Tổng quan nghiên cứu

Cây bạch quả (Ginkgo biloba), còn gọi là ngân hạnh, là một dược liệu quý có nguồn gốc từ Trung Quốc, được trồng rộng rãi tại nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Lá bạch quả chứa các hợp chất flavonoid và terpenoid có tác dụng sinh học quan trọng, hỗ trợ cải thiện tuần hoàn máu, tăng cường chức năng não bộ và phòng ngừa các bệnh lý liên quan đến tuổi già như Alzheimer. Theo ước tính, cao lá bạch quả chứa khoảng 22–27% flavonol glycoside và 5–7% terpen, trong đó các flavonoid chính gồm quercetin, kaempferol và isorhamnetin. Tuy nhiên, hiện nay trên thị trường chưa có phương pháp chuẩn để đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa cao bạch quả, gây khó khăn trong kiểm soát chất lượng và đảm bảo hiệu quả điều trị.

Luận văn thạc sĩ này nhằm mục tiêu nghiên cứu phân lập các flavonoid chính trong cao lá bạch quả và xây dựng phương pháp đánh giá định tính, định lượng các flavonoid này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2014 tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Việc thiết lập sắc ký đồ vân tay và xác định cấu trúc các flavonoid sẽ góp phần nâng cao chất lượng kiểm tra các sản phẩm chứa cao bạch quả trên thị trường, đồng thời hỗ trợ phát triển các tiêu chuẩn dược liệu trong ngành công nghệ hóa học.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

