MỞ ĐẦU Được coi là nền công nghiệp mang lại hàng tỷ đô la hàng năm, công nghệ sinh học vi tảo ngày càng mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới. Mặc dù vậy, việc sử dụng vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng của thực phẩm cho con người và thức ăn cho động vật vẫn là những lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có một lịch sử phát triển tương đối lâu dài. Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh thái biển và rừng ngập mặn. Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái nói trên.
Loại vi tảo này có khả năng tích lũy hàm lượng cao lipit (có thể lên tới 70% khối lượng khô) và các axít béo không bão hoà thuộc nhóm omega-3 (-3 PUFA) như axít eicosapentaenoic (EPA, C20: 5-3), axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6-3). Những tác động tích cực cũng như tầm quan trọng của các -3 PUFA này đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm…. Hiện nay, loại vi tảo này được coi là ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá. Việc nuôi cấy chúng có thể được thực hiện ở quy mô lớn bằng những hệ thống lên men thông thường với hiệu quả cao.
Nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ loại vi tảo này dành cho con người, và động vật đã có mặt trên thị trường quốc tế và dần trở nên quen thuộc với người tiêu dùng ở khắp nơi trên thế giới. Việt Nam đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng về thành phần loài/chủng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể dùng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo. Vi tảo biển quang tự dưỡng là một trong những đối tượng truyền thống đã được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm cho nhiều mục đích khác nhau trong đó có nuôi trồng thuỷ sản (Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros…). Tuy nhiên, những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng các chi vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là chi Schizochytrium vẫn còn là rất mới, hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con e 2 người.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Có được bộ sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium phân lập từ một số vùng biển, vùng rừng ngập mặn của Việt Nam và sàng lọc các chủng tiềm năng cho việc sản xuất -3 PUFA. Lựa chọn được một chủng tiềm năng để nuôi thu sinh khối tạo viên thực phẩm chức năng và thử nghiệm trên một số đối tượng thuỷ hải sản. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập các chủng Schizochytrium spp.
từ các mẫu lá cây thu thập ở ven bờ biển, vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam; Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tiềm năng đã phân lập; Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác nhau (5, 10 và 30 lít); Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật thực nghiệm; Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790). Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Việt Nam; Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của một số loài/chủng tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập; Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium 1.
Hệ thống phân loại Trong những nghiên cứu trước đây, chi Schizochytrium được xếp vào bộ Saprolegniales thuộc ngành Oomycota do có nhiều nét tương đồng với nấm động bào tử. Tuy nhiên, ngày nay với những bằng chứng về siêu cấu trúc và trình tự nucleotit của đoạn gen 18S rRNA thu được, các nhà khoa học đã xếp chúng vào một giới riêng - giới Chromista. Chi Schizochytrium được xếp vào ngành Labyrinthulomycota, lớp Labyrinthulea, bộ Labyrinthulida, họ Thraustochytriidae (Porter, 1990; Cavalier- Smith, 1998). Sơ đồ phân loại chi Schizochytrium được chỉ ra trên hình 1.
Ngành Labyrinthulomycota Lớp Labyrinthulea Bộ Họ Chi Labyrinthulida Labyrinthulidae Labyrinthula L Thraustochytrium Thraustochytriidae Schizochytrium Ukenia Labyrinthuloides … Hình 1. Vị trí phân loại chi Schizochytrium (Porter, 1990) Chi Schizochytrium được đặc trưng bởi tế bào hình cầu, mạng lưới ngoại chất rất phát triển, khuẩn lạc sinh dưỡng lớn, động bào tử có dạng ovan hoặc dạng trứng, sinh trưởng bằng hình thức tế bào sinh dưỡng phân đôi liên tiếp tạo thành 4, 8 hoặc một cụm tế bào (có thể lên tới 100 tế bào). Cũng như nhiều chi thuộc ngành Heterokontophyta, trong chu trình sống của tế bào có giai đoạn hình thành động bào e 4 tử có hai roi lệch.2 là hình mô tả chu trình sống của một số chi đại diện (Porter, 1990). Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota (Porter, 1990) Chú thích: chi Schizochytrium: tế bào non với mạng lưới ngoại chất (a) phân chia liên tiếp tạo thành 4 tế bào (b) và tạo thành một khối các tế bào (c); Mỗi tế bào phát triển thành túi động bào tử (d) và giải phóng động bào tử (e), động bào tử biệt hóa thành tế bào non.
Thành tế bào có chứa sulphate polysacharide với thành phần chủ yếu là galactose hoặc fructose và protein (Chamberlain, 1980). Hệ thống mạng lưới ngoại chất (EN) được sinh ra từ một hoặc nhiều điểm trên thành tế bào. EN hình thành nên một mạng lưới nhánh của màng sinh chất kéo dài, liên quan đến một bào quan gọi là bothrosome hoặc sagenogenetosome (sagenogen) ở phía bề mặt ngoài tế bào (Porter, 1990). EN góp phần làm tăng vùng bề mặt tế bào, có chứa enzyme thủy e 5 phân gắn trên bề mặt hoặc nằm chìm trong môi trường xung quanh đã giúp cho việc tiêu hóa dễ dàng các vật liệu hữu cơ.
