NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN PECTINASE TỪ NẤM MỐC TRONG Pichia pastoris

Nghiên cứu pectinase từ nấm mốc Aspergillus, biểu hiện trong Pichia pastoris. Ứng dụng tiềm năng trong chế biến thực phẩm, tăng hiệu suất và chất lượng.

• Tác giả: Phan Thị Thanh Diễm
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Quốc Dung
• Trường học: Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sàng Lọc Và Biểu Hiện Pectinase Từ Nấm Mốc Trong Pichia pastoris
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Huế

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 0.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 0.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 0.2.1. Mục tiêu chung
• 0.2.2. Mục tiêu cụ thể
• 0.3. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 0.3.1. Nội dung nghiên cứu
• 0.3.2. Phạm vi nghiên cứu
• 0.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• 0.5. CẤU TRÚC LUẬN ÁN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN
• 1.2. SƠ LƯỢC VỀ PECTINASE
• 1.3. NẤM MỐC Aspergillus SINH TỔNG HỢP PECTINASE
• 1.4. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN P. pastoris
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase
• 2.2.2. Xác định hàm lượng protein
• 2.2.3. Xác định một số đặc điểm hình thái và định danh loài
• 2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp pectinase
• 2.2.5. Tạo dòng gen mã hóa pectinase
• 2.2.6. Biểu hiện gen AspPecA trong P.
• 2.2.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện pectinase tái tổ hợp
• 2.2.8. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp
• 2.2.9. Xác định trọng lượng phân tử của pectinase
• 2.2.10. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ pectinase tái tổ hợp
• 2.2.11. Thử nghiệm ứng dụng pectinase tái tổ hợp
• 2.2.12. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP PECTINASE
• 3.1.1. Phân lập và xác định số lượng tế bào nấm mốc có khả năng phân giải pectin
• 3.1.2. Sơ tuyển chủng nấm mốc phân giải pectin và xác định hoạt độ enzyme
• 3.1.3. Định danh các chủng nấm mốc
• 3.1.4. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm mốc
• 3.2. TẠO DÒNG GEN PECTINASE VÀO HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN P.
• 3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
• 3.2.2. Phân lập gen
• 3.2.3. Tạo dòng gen mã hóa pectinase trong vector pGEM®T-Easy
• 3.2.4. Giải trình tự gen mã hóa pectinase
• 3.2.5. Tạo dòng gen AspPecA vào vector biểu hiện pPICZαA
• 3.3. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN GEN
• 3.3.1. Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện rAspPecA
• 3.3.1.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào
• 3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
• 3.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
• 3.3.1.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
• 3.3.2. Khối lượng phân tử pectinase tái tổ hợp
• 3.3.3. Đánh giá tính chất lý hóa của rAspPecA
• 3.3.3.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ của rAspPecA
• 3.3.3.2. pH tối ưu và độ bền pH của rAspPecA
• 3.3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến độ bền của rAspPecA
• 3.3.3.4. Động học rAspPecA
• 3.4. THỬ NGHIỆM rAspPecA TRONG CHẾ BIẾN NƯỚC TRÁI CÂY VÀ KHẢ NĂNG BÓC VỎ TIÊU
• 3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ rAspPecA đến quá trình làm trong nước ép táo
• 3.4.2. Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của rAspPecA
• 3.4.2.1. Hiệu suất bóc vỏ tiêu
• 3.4.2.2. Hàm lượng piperine
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Pectinase từ Nấm Mốc Tổng Quan Tiềm Năng Ứng Dụng

Pectinase là một nhóm enzyme quan trọng có khả năng phân giải pectin, một polysaccharide phức tạp cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Enzyme này có vai trò quan trọng trong nhiều ứng dụng công nghiệp, đặc biệt là trong chế biến thực phẩm, nơi nó được sử dụng để tăng hiệu suất chiết xuất, làm trong nước ép trái cây và cải thiện kết cấu sản phẩm. Nghiên cứu về pectinase từ nấm mốc đang thu hút sự quan tâm lớn, do khả năng sản xuất enzyme với chi phí thấp và hiệu quả cao. Các chủng nấm mốc, đặc biệt là từ chi Aspergillus, được biết đến với khả năng sinh tổng hợp pectinase mạnh mẽ, mở ra tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Việc nghiên cứu sàng lọc và cải thiện các chủng nấm mốc sản xuất pectinase là rất cần thiết để tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme.