  • Lý thuyết flavonoid và terpenoid trong dược liệu: Flavonoid là nhóm hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học mạnh, bao gồm các aglycone như quercetin, kaempferol và isorhamnetin. Terpenoid, đặc biệt là diterpen lacton như ginkgolid và bilobalid, là các thành phần đặc trưng của bạch quả với tác dụng bảo vệ thần kinh và tuần hoàn.
  • Mô hình sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp phân tích định tính và định lượng các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp dựa trên sự tương tác giữa mẫu và pha tĩnh, pha động. HPLC được sử dụng với đầu dò PDA và khối phổ IT-TOF để xác định cấu trúc và hàm lượng flavonoid.
  • Khái niệm sắc ký đồ vân tay (Fingerprint Chromatography): Thiết lập mẫu sắc ký đặc trưng của cao bạch quả để phân biệt với các dược liệu khác, giúp kiểm soát chất lượng và phát hiện hàng giả.
  • Phương pháp chiết phân tán đa pha rắn (MSPD): Kỹ thuật chiết xuất flavonoid hiệu quả, tiết kiệm dung môi và thời gian, giữ nguyên cấu trúc các hợp chất.
  • Các chỉ tiêu đánh giá phương pháp phân tích: Tính tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ đúng và tính chọn lọc theo quy định của Dược điển Việt Nam IV.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Nguyên liệu chính là lá bạch quả khô thu mua từ Viện Y học Cổ truyền, cùng các chế phẩm chứa cao bạch quả trên thị trường. Chuẩn flavonoid gồm quercetin, kaempferol và isorhamnetin được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh.
  • Phương pháp chiết xuất và phân lập: Lá bạch quả được xay nhuyễn, chiết xuất bằng ethanol theo phương pháp Soxhlet, cô đặc thu cao ethanol thô. Cao được xử lý loại tạp bằng n-hexan, thủy phân acid HCl 10% ở 95°C trong 1 giờ, chiết xuất flavonoid bằng ethyl acetate, thu cao flavonoid tinh khiết (cao FL1). Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi thích hợp.
  • Phương pháp phân tích: Xác định cấu trúc flavonoid bằng phổ hồng ngoại (IR), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), sắc ký lỏng khối phổ IT-TOF. Định tính và định lượng flavonoid bằng HPLC với cột C18, pha động gồm acid phosphoric 0,2% và methanol hoặc acetonitrile, bước sóng phát hiện 340–370 nm.
  • Khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ đúng và tính chọn lọc: Thực hiện trên các dung dịch chuẩn với nồng độ từ 0,007 đến 0,34 mg/mL, chạy lặp lại 6 lần, thêm chuẩn vào mẫu thử để đánh giá độ phục hồi.
  • Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trong 6 tháng, từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2014, bao gồm các bước chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập thành công hai flavonoid chính: Isorhamnetin và kaempferol được phân lập từ cao lá bạch quả với độ tinh khiết trên 95% xác định bằng HPLC và DSC. Hiệu suất chiết flavonoid tinh khiết đạt khoảng 15% so với cao ethanol thô, tương đương 7,8 g từ 52 g cao ethanol.
  2. Thiết lập sắc ký đồ vân tay đặc trưng: Phương pháp HPLC với cột C18, pha động acid phosphoric 0,2% – methanol – acetonitrile, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, bước sóng 340 nm đã thiết lập được sắc ký đồ vân tay đặc trưng cho cao bạch quả, giúp phân biệt với các dược liệu khác như hoa hòe.
  3. Phương pháp định lượng flavonoid có tính tuyến tính cao: Hệ số tương quan (r²) của quercetin, kaempferol và isorhamnetin lần lượt là 0,998, 0,997 và 0,995 trong khoảng nồng độ 0,007–0,34 mg/mL. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt đạt 0,007–0,02 mg/mL và 0,03–0,06 mg/mL.
  4. Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp đạt yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) dưới 3,5% cho các flavonoid, tỷ lệ phục hồi từ 98% đến 102%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác và độ tin cậy cao.
  5. Ứng dụng thành công trong đánh giá các chế phẩm trên thị trường: Hàm lượng quercetin, kaempferol và isorhamnetin trong các viên nén và cao bạch quả thương mại dao động từ 3,59 đến 125,21 µg/mg, phù hợp với tiêu chuẩn dược liệu.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập flavonoid phù hợp với các nghiên cứu trước đây, khẳng định isorhamnetin và kaempferol là các chất chỉ điểm quan trọng trong cao bạch quả. Sắc ký đồ vân tay được thiết lập giúp phân biệt chính xác cao bạch quả với các dược liệu tương tự, nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng. Phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký tối ưu cho phép định lượng chính xác các flavonoid với độ nhạy cao, đáp ứng các yêu cầu của Dược điển Việt Nam.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, phương pháp này có ưu điểm về tính đơn giản, độ chính xác và khả năng áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm dược liệu. Việc ứng dụng phương pháp vào đánh giá các sản phẩm thương mại giúp phát hiện sự biến động hàm lượng flavonoid, từ đó đề xuất cải tiến quy trình sản xuất và kiểm soát chất lượng. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký vân tay và bảng so sánh hàm lượng flavonoid trong các mẫu thử, minh họa rõ ràng sự khác biệt và tính ổn định của sản phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng làm tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng cao bạch quả: Các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm nên triển khai phương pháp này để đảm bảo hàm lượng flavonoid trong sản phẩm đạt chuẩn, nâng cao uy tín và hiệu quả điều trị. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng.
  2. Phát triển bộ chuẩn đối chiếu flavonoid chuẩn hóa: Cần sản xuất và phân phối các chuẩn flavonoid (quercetin, kaempferol, isorhamnetin) chất lượng cao để hỗ trợ công tác kiểm nghiệm. Chủ thể thực hiện: Viện Kiểm nghiệm thuốc và các đơn vị nghiên cứu dược liệu.
  3. Tăng cường đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ kiểm nghiệm: Đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật sắc ký lỏng và phân tích flavonoid nhằm nâng cao năng lực phân tích và đảm bảo tính chính xác của kết quả. Thời gian: 3-6 tháng.
  4. Xây dựng quy trình chuẩn trong sản xuất cao bạch quả: Các nhà sản xuất cần áp dụng quy trình chiết xuất và tinh chế flavonoid theo tiêu chuẩn đã nghiên cứu để ổn định chất lượng sản phẩm. Chủ thể: các công ty dược liệu và nhà máy sản xuất.
  5. Mở rộng nghiên cứu đánh giá các thành phần khác trong cao bạch quả: Nghiên cứu thêm các terpenoid và acid ginkgolic để hoàn thiện tiêu chuẩn hóa dược liệu, đảm bảo an toàn và hiệu quả. Thời gian: 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ hóa học, dược học: Luận văn cung cấp phương pháp phân lập và phân tích flavonoid chi tiết, giúp nâng cao kiến thức và kỹ năng nghiên cứu dược liệu.
  2. Cơ quan kiểm nghiệm thuốc và dược liệu: Tài liệu là cơ sở khoa học để xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng các sản phẩm chứa cao bạch quả, phục vụ công tác quản lý nhà nước.
  3. Doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh dược liệu, thực phẩm chức năng: Giúp cải tiến quy trình sản xuất, kiểm soát chất lượng sản phẩm, tăng cường uy tín trên thị trường.
  4. Bác sĩ và chuyên gia y học cổ truyền: Cung cấp thông tin về thành phần hoạt chất và hiệu quả sinh học của cao bạch quả, hỗ trợ tư vấn và lựa chọn sản phẩm phù hợp cho bệnh nhân.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp phân lập flavonoid trong cao bạch quả có ưu điểm gì?
    Phương pháp chiết xuất bằng ethanol kết hợp thủy phân acid và sắc ký cột silica gel giúp thu được flavonoid tinh khiết với độ tinh khiết trên 95%, hiệu suất chiết cao và giữ nguyên cấu trúc hoạt chất, phù hợp cho nghiên cứu và ứng dụng kiểm nghiệm.

