Nghiên cứu quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích hus nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm a h5n1 trong mẫu bệnh phẩm bằng, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề

• Tác giả: Trần Thị Tình
• Người hướng dẫn: Gs. Lương Xuân Hiến
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1
• 1.1. Phân loại học và danh pháp
• 1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1
• 1.3. Các genotype của virus cúm A/H5N1
• 1.4. Các clade của virus cúm A/H5N1
• 1.5. Danh pháp virus cúm
• 1.6. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1
• 1.7. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu
• 2.2.2. Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm
• 2.2.3. Thiế t kế mồ i
• 2.2.4. Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA
• 2.2.5. Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1
• 2.2.6. Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm
• 2.2.7. Điện di và phân tích kết quả
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế mồi
• 3.1.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen M của virus cúm A
• 3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen HA của virus cúm A/H5N1
• 3.1.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen NA của virus cúm A/H5N1
• 3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA
• 3.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
• 3.2.2. Tối ưu nồng độ mồi
• 3.2.3. Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi
• 3.2.4. Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR
• 3.2.5. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR
• 3.3. Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1
• 3.3.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
• 3.3.2. Tối ưu nồng độ mồi
• 3.3.3. Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi
• 3.3.4. Tối ưu số chu kỳ phản ứng
• 3.3.5. Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR
• 3.3.6. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplex RT-PCR
• 3.4. Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình phát hiện virus cúm gia cầm A H5N1

Virus cúm gia cầm A/H5N1 đã trở thành một trong những mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng. Việc phát hiện nhanh chóng virus này là rất quan trọng để kiểm soát dịch bệnh. Kỹ thuật multiplex RT-PCR đã được nghiên cứu và áp dụng để phát hiện virus A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhiều loại virus trong một lần xét nghiệm, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

1.1. Đặc điểm của virus cúm gia cầm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, có khả năng gây bệnh nghiêm trọng cho gia cầm và con người. Virus này có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Đặc điểm này làm cho việc phát hiện và kiểm soát virus trở nên khó khăn hơn.

1.2. Tầm quan trọng của việc phát hiện virus A H5N1

Việc phát hiện sớm virus cúm A/H5N1 giúp ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh. Các phương pháp xét nghiệm nhanh chóng và chính xác là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và ngành chăn nuôi. Kỹ thuật multiplex RT-PCR đã chứng minh được hiệu quả trong việc phát hiện virus này.

II. Thách thức trong việc phát hiện virus cúm A H5N1

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới mà các phương pháp xét nghiệm hiện tại có thể không phát hiện được. Hơn nữa, việc thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả xét nghiệm.

2.1. Khó khăn trong việc thu thập mẫu bệnh phẩm

Việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ gia cầm và người cần phải được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính chính xác. Mẫu bệnh phẩm cần được bảo quản đúng cách để tránh làm giảm độ nhạy của phương pháp xét nghiệm.

2.2. Sự biến đổi gen của virus A H5N1

Virus A/H5N1 có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng mới. Điều này làm cho việc phát hiện virus trở nên khó khăn hơn, vì các phương pháp xét nghiệm có thể không nhận diện được các chủng mới này.

III. Phương pháp multiplex RT PCR trong phát hiện virus A H5N1

Kỹ thuật multiplex RT-PCR là một phương pháp tiên tiến cho phép phát hiện nhiều loại virus trong một lần xét nghiệm. Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời nâng cao độ chính xác trong việc phát hiện virus cúm A/H5N1. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng multiplex RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện virus này.

3.1. Nguyên lý hoạt động của multiplex RT PCR

Multiplex RT-PCR hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA thông qua phản ứng polymerase. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhiều mục tiêu gen trong một phản ứng duy nhất, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

3.2. Ưu điểm của kỹ thuật multiplex RT PCR

Kỹ thuật multiplex RT-PCR có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, thời gian xét nghiệm ngắn và khả năng phát hiện nhiều loại virus trong một lần xét nghiệm. Điều này rất quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh cúm gia cầm A/H5N1.

IV. Kết quả nghiên cứu ứng dụng multiplex RT PCR

Nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm kỹ thuật multiplex RT-PCR trên nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau. Kết quả cho thấy kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện virus cúm A/H5N1. Việc áp dụng kỹ thuật này trong các phòng xét nghiệm sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện và kiểm soát dịch bệnh.