1.1. Cấu trúc và Phân loại Enzyme Pectinase Khái niệm cơ bản

Pectinase là thuật ngữ chung cho một họ enzyme thủy phân pectin, bao gồm nhiều loại enzyme khác nhau, mỗi loại có cơ chế hoạt động riêng. Các enzyme này có thể được phân loại dựa trên cơ chế xúc tác (ví dụ: esterase, lyase) hoặc vị trí tấn công trên phân tử pectin (ví dụ: endo- hoặc exo-). Hiểu rõ cấu trúc và phân loại enzyme pectinase là rất quan trọng để lựa chọn và ứng dụng enzyme phù hợp cho từng mục đích cụ thể.

1.2. Ứng dụng Công nghiệp của Pectinase Thực phẩm và hơn thế nữa

Ứng dụng của pectinase rất đa dạng, trải dài từ ngành công nghiệp thực phẩm đến dệt may và sản xuất giấy. Trong công nghiệp thực phẩm, pectinase được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nước ép trái cây, rượu vang và các sản phẩm chế biến từ trái cây và rau quả khác. Pectinase giúp cải thiện hiệu suất chiết xuất, làm trong sản phẩm và nâng cao chất lượng cảm quan. Ngoài ra, enzyme này còn được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi và xử lý chất thải nông nghiệp. Theo tài liệu gốc, trong lĩnh vực chế biến trái cây, pectinase được sử dụng nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng và có tác dụng làm trong dịch quả

II. Thách Thức Sản Xuất Pectinase Chi Phí và Năng Suất

Mặc dù pectinase có nhiều ứng dụng tiềm năng, nhưng chi phí sản xuất cao và năng suất thấp vẫn là những thách thức lớn đối với việc ứng dụng rộng rãi enzyme này. Các phương pháp sản xuất pectinase truyền thống thường dựa vào việc nuôi cấy các chủng nấm mốc tự nhiên, dẫn đến năng suất không ổn định và chi phí thu hồi enzyme cao. Do đó, việc phát triển các phương pháp sản xuất pectinase hiệu quả hơn, chẳng hạn như sử dụng kỹ thuật di truyền và biểu hiện protein tái tổ hợp, là rất quan trọng để giảm chi phí và tăng năng suất. Đồng thời, việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và quy trình thu hồi enzyme cũng đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sản xuất.

2.1. Giới hạn từ Aspergillus niger Độc tố và Hoạt tính Tự nhiên thấp

Aspergillus niger được FDA công nhận là GRAS (Generally Recognized As Safe), là một trong những chủng nấm mốc được sử dụng phổ biến nhất để sản xuất pectinase. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme tự nhiên của A. niger thường không đủ cao cho các ứng dụng công nghiệp và việc tinh sạch enzyme từ chủng này cũng gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, một số chủng A. niger có thể sản xuất độc tố nấm, gây lo ngại về an toàn thực phẩm. Vì vậy, việc sàng lọc các chủng A. niger không sinh độc tố và có hoạt tính pectinase cao là rất quan trọng.