  2. Sắc ký đồ vân tay có vai trò gì trong kiểm tra chất lượng dược liệu?
    Sắc ký đồ vân tay tạo ra mẫu đặc trưng của cao bạch quả, giúp phân biệt với các dược liệu giả mạo hoặc kém chất lượng, từ đó đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy trong kiểm nghiệm sản phẩm.

  3. Phương pháp HPLC được sử dụng như thế nào để định lượng flavonoid?
    HPLC với cột C18, pha động acid phosphoric 0,2% kết hợp methanol hoặc acetonitrile, bước sóng phát hiện 340–370 nm, cho phép xác định chính xác hàm lượng quercetin, kaempferol và isorhamnetin với độ nhạy cao và độ lặp lại tốt.

  4. Hàm lượng flavonoid trong các chế phẩm thương mại có sự khác biệt lớn không?
    Có sự biến động hàm lượng flavonoid trong các sản phẩm trên thị trường, dao động từ 3,59 đến 125,21 µg/mg, phản ánh sự khác biệt về nguồn nguyên liệu và quy trình sản xuất, do đó cần kiểm soát chất lượng chặt chẽ.

  5. Làm thế nào để nâng cao chất lượng các sản phẩm chứa cao bạch quả?
    Cần áp dụng phương pháp phân tích chuẩn, xây dựng quy trình sản xuất chuẩn hóa, đào tạo nhân lực kỹ thuật và phát triển bộ chuẩn đối chiếu flavonoid để đảm bảo hàm lượng hoạt chất ổn định và hiệu quả điều trị.

Kết luận

  • Phân lập thành công hai flavonoid chính isorhamnetin và kaempferol từ cao lá bạch quả với độ tinh khiết trên 95%.
  • Thiết lập sắc ký đồ vân tay đặc trưng giúp phân biệt cao bạch quả với các dược liệu khác.
  • Xây dựng phương pháp HPLC định lượng flavonoid có tính tuyến tính cao, độ nhạy và độ chính xác phù hợp với tiêu chuẩn dược điển.
  • Ứng dụng phương pháp vào đánh giá các chế phẩm thương mại cho thấy sự biến động hàm lượng flavonoid, cần kiểm soát chất lượng chặt chẽ.
  • Đề xuất áp dụng phương pháp làm tiêu chuẩn kiểm nghiệm, phát triển bộ chuẩn đối chiếu và nâng cao năng lực kiểm nghiệm trong ngành dược liệu.

Tiếp theo, cần triển khai áp dụng phương pháp trong các phòng kiểm nghiệm, đồng thời mở rộng nghiên cứu các thành phần hoạt chất khác trong cao bạch quả để hoàn thiện tiêu chuẩn hóa dược liệu. Quý độc giả và các đơn vị quan tâm được khuyến khích tham khảo và ứng dụng kết quả nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm và hiệu quả điều trị.