4.1. Thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm

Kỹ thuật multiplex RT-PCR đã được thử nghiệm trên nhiều mẫu bệnh phẩm từ gia cầm và người. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này rất cao, giúp phát hiện virus A/H5N1 một cách nhanh chóng và chính xác.

4.2. Ứng dụng thực tiễn của multiplex RT PCR

Kỹ thuật multiplex RT-PCR có thể được áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm để phát hiện virus cúm A/H5N1. Việc này không chỉ giúp nâng cao khả năng phát hiện mà còn góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR đã mở ra nhiều triển vọng trong việc kiểm soát dịch bệnh. Việc áp dụng kỹ thuật này sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện và kiểm soát dịch bệnh, đồng thời giảm thiểu thiệt hại cho ngành chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của kỹ thuật multiplex RT PCR

Kỹ thuật multiplex RT-PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện nhiều loại virus khác nhau. Việc nghiên cứu và phát triển kỹ thuật này sẽ giúp nâng cao khả năng phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trong tương lai.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa kỹ thuật multiplex RT-PCR, nhằm nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu. Đồng thời, cần nghiên cứu thêm về các chủng virus mới để đảm bảo khả năng phát hiện kịp thời.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Kể từ cuối năm 2003, virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã bùng phát mạnh mẽ tại nhiều quốc gia châu Á, gây thiệt hại hàng tỷ USD cho ngành chăn nuôi gia cầm và đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo các thống kê dịch tễ học, Việt Nam từng đứng thứ 2 thế giới về số ca nhiễm và tử vong do virus A/H5N1, với tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân nhập viện lên tới xấp xỉ 60%, đặc biệt tỷ lệ này chạm ngưỡng 89% ở nhóm trẻ em dưới 15 tuổi. Do virus có hệ gen biến đổi liên tục thông qua các cơ chế trôi dạt và tái tổ hợp kháng nguyên, việc phát hiện sớm mầm bệnh là yếu tố sống còn để ngăn chặn nguy cơ bùng phát đại dịch trên diện rộng.

Phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy phân lập virus đòi hỏi phòng an toàn sinh học cấp 3 và mất từ 2 đến 6 ngày, trong khi kỹ thuật RT-PCR đơn mồi tiêu chuẩn phải thực hiện 3 phản ứng riêng biệt (xác định type A, phân type H5 và phân type N1) làm kéo dài thời gian xét nghiệm từ 12 đến 24 giờ và tốn kém chi phí sinh phẩm. Để giải quyết nút thắt này, đề tài tập trung vào mục tiêu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và tối ưu hóa quy trình kỹ thuật Multiplex RT-PCR một bước nhằm phát hiện đồng thời 3 gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1 trong cùng một phản ứng duy nhất.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Labo Trường Đại học Y Thái Bình trong giai đoạn 2009-2011, sử dụng nguồn bệnh phẩm thực tế tại các ổ dịch miền Bắc. Kết quả xây dựng thành công quy trình chẩn đoán rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn 3,5 đến 4 giờ, giảm 66,7% số lượng phản ứng luân nhiệt cần thực hiện và tiết kiệm hơn 50% chi phí hóa chất so với phương pháp RT-PCR thông thường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử vi sinh vật và di truyền học virus cúm:

• Đặc điểm cấu trúc hệ gen virus cúm A: Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, sở hữu vật chất di truyền là phân tử RNA sợi đơn âm phân đoạn gồm 8 đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 10 đến 11 protein chức năng. Trong đó, phân đoạn 7 mã hóa protein nền M1 và protein kênh ion M2 có tính bảo tồn rất cao giữa các phân type; phân đoạn 4 mã hóa glycoprotein bề mặt Haemagglutinin (HA) chịu trách nhiệm bám dính vào thụ thể sialic acid của tế bào vật chủ; phân đoạn 6 mã hóa enzyme Neuraminidase (NA) xúc tác quá trình giải phóng hạt virus thế hệ mới.
• Cơ chế biến đổi kháng nguyên: Tần số đột biến ngẫu nhiên trong quá trình sao chép của enzyme RNA polymerase không có chức năng đọc sửa tạo ra hiện tượng trôi dạt kháng nguyên (Antigenic drift) với tỷ lệ biến đổi trung bình 1 nucleotide trên mỗi chu kỳ tái bản. Khi xảy ra đồng nhiễm giữa các chủng trên cùng một vật chủ trung gian, sự tráo đổi các đoạn gen tạo nên hiện tượng biến đổi kháng nguyên nhảy vọt (Antigenic shift), hình thành chủng virus mới có độc lực cao.
• Nguyên lý Multiplex RT-PCR một bước: Phản ứng tích hợp quá trình phiên mã ngược tổng hợp cDNA từ khuôn mẫu RNA và phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại DNA trong một ống nghiệm duy nhất. Ba cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại đồng thời 3 đoạn gen mục tiêu: gen M (154 bp), gen HA (371 bp) và gen NA (292 bp) mà không gây ức chế chéo hay tạo cấu trúc primer-dimer.