2.2. Tạo dòng Biểu hiện gen Giải pháp cho sản xuất Pectinase

Để giải quyết các thách thức liên quan đến sản xuất pectinase, kỹ thuật di truyền và biểu hiện protein tái tổ hợp đã được sử dụng rộng rãi. Bằng cách tạo dòng và biểu hiện gen pectinase từ các chủng nấm mốc khác nhau trong các tế bào chủ khác nhau, người ta có thể sản xuất enzyme với năng suất cao, dễ tinh sạch và có các đặc tính mong muốn. Phương pháp này cho phép lựa chọn chủng loại pectinase và định hướng sinh tổng hợp pectinase ngoại bào, mở ra tiềm năng phát triển thành sản phẩm thương mại. Ở Việt Nam hiện vẫn chưa có công bố nào nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen pectinase

2.3. Chi phí sản xuất enzyme Làm sao để tối ưu và giảm chi phí

Chi phí sản xuất là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng cạnh tranh của enzyme pectinase. Để giảm chi phí sản xuất, cần tối ưu hóa tất cả các khâu trong quy trình, từ sàng lọc chủng nấm mốc đến thu hồi và tinh sạch enzyme. Sử dụng các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền, cải thiện hiệu quả sử dụng năng lượng và tái chế chất thải có thể giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất. Việc nghiên cứu các phương pháp biểu hiện enzyme hiệu quả hơn cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giảm chi phí sản xuất.

III. Pichia pastoris Nền tảng Biểu Hiện Pectinase Tái Tổ Hợp Tiềm Năng

Pichia pastoris là một loại nấm men được sử dụng rộng rãi làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp do có nhiều ưu điểm so với các hệ thống khác. P. pastoris có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng thao tác di truyền, có thể đạt được mật độ tế bào cao trong quá trình nuôi cấy, và có khả năng tiết protein ngoại bào, giúp đơn giản hóa quá trình thu hồi enzyme. Việc sử dụng P. pastoris để biểu hiện pectinase tái tổ hợp từ nấm mốc có thể giúp tăng năng suất, giảm chi phí và cải thiện chất lượng enzyme.

3.1. Ưu điểm của Pichia pastoris Năng suất cao dễ dàng di truyền

Pichia pastoris có nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện protein khác. P. pastoris có khả năng sinh trưởng nhanh và đạt được mật độ tế bào cao trong quá trình nuôi cấy, giúp tăng năng suất protein. P. pastoris cũng dễ dàng thao tác di truyền, cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra các chủng nấm men biểu hiện protein với năng suất cao và các đặc tính mong muốn. Hơn nữa, P. pastoris có khả năng tiết protein ngoại bào, giúp đơn giản hóa quá trình thu hồi và tinh sạch enzyme.

3.2. Tối ưu hóa Nuôi cấy Pichia pastoris Yếu tố then chốt để thành công

Để đạt được năng suất pectinase cao trong Pichia pastoris, cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen và nồng độ oxy hòa tan có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào và hiệu quả biểu hiện protein. Bằng cách điều chỉnh các yếu tố này, người ta có thể tạo ra các điều kiện tối ưu cho việc sản xuất pectinase trong P. pastoris.

3.3. Vector Biểu Hiện và Gen Mục Tiêu AspPecA AspPecB AspPecC

Việc lựa chọn vector biểu hiện và gen mục tiêu phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả biểu hiện pectinase trong P. pastoris. Các vector biểu hiện thường chứa các promoter mạnh, các tín hiệu khởi đầu dịch mã hiệu quả và các gen đánh dấu chọn lọc. Các gen pectinase từ nấm mốc, chẳng hạn như AspPecA, AspPecB và AspPecC từ Aspergillus niger, đã được biểu hiện thành công trong P. pastoris, cho thấy tiềm năng của hệ thống này trong sản xuất enzyme quy mô công nghiệp.

IV. Sàng Lọc Pectinase từ Nấm Mốc Phương Pháp Kết Quả Nghiên Cứu

Quá trình sàng lọc pectinase từ nấm mốc đòi hỏi một quy trình chặt chẽ để xác định các chủng có khả năng sản xuất enzyme với hoạt tính cao. Các phương pháp sàng lọc thường bao gồm việc phân lập nấm mốc từ các nguồn tự nhiên, kiểm tra khả năng phân giải pectin trên môi trường thạch và định lượng hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số chủng nấm mốc, đặc biệt là từ chi Aspergillus, có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính cao, mở ra tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau.

