Luận Văn Thạc Sĩ: Tách Dòng và Giải Trình Tự Gene Mã Hóa Enzyme Feruloyl CoA Synthase từ Chủng Amycolatopsis sp HR104

• Tác giả: Hoàng Thị Thúy Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Dương Văn Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên - Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl-coa synthase từ chủng Amycolatopsis sp. HR104
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CÁM ƠN
• BẢNG DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Yêu cầu của đề tài
• 1.4. Ý nghĩa của đề tài
• 1.4.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về vanillin
• 2.2. Lịch sử và nguồn gốc vanillin
• 2.3. Đặc điểm hình thái Vanillin planifolia
• 2.4. Cấu trúc đặc điểm lý hóa của vanillin
• 2.5. Hoạt tính sinh học vanillin
• 2.5.1. Hoạt tính kháng khuẩn
• 2.5.2. Hoạt tính chống oxy hóa
• 2.5.3. Hoạt tính chống ung thư và đột biến gene
• 2.5.4. Hoạt tính hạ lipid máu
• 2.5.5. Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm
• 2.5.6. Các hoạt tính khác
• 2.6. Vai trò của vanillin trong công nghiệp và trong đời sống
• 2.6.1. Chất tạo mùi trong sản phẩm gia dụng
• 2.6.2. Vanillin được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm
• 2.6.3. Dược phẩm
• 2.6.4. Tạo hương
• 2.7. Các con đường sinh tổng hợp vanillin
• 2.7.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật
• 2.7.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ vi sinh vật
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Khuếch đại đoạn DNA bằng phương pháp PCR
• 3.4.2. Điện di DNA trong gel agarose
• 3.4.3. Gắn DNA vào vector pTZ57R/T bằng enzyme T4 Ligase
• 3.4.4. Chuẩn bị tế bào khả biến
• 3.4.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến
• 3.4.6. Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp sử dụng SDS - kiềm
• 3.4.7. Phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 3.4.8. Xác định trình tự nucleotit bằng phương pháp sanger
• 3.4.9. So sánh trình tự DNA trên ngân hàng gene NCBI
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nhân gene fcs bằng phương pháp PCR
• 4.2. Kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector đích pTZ57R/T
• 4.3. Sàng lọc các dòng mang vector pTZ-fcs bằng điện di so sánh kích thước trên gel agarose
• 4.4. Kết quả chọn lọc dòng mang vector pTZ-fcs bằng lập bản đồ giới hạn
• 4.5. Kết quả chọn lọc dòng bằng phương pháp PCR
• 4.6. Kết quả phân tích giải trình tự gene fcs
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tách dòng gene fcs

Quá trình tách dòng gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp. HR104 là bước đầu tiên trong nghiên cứu này. Gene fcs mã hóa cho enzyme feruloyl-CoA synthase, enzyme này có vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa acid ferulic thành feruloyl-CoA. Việc tách dòng gene này được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gene fcs từ DNA của chủng vi sinh vật, sau đó gắn vào vector pTZ57R/T. Kết quả của quá trình này sẽ tạo ra các dòng vi sinh vật mang gene fcs, từ đó có thể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để xác định hoạt tính của enzyme. Việc tách dòng gene không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong sản xuất vanillin tự nhiên.

1.1. Phương pháp tách dòng

Phương pháp tách dòng gene fcs được thực hiện bằng cách sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, điện di gel agarose và gắn DNA vào vector. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại đoạn gene fcs từ DNA mẫu, sau đó sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di gel agarose để xác định kích thước và độ tinh khiết. Sau khi xác định thành công, sản phẩm PCR được gắn vào vector pTZ57R/T bằng enzyme T4 ligase. Quá trình này tạo ra plasmid mang gene fcs, cho phép chuyển vào tế bào chủ để tạo ra dòng vi sinh vật tái tổ hợp. Kết quả của quá trình này không chỉ cung cấp gene fcs mà còn tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sâu hơn về enzyme feruloyl-CoA synthase.

II. Giải trình tự gene fcs

Sau khi tách dòng gene fcs, bước tiếp theo là giải trình tự gene để xác định cấu trúc nucleotide của gene này. Việc giải trình tự được thực hiện bằng phương pháp Sanger, một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử. Kết quả giải trình tự cho phép xác định chính xác trình tự nucleotide của gene fcs, từ đó có thể phân tích và so sánh với các gene tương tự trong cơ sở dữ liệu. Phân tích trình tự gene không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của enzyme mà còn có thể chỉ ra các biến thể di truyền có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin hiệu quả hơn.

2.1. Phân tích trình tự gene

Phân tích trình tự gene fcs được thực hiện bằng cách so sánh với các gene tương tự trong cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả cho thấy gene fcs từ Amycolatopsis sp. HR104 có sự tương đồng cao với các gene fcs từ các chủng vi sinh vật khác. Sự tương đồng này không chỉ khẳng định tính chính xác của quá trình tách dòng và giải trình tự mà còn cung cấp thông tin quý giá về sự tiến hóa và chức năng của enzyme feruloyl-CoA synthase. Việc phân tích trình tự gene cũng giúp xác định các vị trí quan trọng trong cấu trúc enzyme, từ đó có thể thiết kế các thí nghiệm tiếp theo nhằm tối ưu hóa hoạt tính của enzyme trong sản xuất vanillin.

III. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về tách dòng và giải trình tự gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp. HR104 có nhiều ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc tạo ra các dòng vi sinh vật tái tổ hợp mang gene fcs mở ra cơ hội sản xuất vanillin tự nhiên một cách hiệu quả hơn. Vanillin là một hợp chất có giá trị cao trong ngành công nghiệp thực phẩm và hương liệu. Sản xuất vanillin từ vi sinh vật không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn bảo vệ môi trường, vì quá trình này không cần sử dụng hóa chất độc hại. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng góp phần vào việc phát triển các công nghệ sinh học mới, ứng dụng trong sản xuất các hợp chất có giá trị từ nguồn nguyên liệu tái tạo.

3.1. Tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất vanillin tự nhiên từ vi sinh vật. Với sự phát triển của công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền, có thể tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất vanillin với năng suất cao hơn. Điều này không chỉ đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường mà còn góp phần bảo vệ môi trường. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất, cải thiện hoạt tính của enzyme và phát triển các phương pháp mới trong công nghệ sinh học.