Phương pháp nghiên cứu

• Cỡ mẫu và nguồn dữ liệu: Nghiên cứu thu thập và phân tích dữ liệu tin sinh học từ 139 trình tự gen M cùng hàng trăm trình tự gen HA và NA của các chủng cúm A/H5N1 công bố trên ngân hàng gen quốc tế GenBank. Mẫu thực nghiệm đối chứng gồm 14 mẫu RNA virus cúm A/H5N1 chuẩn (8 mẫu từ gia cầm gồm 2 ngan, 3 vịt, 3 gà và 6 mẫu từ người bệnh). Mẫu thực địa gồm 30 mẫu bệnh phẩm dịch ngoáy họng và mô phủ tạng gia cầm thu thập ngẫu nhiên tại các đàn gia cầm mắc bệnh trong vòng 3 ngày đầu của đợt dịch năm 2009 ở một số tỉnh phía Bắc.
• Phương pháp chọn mẫu: Chọn ngẫu nhiên từ 2 đến 3 cá thể gia cầm có biểu hiện lâm sàng điển hình hoặc chết trong ổ dịch, lấy mẫu bệnh phẩm đường hô hấp dưới và mô đích nhằm đảm bảo tải lượng virus đạt mức cao nhất.
• Quy trình phân tích và tối ưu hóa: Tách chiết RNA virus bằng cột silica spin column (bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA Mini Kit) từ 140 µl dịch huyền phù bệnh phẩm. Thiết kế mồi bằng các công cụ chuyên dụng ClustalX 2.11, BioEdit và FastPCR 5.4. Đánh giá độ nhạy tuyệt đối thông qua hệ thống plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt (kích thước 2974 bp) mang gen đích, phiên mã in vitro bằng bộ kit TranscriptAid T7 và kiểm tra nồng độ quang học OD260/OD280 trên máy Biophotometer. Chu trình luân nhiệt được tối ưu hóa trên hệ thống máy luân nhiệt C1000 BioRad và sản phẩm được phân tách qua điện di gel agarose 2% dưới hiệu điện thế 100V trong 50 phút. Lý do chọn phương pháp One-step Multiplex RT-PCR là nhằm loại bỏ triệt để nguy cơ ngoại nhiễm do mở nắp tube và tiết kiệm tối đa lượng bệnh phẩm đầu vào.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Thiết kế thành công 3 bộ mồi đặc hiệu có tính tương thích cao: Cặp mồi DiagMF/DiagMR khuếch đại đặc hiệu vùng bảo tồn trên gen M tạo sản phẩm 154 bp; cặp mồi DiagH5F/DiagH5R khuếch đại gen HA tạo sản phẩm 371 bp; cặp mồi DiagN1F/DiagN1R khuếch đại gen NA tạo sản phẩm 292 bp. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của cả 3 cặp mồi đều nằm trong khoảng hẹp 54,5°C đến 56,0°C với hàm lượng GC đạt 40% đến 55%, đảm bảo khả năng bắt cặp đồng thời mà không tạo liên kết bổ sung chéo.
• Xác lập chu trình luân nhiệt và thành phần phản ứng tối ưu: Phản ứng phiên mã ngược thực hiện tại 50°C trong 30 phút, hoạt hóa enzyme Taq ở 95°C trong 15 phút, tiếp nối bởi 40 chu kỳ luân nhiệt (biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 54°C trong 30 giây, kéo dài ở 72°C trong 45 giây) và hoàn thiện chuỗi ở 72°C trong 5 phút. Tỷ lệ nồng độ các cặp mồi được cân bằng chính xác ở mức 0,2 µM cho mỗi loại, giúp cả 3 đoạn DNA đích khuếch đại đồng đều với cường độ phát sáng tương đương.
• Độ nhạy và độ đặc hiệu đạt chuẩn tương đương phản ứng đơn mồi: Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật đạt mức 10^2 đến 10^3 bản sao RNA/µl cho cả 3 gen đích, tương đương với độ nhạy của kỹ thuật RT-PCR đơn mồi. Khi kiểm tra độ đặc hiệu trên các mẫu RNA của virus cúm A/H1N1, cúm A/H3, cúm B và các chủng vi sinh vật đối chứng, phản ứng cho kết quả âm tính 100%, khẳng định không xuất hiện hiện tượng dương tính giả hoặc phản ứng chéo.
• Thử nghiệm thành công trên mẫu thực địa: Quy trình phát hiện chính xác 100% trong số 14 mẫu chứng dương (hiển thị đầy đủ 3 vạch kích thước 154 bp, 292 bp, 371 bp). Thử nghiệm trên 30 mẫu bệnh phẩm thực địa năm 2009 cho kết quả trùng khớp hoàn toàn giữa phương pháp Multiplex RT-PCR và phương pháp RT-PCR đơn mồi truyền thống.