4.1. Phân lập Nấm Mốc Tìm kiếm chủng sản xuất Pectinase hiệu quả

Việc phân lập nấm mốc từ các nguồn tự nhiên là bước đầu tiên trong quá trình sàng lọc pectinase. Các mẫu được thu thập từ các nguồn giàu pectin, chẳng hạn như vỏ trái cây và rau quả, và được nuôi cấy trên môi trường thạch chọn lọc để phân lập các chủng nấm mốc có khả năng phân giải pectin. Các chủng nấm mốc phân lập được sau đó được kiểm tra khả năng sản xuất pectinase bằng các phương pháp sàng lọc khác nhau. Theo tài liệu gốc, các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh pectinase được phân lập từ một số mẫu vỏ, quả trái cây giàu pectin

4.2. Môi trường Thạch Pectin Đánh giá khả năng phân giải Pectin

Môi trường thạch chứa pectin được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng phân giải pectin của các chủng nấm mốc. Khi một chủng nấm mốc có khả năng sản xuất pectinase được nuôi cấy trên môi trường này, enzyme sẽ phân giải pectin xung quanh khuẩn lạc, tạo ra một vùng trong suốt. Đường kính của vùng trong suốt này tỉ lệ thuận với hoạt tính enzyme của chủng nấm mốc, cho phép các nhà nghiên cứu đánh giá khả năng sản xuất pectinase của các chủng khác nhau.

4.3. Định lượng Hoạt tính Enzyme Xác định chủng Pectinase tiềm năng

Để xác định các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất pectinase tiềm năng, cần định lượng hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy. Các phương pháp định lượng hoạt tính enzyme thường dựa trên việc đo lượng sản phẩm được tạo ra từ quá trình phân giải pectin bởi pectinase. Các chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cao được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và phát triển.

V. Ứng Dụng Pectinase Tái Tổ Hợp Chế Biến Thực Phẩm Bóc Vỏ Tiêu

Pectinase tái tổ hợp được sản xuất từ Pichia pastoris có nhiều ứng dụng tiềm năng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Trong ngành công nghiệp thực phẩm, pectinase được sử dụng để làm trong nước ép trái cây, cải thiện hiệu suất chiết xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm. Ngoài ra, pectinase còn được ứng dụng trong quá trình bóc vỏ tiêu, giúp giảm thời gian và chi phí sản xuất. Việc sử dụng pectinase tái tổ hợp có thể mang lại nhiều lợi ích so với việc sử dụng các chế phẩm pectinase truyền thống, bao gồm năng suất cao hơn, chất lượng ổn định hơn và chi phí thấp hơn.

5.1. Làm trong Nước Ép Táo Pectinase cải thiện độ trong như thế nào

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của pectinase trong ngành công nghiệp thực phẩm là làm trong nước ép trái cây. Pectin là một polysaccharide tự nhiên có trong trái cây, có thể gây ra hiện tượng đục trong nước ép. Bằng cách phân giải pectin, pectinase giúp cải thiện độ trong và làm tăng giá trị cảm quan của nước ép trái cây.

