharomyces cervisiae. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE Trên thế giới nhiều báo cáo cho thấy việc tạo dòng có hiệu quả bằng cách sử dụng nấm mốc thuộc chi Aspergillus và đã biểu hiện thành công gen pectinase như: Liu và cs (2014) đã tạo dòng gen endo-galacturonase A (pgaA) từ chủng A. niger JL-15 và biểu hiện ở P. Xu và cs đã khuếch đại gen mã hóa gen pectin lyase PNL-ZJ5A từ A.

Năm 2017, Abdulrachman và cs đã biểu hiện thành công gen endo- polygalacturonase (endoPG) từ A. Năm 2018, Zhang và cs đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen pectin methylesterase (PME-ZJ5A), từ A. niger ZJ5 trong P. Năm 2021, Famotemi và cs đã tinh sạch và xác định đặc tính của pectinase từ chủng A.

niger F7-02 Các nghiên cứu về biểu hiện của gen pectin lyase ở P. pastoris đã được công bố như: Liu và cs (2022), Zhang và cs (2018) đã tạo dòng gen pectin lyase, pectin methylesterase từ A. niger ZJ5 và biểu hiện thành công ở P. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện vẫn chưa có công bố nào về nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectinase.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh pectinase được phân lập từ một số mẫu vỏ, quả trái cây giàu pectin 5 như cam, chanh, bưởi, quýt, chuối, xoài, táo, khoai tây, cà rốt, thanh long… Mẫu được thu ở các chợ thuộc thành phố Huế: Chợ Bến Ngự, chợ An Cựu, chợ Cống, chợ Phước Vĩnh. Phương pháp nghiên cứu 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase 2. Xác định hàm lượng protein 2.

Xác định một số đặc điểm hình thái và định danh loài 2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp pectinase 2. Tạo dòng gen mã hóa pectinase 2. Biểu hiện gen AspPecA trong P.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện pectinase tái tổ hợp 2. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp 2. Xác định trọng lượng phân tử của pectinase 2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ pectinase tái tổ hợp 2.

Thử nghiệm ứng dụng pectinase tái tổ hợp 2. Xử lý số liệu 6 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP PECTINASE 3.

Phân lập và xác định số lượng tế bào nấm mốc có khả năng phân giải pectin Bảng 3. Số lượng nấm mốc phân giải pectin trong các mẫu phân lập Ký CFU/g Loại mẫu Số chủng pH Đợt phân lập hiệu mẫu (vỏ) nấm mốc mẫu mẫu (×103 ) Đợt 1 Bưởi da xanh MA1 M1-M5 6,7 18,1g (1/6/2017) Cam sành MA2 M6-M7 4,5 6,3l Bưởi da xanh MA3 M8-M13 6,4 20,2f Đợt 2 Quýt đường MA4 M14-M17 4,8 14,6i (12/6/2017) Chuối ba lùn MA5 M18-M20 5,8 7,1k Đợt 3 Bưởi đỏ MA6 M21-M23 6,1 10,2j (14/6/2017) Cam sành MA7 M24-M25 5,1 6,6kl Đợt 4 Bưởi da xanh MA8 M26-M32 6,9 16,2h (28/6/2017) Bưởi năm roi MA9 M33-M39 5,1 17,4gh Đợt 5 Cam dòng MA10 M40-M45 4,5 22,2e (4/7/2017) Chuối tiêu MA11 M46-M49 5,9 20,1f Chanh MA12 M50-M53 4,1 16,6h Đợt 6 Táo MA13 M54-M59 5,2 14,1i (8/7/2017) Xoài MA14 M60-M61 4,7 10,3j Thanh long MA15 M62-M65 5,1 18,1g Đợt 7 Khoai tây MA16 M66-M74 5,8 26,1c (11/7/2017) Cà rốt MA17 M75-M81 6,5 24,3d Bưởi Thanh MA18 M82-M92 6,1 30,3b trà Huế Đợt 8 Bưởi đỏ Huế MA19 M93-M107 6,21 35,1a (2/8/2017) M108- Bưởi đỏ MA20 6,02 26,1c M113 7 3. Sơ tuyển chủng nấm mốc phân giải pectin và xác định hoạt độ enzyme 3. Sơ tuyển trực tiếp Bảng 3.

Khả năng phân giải pectin của các chủng nấm mốc trên môi trường thạch Czapek-pectin ĐKVPGP Khả năng phân giải pectin Số chủng Tỷ lệ (%) (mm) Yếu ≤5 62 54,9 Trung bình > 5 và ≤ 10 27 23,9 Mạnh > 10 và ≤ 15 14 12,3 Rất mạnh > 15 10 8,9 3. Sơ tuyển gián tiếp và xác định hoạt độ pectinase Bảng 3. Sinh khối, đường kính vòng phân giải pectin và hoạt độ pectinase của các chủng nấm mốc Hoạt độ Chủng Sinh khối khô Đường kính vòng phân pectinase nấm mốc (mg/mL) giải pectin (mm) (U/mL) M1 8,6a 32,7a 112,1a M4 5,6b 28,7b 24,8d M8 4,4 d 19,0 i 34,3c M10 5,4 b 27,8 e 10,9e M13 4,2 e 28,5 c 9,9g M45 6,0 a 29,3 a 110,2a M46 4,8 c 28,3 d 7,4i M68 5,6b 24,3 g 98,5b M95 4,8 c 21,2 h 8,4h M108 4,0 f 24,3 g 10,4f M111 3,4 g 26,2 f 10,9e Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p <0,05 (Duncan’s test). Một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm mốc Hình thái khuẩn lạc Hình ảnh hiển vi M1 M13 M45 M68 Hình 3.