EN cũng gắn tế bào với môi trường và tiến hành phân hủy các cơ chất hữu cơ. Tế bào hầu như không sản xuất EN khi phát triển trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng, đặc biệt là trong điều kiện nuôi lắc (Raghukumar, 2008). Hiện có 5 loài thuộc chi Schizochytrium đã được mô tả bao gồm S. aggretatum Goldstein & Belsky, S.
minutum Gaertner và S. limacinum Honda & Yokochi (Raghukumar, 1988; Honda và cs, 1998). Trong cả một thời gian dài sự phân loại của chi Schizochytrium nói riêng và lớp Labyrinthulea nói chung chỉ dựa vào duy nhất các đặc điểm hình thái và hình thức giải phóng động bào tử. Khóa phân loại chi tiết của các họ và chi thuộc lớp Labyrinthulea dựa trên các đặc điểm hình thái (hình dạng tế bào, mạng lưới ngoại chất, tế bào amip), sự hình thành động bào tử và tổng hợp sắc tố (chủ yếu là beta-caroten) đã được Yokoyama và cộng sự đưa ra năm 2007 (Yokohama và cs.
Ngày nay, các công cụ sinh học phân tử hiện đại đã hỗ trợ đắc lực trong việc phân loại chính xác hơn các loài thuộc các chi khác nhau. Mặc dù còn là lĩnh vực khá non trẻ, hệ gen của các sinh vật đơn bào ở biển giúp chúng ta hiểu biết nhiều hơn về sinh vật nhân chuẩn (Worden & Allen, 2010). Hệ gen này có thể là những công cụ vô giá cho việc khai thác mối quan hệ tiến hóa, chức năng gen, trao đổi chất và sự phát triển của các đặc điểm phức tạp giữa các nhóm vi sinh vật (McGrath & Katz, 2004) và sẽ tiếp tục làm sáng tỏ những điểm còn đang tranh cãi. Nhìn chung, các sinh vật biển đơn bào có độ đa dạng cao do chúng là kết quả của các hiện tượng nội cộng sinh khác nhau diễn ra từ xa xưa (Worden & Allen, 2010).
Yokoyama và cộng sự đã đề xuất bổ sung thêm 5 chi mới nâng tổng số lên 12 chi thuộc họ Thraustochytriidae (Yokoyama & Honda, 2007; Yokoyama và cs, 2007). Điều này dẫn đến sự sắp xếp lại một số loài trong đó có 4 loài thuộc chi Schizochytrium (bảng 1. Tuy nhiên, đây vẫn còn là vấn đề đang gây tranh cãi đối với các nhà khoa học. Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi Schizochytrium (Jones & Pang, 2012) Chi Tên mới Tên gốc Oblongichytrium minutum Schizochytrium minutum (A.
Oblongichytrium Oblongichytrium octosporum Schizochytrium octosporum (Raghuk. Honda và Schizochytrium limacinum Yokochi) R. Honda và Yokochi Aurantiochytrium Aurantiochytrium mangrovei Schizochytrium mangrovei (Raghuk. Kĩ thuật phân lập và định tên 1.
Kĩ thuật phân lập Phương pháp dùng mồi là phấn thông (pine pollen baiting) và trải trực tiếp trên đĩa (direct plating) là phương pháp hiệu quả, được sử dụng để phân lập các loài thuộc họ Thraustochytriidae nói chung và chi Schizochytrium nói riêng (Bremer, 2000; Burja và cs, 2006; Jakobsen và cs, 2007). Các hạt phấn thông được khử trùng được rải trên bề mặt mẫu nước biển có chứa kháng sinh, chất kháng nấm và được ủ 1–2 tuần. Khi quan sát thấy các tế bào phát triển trên bề mặt phấn thông, chúng sẽ được trải trên đĩa thạch để thu nhận các khuẩn lạc đặc trưng trước khi đưa vào môi trường lỏng nuôi cấy nhằm thu chủng sạch (Wilkens & Maas, 2012). Nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên quá trình phân lập thành công hay không vì khi tiến hành phân lập ở 18-30oC cũng là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của cả các vi sinh vật tạp nhiễm như nấm và vi khuẩn.
Các chất kháng sinh như penicillin và streptomycin (Burja và cs, 2006; Quilodran và cs, 2010), rifampicin và các thuốc kháng nấm như nystatin (Jakobsen và cs, 2007; Wilkens & Maas, 2012) và amphotericin B (Taoka và cs, 2010) đã được bổ sung vào môi trường thạch và lỏng để hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và các khuẩn lạc sợi nấm. Các kĩ thuật định tên * Kĩ thuật hóa sinh Kĩ thuật nhuộm huỳnh quang đã được phát triển nhằm xác định số lượng tế bào nhờ phản ứng giữa fluorochrome (acriflavine), thành tế bào và nhân. Khi đó, thành tế bào bắt màu đỏ, nhân bắt màu xanh.