5.2. Bóc Vỏ Tiêu Hiệu quả và Hàm lượng Piperine sau xử lý

Pectinase cũng được sử dụng trong quá trình bóc vỏ tiêu, giúp loại bỏ lớp vỏ ngoài của hạt tiêu một cách dễ dàng. Việc sử dụng pectinase có thể giúp giảm thời gian và chi phí sản xuất, đồng thời cải thiện chất lượng sản phẩm. Điều quan trọng là phải kiểm soát quá trình bóc vỏ tiêu bằng pectinase để đảm bảo rằng hàm lượng piperine, một hợp chất quan trọng có trong hạt tiêu, không bị ảnh hưởng.rAspPecA có khả năng làm trong nước ép táo và làm tăng khả năng bóc vỏ tiêu

5.3. Ứng dụng khác Cải thiện quy trình trong công nghiệp thực phẩm

Ngoài làm trong nước ép táo và bóc vỏ tiêu, pectinase còn được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác trong ngành công nghiệp thực phẩm, bao gồm sản xuất rượu vang, mứt, và các sản phẩm chế biến từ trái cây và rau quả khác. Pectinase giúp cải thiện hiệu suất chiết xuất, làm tăng độ nhớt và nâng cao chất lượng cảm quan của sản phẩm. Việc nghiên cứu và phát triển các ứng dụng mới của pectinase trong ngành công nghiệp thực phẩm đang tiếp tục được tiến hành.

VI. Nghiên Cứu Pectinase Kết Luận và Hướng Phát Triển Tương Lai

Nghiên cứu về pectinase từ nấm mốc đã đạt được nhiều tiến bộ đáng kể trong những năm gần đây. Việc sàng lọc các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính cao, biểu hiện pectinase tái tổ hợp trong Pichia pastoris và phát triển các ứng dụng mới của enzyme trong ngành công nghiệp thực phẩm đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc ứng dụng pectinase trong quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần được giải quyết, bao gồm giảm chi phí sản xuất, cải thiện độ ổn định của enzyme và mở rộng phạm vi ứng dụng.

6.1. Nghiên cứu sâu về enzyme Pectinase Cấu trúc Chức năng Cơ chế

Để hiểu rõ hơn về pectinase và tối ưu hóa hiệu quả sử dụng enzyme, cần tiếp tục nghiên cứu sâu về cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của pectinase. Các nghiên cứu về cấu trúc protein có thể giúp xác định các vùng quan trọng cho hoạt tính enzyme và độ ổn định, từ đó giúp thiết kế các enzyme pectinase có các đặc tính mong muốn.

6.2. Tạo đột biến cải thiện enzyme Pectinase Bước tiến mới trong kỹ thuật

Kỹ thuật tạo đột biến có thể được sử dụng để cải thiện các đặc tính của pectinase, chẳng hạn như hoạt tính enzyme, độ ổn định và khả năng chịu nhiệt. Bằng cách tạo ra các đột biến ngẫu nhiên hoặc có định hướng trong gen pectinase, người ta có thể tạo ra các enzyme có các đặc tính vượt trội so với enzyme tự nhiên. rAspPecA với nồng độ 2.400 U/L đã làm giảm độ đục của nước ép táo 29%; đồng thời với nồng độ 1.800 U/L cho hiệu suất bóc vỏ tiêu cao hơn 90% sau 96 giờ so với đối chứng

6.3. Ứng dụng Pectinase trong công nghiệp Xu hướng phát triển

Việc mở rộng phạm vi ứng dụng của pectinase trong các ngành công nghiệp khác nhau là một xu hướng phát triển quan trọng. Ngoài ngành công nghiệp thực phẩm, pectinase còn có tiềm năng ứng dụng trong các ngành công nghiệp dệt may, giấy, và xử lý chất thải nông nghiệp. Nghiên cứu và phát triển các ứng dụng mới của pectinase có thể giúp tạo ra các sản phẩm và quy trình sản xuất thân thiện với môi trường và tiết kiệm chi phí.

Trích đoạn nội dung tài liệu

phần Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 35 trang; Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 19 trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 63 trang; Kết luận và Kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình liên quan đến luận án đã công bố 1 trang; Tài liệu tham khảo 22 trang. Luận án có 9 bảng và 52 hình. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PECTIN Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như: quả, củ, thân.

