Đặt vấn đề Vanillin (3-methoxy-4 hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Hua, Ma et al. Sản lượng vanillin tiêu thụ trên thế giới hàng năm ước tính khoảng 12000 tấn (Krings 1998, Lomascolo 1999) [33,38]. Vanillin tự nhiên được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp tách chiết từ nguồn vỏ quả của loài lan Vanilla phanifolia. Lượng vanillin được tạo ra bằng phương pháp này mới đáp ứng được khoảng 1% nhu cầu từ thị trường (Prince, 1994) [44], trong khi lượng vanillin còn lại chủ yếu được tổng hợp nhân tạo theo phương pháp hóa học (Li and Rosazza, 2000) [36].
Tuy nhiên, theo quy định của Mỹ và châu Âu thì vanillin tổng hợp hóa học không được coi như tương đương với vanillin tự nhiên (Muheim A, 1999) [41]. Trên thực tế, giá thành của 1 kg vanillin tự nhiên dao động trong khoảng 1,200 tới 4,000 USD, trong khi đó giá của 1 kg vanillin nhân tạo chỉ vào khoảng 15 USD (Yoon, Li et al. Ngoài ra quá trình tổng hợp vanillin theo phương pháp tổng hợp hóa học tác động gây ảnh hưởng xấu tới môi trường. Có một số nghiên cứu chỉ ra rằng vanillin được tổng hợp từ các vi sinh vật khác nhau thông qua chuyển hóa sinh học từ các nguồn cơ chất khác nhau như acid ferulic, eugenol, isogenol, lignin.
Trong số đó acid ferulic là một trong những đối tượng được nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp để tạo ra vanillin có thể sử dụng như vanillin tự nhiên. Ở vi sinh vật acid ferulic được biến đổi thành feruloyl-CoA dưới sự xúc tác của enzyme feruloyl-coA synthetase mã hóa bởi gene fcs sau đó feruloyl-CoA tiếp tục được chuyển hóa thành vanillin dưới sự tác động của enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase hóa bởi gene ech (Yoon, Li et al. Những chủng vi sinh vật được xác định có mang gene fcs và ech mã hóa cho quá trình chuyển hóa acid ferulic để tạo ra vanillin như: Amycolatopsis sp. HR104 (Yoon, Li et al.
HR167 (Achterholt, Priefert et al. n 2 2000) [5], Pseudomonas putida (Plaggenborg, Overhage et al. 2003) [42], Bacillus subtili (Plaggenborg, Overhage et al. 2003) [42], Pseudomonas fluorescens (Di Gioia, Luziatelli et al.
Mặc dù vanillin được tổng hợp từ những sinh vật trên nhưng lượng vanillin được tạo ra cho năng suất thấp hoặc sản phẩm nhanh chóng bị chuyển đổi thành các sản phẩm phụ khác hoặc bị vi sinh vật sử dụng như nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho sinh vật phát triển (Yoon, Li et al. Ngoài ra quá trình lên men của một số xạ khuẩn gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi xạ khuẩn và bào tử (Bushell ME, 1999) [10]. Trong những năm gần đây với sự kết hợp giữa những thành tựu của công nghệ DNA tái tổ hợp và những thành tựu kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp sản xuất sản xuất vanillin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp được tạo thành mang các gene được tách dòng từ những sinh vật có khả năng sinh tổng hợp sản xuất vanillin.
Với các đặc tính như khả năng sinh trưởng phát triển tốt, có khả năng tiếp nhận các gene ngoại lai vào trong hệ gene nội tại hệ gene không có con đường phân hủy vanillin và các đặc điểm di truyền cùng với quy trình lên men đã được nghiên cứu kĩ (Priefert, Rabenhorst et al. coli được coi là một trong số đối tượng thích hợp để nghiên cứu và ứng dụng tạo chủng tái tổ hợp cho sản xuất vanillin. Việc sử dụng phương pháp DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin đã khắc phục được những khó khăn còn tồn tại trong việc sản xuất vanillin. Ở Việt Nam sản xuất vanillin mới chỉ dừng lại ở phương pháp tổng hợp hóa học và việc sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp còn là một hướng đi mới.
Xuất phát từ thực tiễn tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl-coa synthase từ chủng Amycolatopsis sp. Nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất vanillin, trước mắt là tạo ra chủng E. coli tái tổ hợp. Mục tiêu của đề tài - Tách dòng và giải trình tự gene fcs mã hóa enzyme feruloyl-coa - synthase từ chủng Amycolatopsis sp.
Yêu cầu của đề tài - Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ chủng Amycolatopsis sp. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Tách dòng và giải trình tự gene fcs tạo tiền đề cho nghiên cứu tổng hợp vanillin trong E. coli sau này.
Ý nghĩa thực tiễn - Sản phẩm của nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới cho sản xuất vanillin tự nhiên. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về vanillin 2. Lịch sử và nguồn gốc vanillin Vanilin là chất thơm tự nhiên được tách từ vỏ quả của một số loài lan nhiệt đới (họ Orchidaceae).
Trong 110 loài lan Vanilla được tìm thấy có ba loài có khả năng sản xuất ra vanillin: Vanilla planifolia, Vanillus tahitensis và Vanillus pompona (Ravishankar, 2000) [45]. planifolia là loài được đánh giá cao hơn về năng suất và chất lượng của vỏ quả và là nguồn cung cấp chính các sản phẩm vanillin tự nhiên (Sinha, Sharma et al. Lịch sử của vanillin bắt đầu được khám phá tại Mexico trong khoảng những năm 1300 và người Aztec người bản địa của Mexico là những người đầu tiên trồng và sử dụng vanillin làm đồ uống của họ. Đến năm 1500 khi người Tây Ban Nha xâm lược Mexico họ đã học cách sử dụng hương liệu này cho đồ uống.