Đặc điểm hình thái và hiển vi của các chủng nấm mốc (bar=1cm) 9 3. Định danh các chủng nấm mốc Chủng M1 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus oryzae. Chủng M13 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus niger. Chủng M45 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus oryzae.

Chủng M68 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus flavus. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm mốc 3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Chủng A. oryzae M1 cho hoạt tính pectinase và tích luy sinh khối cực đại tại thời điểm 72 giờ nuôi cấy.

niger M13 tích luy sinh khối cực đại tại thời điểm 48 giờ nuôi. oryzae M45 có hoạt tính và hoạt độ pectinase đạt cực đại tại 120 giờ nuôi cấy 3. Ảnh hưởng của pH môi trường Chủng A. oryzae M45 đều có giá trị pH môi trường tối ưu là 6,5.

Ảnh hưởng của nguồn carbon Hình 3. Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả năng tích luy sinh khối của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn 10 Hình 3. Đường kính vòng phân giải pectin của chủng nấm mốc Aspergillus ở các nguồn carbon khác nhau 3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen Hình 3.

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng tích luy sinh khối của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn 11 Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính pectinase của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn 3. TẠO DÒNG GEN PECTINASE VÀO HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN P. Tách chiết DNA tổng số 10 kb Hình 3.

DNA tổng số của chủng A. M: GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1, 2: DNA tổng số tách chiết bằng đệm CTAB 12 3. Phân lập gen Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR các gen pectinase trên gel agarose 0,8%.

M: GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1, 2, 3: Sản phẩm PCR gen AspPecA, AspPecC, AspPecB 3. Tạo dòng gen mã hóa pectinase trong vector pGEM®T- Easy Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc chứa pGEM®-T Easy-pectinase. M: GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm PCR khuếch đại từ khuẩn lạc mang pGEM®-T Easy-AspPecA; 3, 4: Sản phẩm PCR khuếch đại từ khuẩn lạc mang pGEM®-T Easy-AspPecC; 5, 6: Sản phẩm PCR khuếch đại từ khuẩn lạc mang pGEM®-T Easy-AspPecB 13 Hình 3.

Điện di đồ sản phẩm phản ứng cắt bằng EcoRI. M: PreciGene 1 kb DNA Ladder (BioPioneer). 1: Plasmid pGEM®-T Easy-AspPecA; 2: Sản phẩm phản ứng cắt EcoRI đối với pGEM®-T Easy-AspPecA; 3: Plasmid pGEM®-T Easy-AspPecC; 4: Sản phẩm phản ứng cắt EcoRI đối với pGEM®-T Easy-AspPecC; 5: plasmid pGEM®-T Easy-AspPecB; 6: Sản phẩm phản ứng cắt EcoRI đối với pGEM®-T Easy-AspPecB 3. Giải trình tự gen mã hóa pectinase Kết quả giải trình tự cho thấy gen AspPecA, AspPecB và AspPecC có kích thước lần lượt là 1.338 bp và được đăng ký trên GenBank với các mã số tương ứng MT502411, MT502412 và MT502413.

AspPecA mã hóa cho một chuỗi polypeptide với chiều dài 362 amino acid, AspPecB và AspPecC mã hóa chuỗi polypeptide với chiều dài lần lượt 495 và 384 amino acid. Phân tích bằng phần mềm dự đoán trình tự tín hiệu peptide SignalP- 4.0 cho thấy AspPecA, AspPecB và AspPecC chứa trình tự mã hóa tín hiệu peptide với chiều dài lần lượt là 18, 16 và 19 amino acid. Dự đoán cấu trúc không gian của pectinase A B C Hình 3. Dự đoán cấu trúc không gian của A; B: Cấu trúc không gian của pecB và C: Cấu trúc không gian của pecC 3.

Tạo dòng gen AspPecA vào vector biểu hiện pPICZαA Hình 3. Sản phẩm phản Hình 3. Khuếch đại Hình 3. Plasmid ứng cắt bằng EcoRI và PCR gen cAspPecA từ tái tổ hợp XbaI.

M: GeneRuler 1 kb khuẩn lạc tái tổ hợp. Plus DNA Ladder (Thermo GeneRuler 1 kb Plus DNA M: GeneRuler 1 kb Scientific), 1: Sản phẩm Ladder (Thermo Plus DNA Ladder phản ứng cắt pGEM®T- Scientific).