Trong màng tế bào pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và ở vách tế bào sơ cấp. Pectin là một polysaccharide cấu trúc được tìm thấy trong thành tế bào sơ cấp và phiến giữa của trái cây và rau quả. Cấu trúc chủ yếu của pectin là homopolymer, được tạo thành từ poly-α-(1,4)-galacturonic acid được methyl hóa một phần. SƠ LƯỢC VỀ PECTINASE Pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin.

Dưới tác dụng của pectinase, pectin bị thủy phân tạo thành các sản phẩm như galacturonic acid, galactose, arabinose, methanol… Pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong dịch quả. NẤM MỐC Aspergillus SINH TỔNG HỢP PECTINASE Chi Aspergillus phân biệt với các chi khác trong lớp nấm bất toàn nhờ chúng có hệ bào tử đính phát sinh từ thể bình. Cơ quan sinh bào tử trần phát triển từ một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần (condiosphore hay stipe).

Bọng đỉnh giá có thể có nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng để phân loại Aspergillus với các loại nấm khác 1. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN P. pastoris Theo Kielkopf và cs (2021) các P. pastoris được báo cáo là một trong những hệ thống hữu ích và linh hoạt nhất cho biểu hiện 4 protein dị chủng, do đó chúng đã trở thành một trong những nấm men nghiên cứu rộng rãi nhất.

pastoris là hệ thống biểu hiện được sử dụng phổ biến để sản xuất các loại protein tái tổ hợp với nhiều ưu điểm hơn so với Saccharomyces cervisiae. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE Trên thế giới nhiều báo cáo cho thấy việc tạo dòng có hiệu quả bằng cách sử dụng nấm mốc thuộc chi Aspergillus và đã biểu hiện thành công gen pectinase như: Liu và cs (2014) đã tạo dòng gen endo-galacturonase A (pgaA) từ chủng A. niger JL-15 và biểu hiện ở P. Xu và cs đã khuếch đại gen mã hóa gen pectin lyase PNL-ZJ5A từ A.

Năm 2017, Abdulrachman và cs đã biểu hiện thành công gen endo- polygalacturonase (endoPG) từ A. Năm 2018, Zhang và cs đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen pectin methylesterase (PME-ZJ5A), từ A. niger ZJ5 trong P. Năm 2021, Famotemi và cs đã tinh sạch và xác định đặc tính của pectinase từ chủng A.

niger F7-02 Các nghiên cứu về biểu hiện của gen pectin lyase ở P. pastoris đã được công bố như: Liu và cs (2022), Zhang và cs (2018) đã tạo dòng gen pectin lyase, pectin methylesterase từ A. niger ZJ5 và biểu hiện thành công ở P. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện vẫn chưa có công bố nào về nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen pectinase.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus có khả năng sinh pectinase được phân lập từ một số mẫu vỏ, quả trái cây giàu pectin 5 như cam, chanh, bưởi, quýt, chuối, xoài, táo, khoai tây, cà rốt, thanh long… Mẫu được thu ở các chợ thuộc thành phố Huế: Chợ Bến Ngự, chợ An Cựu, chợ Cống, chợ Phước Vĩnh. Phương pháp nghiên cứu 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase 2. Xác định hàm lượng protein 2.

Xác định một số đặc điểm hình thái và định danh loài 2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp pectinase 2. Tạo dòng gen mã hóa pectinase 2. Biểu hiện gen AspPecA trong P.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện pectinase tái tổ hợp 2. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp 2. Xác định trọng lượng phân tử của pectinase 2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ pectinase tái tổ hợp 2.

Thử nghiệm ứng dụng pectinase tái tổ hợp 2. Xử lý số liệu 6 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP PECTINASE 3.