Những năm sau đó vanillin bắt đầu được đưa vào trồng ở các nước Châu Âu tuy nhiên quá trình trồng vanillin gặp khó khăn về vấn đề thụ phấn tự nhiên do cây vanillin không đậu quả. Trong khoảng thời gian này nguồn cung cấp vanillin chính vẫn là từ Mexico. Đến năm 1841 khi giáo sư Charles Morre tìm ra phương pháp thụ phấn nhân tạo cho vanillin phương pháp này đã giúp trồng thành công vanillin ở các nước bên ngoài Mexico. Ngày nay vanillin tự nhiên được trồng ở các nước thuộc Châu Phi, Châu Á và các nước nhiệt đới.sản phẩm vanillin được sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp hương liệu, thực phẩm, đồ uống, dược liệu, nước hoa.
Đặc điểm hình thái Vanillin planifolia. planifolia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện khí hậu nhiệt đới, lượng mưa trung bình khoảng 190 - 230 cm, nhiệt độ dao động trong khoảng 24- 300C, độ ẩm cao (Ravishankar, 2000) [45]. Hình thái bên ngoài của cây V. planifolia: Cây có dạng thân leo, thân mọng nước, có tua quấn quanh trục thân đối diện với lá giúp cho cây bám vào giá thể.
Lá n 5 mịn, dày, có màu xanh lá cây tươi sáng, kích thước lá dài khoảng 10 - 23 cm rộng khoảng 4 -6 cm. Sau khi trồng khoảng từ 2 - 3 năm cây bắt đầu ra hoa thành những chùm màu vàng. Cánh hoa dài khoảng 10 cm cuống hoa dài khoảng 4-5 cm. Có đài hoa và cánh hoa dài 5 cm màu xanh nhạt.
Sau quá trình thụ tinh 10-12 tháng có thể thu được quả vanillin trưởng thành. Quả trưởng thành có vỏ màu xanh vàng, hình trụ tự nhiên, ba mặt, dài 20-25 cm và rộng 1-1,5 cm. Những quả vanillin tươi chúng có mùi khó chịu và chỉ thu được các hợp chất thơm khi xử lý chúng. Thời gian thu hoạch phụ thuộc theo từng vùng miền khác nhau (Ravishankar, 2000) [45].
Cấu trúc đặc điểm lý hóa của vanillin Vanillin thương phẩm có thể tồn tại ở dạng bột, tinh thể màu trắng mùi thơm mạnh và dễ chịu. Các đặc điểm tính chất của vanillin được trình bày trong bảng: Bảng 2.1: Đặc điểm cấu trúc thành phần của vanillin (Sinha, Sharma et al. 2008) [ 49] Công thức cấu tạo C8H8O3 Tên khoa học (3-methoxy-4 hydroxybenzaldehyde Công thức phân tử Trọng lượng phân tử 152,15 Nhiệt độ nóng chảy 80- 810C Nhiệt độ sôi 850C Độ hòa tan 1g/100 ml Tỉ trọng hơi 5,2 Áp suất hơi 2,2 x 10_3 mmHg ở 250 C Hằng số phân ly pKa1 = 7,40, pKa2 = 11,4 ( 250C n 6 2. Hoạt tính sinh học vanillin 2.1 Hoạt tính kháng khuẩn Vanillin và các dẫn xuất của vanillin có hoạt tính kháng và chống lại hoạt động của các loại nấm như nấm men, nấm mốc gây hại trong thực phẩm (Fitzgerald, Stratford et al.
Chống lại hoạt động các nấm men gây bệnh quan trọng trong y học như Candida albicans và Cryptococcus neoformans (Boonchird, 1982) [9] và là tác nhân kháng của các loại vi khuẩn Escherichia coli, Lactobacillus plantarum, Listeria innocua gây hại trong y học.2 Hoạt tính chống oxy hóa Theo Kumar và cộng sự nghiên cứu trong vanillin có chứa các hoạt chất chống oxy hóa và hoạt tính loại bỏ các gốc tự do gây hại cho tế bào thần kinh. Do vậy vanillin có khả năng giảm ảnh hưởng của các tác nhân gây hại cho tế bào thần kinh như: Làm giảm quá trình oxy hóa xảy ra trong não bệnh nhân bị bệnh Alzheimer's, ngăn chặn sự hình thành của một hợp chất gọi là peroxynitrite tác nhân gây nên bệnh thoái hóa não ở bệnh Parkinson (Kumar SS, 2002) [34].3 Hoạt tính chống ung thư và đột biến gene. Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vanilin có hoạt tính chống ung thư và đột biến gene (Imanishi H 1990, LR 1994. Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên nhiễm sắc thể 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogen peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycine C (Gustafson DL, 2000) [23].
Vanillin ức chế con đường Non-homologous DNA end- joining ( NHEJ) gây ra đứt gãy trên mạch kép DNA ức chế bởi hoạt tính của DNA -PK( DNA protein kinase) (Durant S, 2003) [16] và có thể làm giảm lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột (Akagi K, 1995) [6].4 Hoạt tính hạ lipid máu Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu mỡ máu. Ngoài ra vanillin đóng vai trò như một tác nhân hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá mức quy định cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2) và các bệnh liên quan đến rối loạn tim mạch và béo phì (Mokshagundam LRV, 2003) [40].5 Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm Trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh vanillin có khả năng chống tạo hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào hồng cầu (Abraham DJ, 1991) [4]. Tuy nhiên vanillin được hấp thụ qua đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu hóa. Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX-1520 đã được tổng hợp.