Đặt vấn đề Mía là tên gọi chung của một số loài thuộc chi mía (Saccharum), chúng là các loài sống lâu năm, thuộc tông Andropogoneae của họ hòa thảo (Poacea). Thân mía to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2- 6m. Hầu hết các vùng trồng mía hiện nay đều dùng để cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất đường. Năm 2007, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành Mía đường đến năm 2010, định hướng đến năm 2020 với các chỉ tiêu chủ yếu đến năm 2010 như diện tích mía 300.000 ha; năng suất mía bình quân 65 tấn/ha; sản lượng mía cả nước 19,5 triệu tấn; tổng sản lượng đường sản xuất 1,5 triệu tấn (trong đó sản lượng đường công nghiệp đạt 1,4 triệu tấn).
Định hướng đến năm 2020 tổng diện tích khoảng 300, 000 ha, năng suất bình quân đạt 80 tấn/ha, tổng sản lượng đạt 24 triệu tấn. Tuy nhiên tất cả các chỉ tiêu đặt ra cho ngành mía đường đều đã không đạt kế hoạch. Vụ mía đường 2012 - 2013 kết thúc với những thống kê, tổng sản lượng đường chỉ đạt 19, 4 triệu tấn. Công suất chế biến của các nhà máy chỉ đạt 72,5%- 74,4% so với thiết kế.
Các chỉ tiêu thực tế năm 2013đạt được là: Diện tích mía 298.200 ha; năng suất mía bình quân 63, 9 tấn/ha (vẫn chưa đạt được mức dự kiến đặt ra năm 2010). Để tăng năng suất mía khi mà diện tích reo trồng vẫn giữ nguyên đòi hỏi phải cải tiến về kĩ thuật canh tác cũng như cải tiến chất lượng giống. Việc nghiên cứu nhân nhanh các giống mía mới bằng phương pháp nuôi cấy mô phục vụ cho sản xuất mía đường ở Việt Nam cũng như trên thế giới là một trong những hướng đi nhằm tạo ra giống nhanh có chất lượng,cũng như là nguồn cung cấp cây giống đồng đều sạch bệnh cho các vùng sản xuất. Chính vì thế chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 nhập nội”.
Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được ảnh hưởng của chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159. - Xác định được ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau khi kết hợp với Kinetin 0.2mg/l lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159.- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá trình tái sinh chồi của giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159. - Xác định được ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159. - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159.
- Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng và phát triển của cây mía ngoài vườn ươm. Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân nhanh các giống mía mới bằng phuơng pháp in vitro. - Tạo tập đoàn giống mía in vitro ban đầu sẵn sàng cung ứng vật liệu giống mới cho nhân giống sản xuất tại các vùng nguyên liệu mía khác nhau trong nước. Ý nghĩa của đề tài 1.
Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học Nghiên cứu quy trình nhân nhanh thích hợp nhất với một số giống mía mới nhập nội từ đó hoàn thiện công nghệ nhân nhanh các giống mía duy trì và nhân nhanh các nguồn giống tốt phục vụ cho học tập và nghiên cứu khoa học. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các nghiên cứu tế bào học, di truyền học, chuyển gene… nhằm cải tiến giống địa phương đồng thời tạo các giống mới với năng suất và chất lượng cao. n 3 Nuôi cấy mô thực vật nói chung và cây mía nói riêng là phương tiện hữu hiệu nhất được dùng để kiểm tra kết quả sau chuyển gene ở thực vật, xác định biểu hiện gene chuyển một cách nhanh chóng. Kiểm tra các khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh (chống chua, mặn, khả năng chịu nóng, lạnh…) của thực vật nhanh chóng, chính xác, tiết kiệm tối thiểu thời gian và chi phí thấp hơn nhiều so với việc tiến hành ngoài đồng ruộng.