Phân lập và xác định số lượng tế bào nấm mốc có khả năng phân giải pectin Bảng 3. Số lượng nấm mốc phân giải pectin trong các mẫu phân lập Ký CFU/g Loại mẫu Số chủng pH Đợt phân lập hiệu mẫu (vỏ) nấm mốc mẫu mẫu (×103 ) Đợt 1 Bưởi da xanh MA1 M1-M5 6,7 18,1g (1/6/2017) Cam sành MA2 M6-M7 4,5 6,3l Bưởi da xanh MA3 M8-M13 6,4 20,2f Đợt 2 Quýt đường MA4 M14-M17 4,8 14,6i (12/6/2017) Chuối ba lùn MA5 M18-M20 5,8 7,1k Đợt 3 Bưởi đỏ MA6 M21-M23 6,1 10,2j (14/6/2017) Cam sành MA7 M24-M25 5,1 6,6kl Đợt 4 Bưởi da xanh MA8 M26-M32 6,9 16,2h (28/6/2017) Bưởi năm roi MA9 M33-M39 5,1 17,4gh Đợt 5 Cam dòng MA10 M40-M45 4,5 22,2e (4/7/2017) Chuối tiêu MA11 M46-M49 5,9 20,1f Chanh MA12 M50-M53 4,1 16,6h Đợt 6 Táo MA13 M54-M59 5,2 14,1i (8/7/2017) Xoài MA14 M60-M61 4,7 10,3j Thanh long MA15 M62-M65 5,1 18,1g Đợt 7 Khoai tây MA16 M66-M74 5,8 26,1c (11/7/2017) Cà rốt MA17 M75-M81 6,5 24,3d Bưởi Thanh MA18 M82-M92 6,1 30,3b trà Huế Đợt 8 Bưởi đỏ Huế MA19 M93-M107 6,21 35,1a (2/8/2017) M108- Bưởi đỏ MA20 6,02 26,1c M113 7 3. Sơ tuyển chủng nấm mốc phân giải pectin và xác định hoạt độ enzyme 3. Sơ tuyển trực tiếp Bảng 3.

Khả năng phân giải pectin của các chủng nấm mốc trên môi trường thạch Czapek-pectin ĐKVPGP Khả năng phân giải pectin Số chủng Tỷ lệ (%) (mm) Yếu ≤5 62 54,9 Trung bình > 5 và ≤ 10 27 23,9 Mạnh > 10 và ≤ 15 14 12,3 Rất mạnh > 15 10 8,9 3. Sơ tuyển gián tiếp và xác định hoạt độ pectinase Bảng 3. Sinh khối, đường kính vòng phân giải pectin và hoạt độ pectinase của các chủng nấm mốc Hoạt độ Chủng Sinh khối khô Đường kính vòng phân pectinase nấm mốc (mg/mL) giải pectin (mm) (U/mL) M1 8,6a 32,7a 112,1a M4 5,6b 28,7b 24,8d M8 4,4 d 19,0 i 34,3c M10 5,4 b 27,8 e 10,9e M13 4,2 e 28,5 c 9,9g M45 6,0 a 29,3 a 110,2a M46 4,8 c 28,3 d 7,4i M68 5,6b 24,3 g 98,5b M95 4,8 c 21,2 h 8,4h M108 4,0 f 24,3 g 10,4f M111 3,4 g 26,2 f 10,9e Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ sự sai khác trung bình mẫu có ý nghĩa thống kê với p <0,05 (Duncan’s test). Một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm mốc Hình thái khuẩn lạc Hình ảnh hiển vi M1 M13 M45 M68 Hình 3.

Đặc điểm hình thái và hiển vi của các chủng nấm mốc (bar=1cm) 9 3. Định danh các chủng nấm mốc Chủng M1 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus oryzae. Chủng M13 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus niger. Chủng M45 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus oryzae.

Chủng M68 được xếp vào chi Aspergillus, loài Aspergillus flavus. Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm mốc 3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Chủng A. oryzae M1 cho hoạt tính pectinase và tích luy sinh khối cực đại tại thời điểm 72 giờ nuôi cấy.

niger M13 tích luy sinh khối cực đại tại thời điểm 48 giờ nuôi. oryzae M45 có hoạt tính và hoạt độ pectinase đạt cực đại tại 120 giờ nuôi cấy 3. Ảnh hưởng của pH môi trường Chủng A. oryzae M45 đều có giá trị pH môi trường tối ưu là 6,5.

Ảnh hưởng của nguồn carbon Hình 3. Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả năng tích luy sinh khối của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn 10 Hình 3. Đường kính vòng phân giải pectin của chủng nấm mốc Aspergillus ở các nguồn carbon khác nhau 3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen Hình 3.

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng tích luy sinh khối của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn 11 Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính pectinase của các chủng nấm mốc Aspergillus tuyển chọn 3. TẠO DÒNG GEN PECTINASE VÀO HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN P. Tách chiết DNA tổng số 10 kb Hình 3.

DNA tổng số của chủng A. M: GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1, 2: DNA tổng số tách chiết bằng đệm CTAB 12 3. Phân lập gen Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR các gen pectinase trên gel agarose 0,8%.

M: GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1, 2, 3: Sản phẩm PCR gen AspPecA, AspPecC, AspPecB 3. Tạo dòng gen mã hóa pectinase trong vector pGEM®T- Easy Hình 3. Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc chứa pGEM®-T Easy-pectinase. M: GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm PCR khuếch đại từ khuẩn lạc mang pGEM®-T Easy-AspPecA; 3, 4: Sản phẩm PCR khuếch đại từ khuẩn lạc mang pGEM®-T Easy-AspPecC; 5, 6: Sản phẩm PCR khuếch đại từ khuẩn lạc mang pGEM®-T Easy-AspPecB 13 Hình 3.

Điện di đồ sản phẩm phản ứng cắt bằng EcoRI. M: PreciGene 1 kb DNA Ladder (BioPioneer). 1: Plasmid pGEM®-T Easy-AspPecA; 2: Sản phẩm phản ứng cắt EcoRI đối với pGEM®-T Easy-AspPecA; 3: Plasmid pGEM®-T Easy-AspPecC; 4: Sản phẩm phản ứng cắt EcoRI đối với pGEM®-T Easy-AspPecC; 5: plasmid pGEM®-T Easy-AspPecB; 6: Sản phẩm phản ứng cắt EcoRI đối với pGEM®-T Easy-AspPecB 3. Giải trình tự gen mã hóa pectinase Kết quả giải trình tự cho thấy gen AspPecA, AspPecB và AspPecC có kích thước lần lượt là 1.338 bp và được đăng ký trên GenBank với các mã số tương ứng MT502411, MT502412 và MT502413.

AspPecA mã hóa cho một chuỗi polypeptide với chiều dài 362 amino acid, AspPecB và AspPecC mã hóa chuỗi polypeptide với chiều dài lần lượt 495 và 384 amino acid. Phân tích bằng phần mềm dự đoán trình tự tín hiệu peptide SignalP- 4.0 cho thấy AspPecA, AspPecB và AspPecC chứa trình tự mã hóa tín hiệu peptide với chiều dài lần lượt là 18, 16 và 19 amino acid. Dự đoán cấu trúc không gian của pectinase A B C Hình 3. Dự đoán cấu trúc không gian của A; B: Cấu trúc không gian của pecB và C: Cấu trúc không gian của pecC 3.

Tạo dòng gen AspPecA vào vector biểu hiện pPICZαA Hình 3. Sản phẩm phản Hình 3. Khuếch đại Hình 3. Plasmid ứng cắt bằng EcoRI và PCR gen cAspPecA từ tái tổ hợp XbaI.

M: GeneRuler 1 kb khuẩn lạc tái tổ hợp. Plus DNA Ladder (Thermo GeneRuler 1 kb Plus DNA M: GeneRuler 1 kb Scientific), 1: Sản phẩm Ladder (Thermo Plus DNA Ladder phản ứng cắt pGEM®T- Scientific).