Đánh giá được sức sinh trưởng của mía nuôi cấy mô và mía hom ngoài sản xuất. Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất. - Tạo cơ cấu giống phù hợp cho từng vùng nguyên liệu với tốc độ nhanh: Hiện nay các nhà máy sản xuất được xây dựng ngày càng nhiều, dẫn tới nguồn nguyên liệu của từng vùng sản xuất phù hợp cần được tìm hiểu và nghiên cứu. Sau khi xác định được giống ưu việt nhân nhanh giống mới thay thế giống cũ phù hợp với từng vùng.
- Đảm bảo an toàn sinh học: Gây dựng bước đầu một vùng nguyên liệu mía mới bằng các giống cấy mô sạch bệnh. Nuôi cấy mô là biện pháp cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hóa học , giúp cho việc nhập nội giống an toàn sinh học - Nuôi cấy mô làm trẻ hóa, sạch bệnh, tăng năng suất mía một cách đáng kể: Kinh nghiệm của hầu hết các nước trồng mía đều cho thấy vai trò quan trọng của công nghệ cấy mô đối với nhân giống mía. n 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 2.
Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan niệm của khoa học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đều mang toàn bộ lượng thông tin đi truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Để thể hiện tính toàn năng tế bào phải trải qua 3 giai đoạn; + Giai đoạn 1: Là giai đoạn tế bào phản phân hóa với sự phát sinh của tế bào khả biến. + Giai đoạn 2: Tế bào trải qua sự định hướng phân hóa. + Giai đoạn 3: Sự phát sinh hình thái và phát triển cơ quan. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.
Môi trường nuôi cấy a. Môi trường vật lý - Ánh sáng: Theo tác giả Vũ Văn Vụ, sự phát sinh hình thái của mô cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố vật lý như thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với đa số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp là từ 12- 18h/ngày. Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo.
Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô là 1000-2500 lux [13]. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng n 5 xanh thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo [13].
- Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng nuôi cấy tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất sứ của từng loại mô nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Thường cây nhiệt đới đòi hỏi nhiệt độ cao hơn cây ôn đới. Môi trường hóa học: Môi trường hóa học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng phát sinh mô trong suốt quá trình sinh hóa của cây.
Cơ sở của việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây. Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm: - Các nguyên tố đa lượng và vi lượng: + Nguyên tố đa lượng: Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm. Những nguyên tố N, S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tượng (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [15]. Nitơ: Dùng ở dạng muối NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau.
Photpho: Là nguyên tố mà mô tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu cao và thường được đua vào môi trường dạng đường photpho. Lưu huỳnh: Được sử dụng ở dạng muối SO4-2- nồng độ thấp còn dạng SO32- và SO22- kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trường nuôi cấy. Na+ và Cl-: Cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng với muối khoáng khi diều chỉnh pH môi trường. `- Các nguyên tố vi lượng: Theo tác giả O.L Gamborg, các nguyên tố vi lượng là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (< 30mg/l).
các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Zn, Bo, Co, I2. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của n 6 enzyme. Chúng được sử dụng ở nồng độ thấp hơn so với các nguyên tố đa lượng [19]. Fe: Thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.
Mn: Thiếu Mn làm cho ADN và các axit amin tự do tăng lên nhưng lượng mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm làm giảm sự phân bào. Bo: Thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây nên biểu hiện thừa Auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào phát triển. Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhưng thường là mô xốp, mọng nước, kém tái sinh. - Nguồn Cacbon: Theo tác giả Đỗ Năng Vịnh, cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng (hoàn toàn sử dụng các chất dinh dưỡng của môi trường).
Để sử dụng dược thì nhờ nguồn cacbon từ môi trường đưa vào thông qua các loại dường khác nhau như: Saccarose, Mantose, Fructose…[15]. Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào mô nuôi cấy. - Vitamin: Nuôi cấy in vitro khi chồi tái sinh chồi vẫn tự tổng hợp được vitamin nhưng không đủ do vậy phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy đặc biệt là vitamin nhóm B (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [15]. Tùy thuộc vào các loại mô nuôi cấy và giai đoạn nuôi cấy mà hàm lượng vitamin bổ sung vào khác nhau.