Thảo luận kết quả

Thành công của phản ứng Multiplex RT-PCR phụ thuộc chặt chẽ vào việc lựa chọn vị trí gắn mồi tại các phân đoạn gen. Đoạn gen M kích thước 154 bp có tính bảo tồn tuyệt đối ở tất cả các subtype cúm A, đóng vai trò như một chứng nội tại xác nhận sự hiện diện của virus cúm type A. Trong khi đó, việc khuếch đại thành công 2 đoạn gen HA (371 bp) và NA (292 bp) cho phép khẳng định chính xác kiểu hình kháng nguyên H5N1 mà không cần thực hiện thêm các bước giải trình tự tốn kém.

Khi đối chiếu với các công bố khoa học trong và ngoài nước, phương pháp Realtime RT-PCR dù cho kết quả nhanh (khoảng 2 đến 3 giờ) nhưng đòi hỏi chi phí đầu tư máy móc và hóa chất huỳnh quang cao gấp 3 đến 4 lần, khó áp dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm tuyến tỉnh. Ngược lại, các kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) hoặc que thử nhanh kháng nguyên chỉ đạt độ nhạy khoảng 60% đến 70% và thường không phân biệt được các subtype HA. Kết quả điện di trên bản gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide minh chứng rõ nét khả năng phân tách 3 băng DNA riêng biệt, thẳng hàng và không có hiện tượng tạo vạch mờ hay primer-dimer ở đáy giếng.

Đề xuất và khuyến nghị

• Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kỹ thuật: Khuyến nghị Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Cục Thú y ban hành quy trình thao tác chuẩn (SOP) về kỹ thuật Multiplex RT-PCR một bước, đồng thời tổ chức tập huấn chuyển giao cho 15 đến 20 trung tâm y tế dự phòng và chi cục thú y vùng trong thời gian 6 đến 12 tháng tới nhằm rút ngắn thời gian trả kết quả xét nghiệm dịch tễ xuống dưới 5 giờ.
• Thiết lập mạng lưới giám sát đột biến mồi định kỳ: Các phòng thí nghiệm trọng điểm cần thực hiện giải trình tự ngẫu nhiên khoảng 5% đến 10% các mẫu dương tính định kỳ 6 tháng một lần để đối chiếu trình tự mồi DiagMF, DiagH5F, DiagN1F với các chủng virus mới lưu hành, đảm bảo tỷ lệ tương đồng nucleotide luôn duy trì trên mức 98%.
• Ứng dụng sàng lọc diện rộng tại ổ dịch: Đưa kỹ thuật Multiplex RT-PCR vào danh mục xét nghiệm sàng lọc bắt buộc đối với 100% các mẫu bệnh phẩm gia cầm chết bất thường tại các trang trại quy mô trên 1.000 con nhằm khoanh vùng và dập dịch triệt để trong vòng 24 giờ đầu tiên.
• Phát triển bộ sinh phẩm thương mại dạng hỗn dịch pha sẵn: Khuyến khích các doanh nghiệp công nghệ sinh học trong nước phối hợp với các viện nghiên cứu đóng gói bộ sinh phẩm dạng premix đông khô (All-in-one MasterMix) trong vòng 1 đến 2 năm, giúp giảm thêm 20% đến 30% giá thành và hạn chế tối đa sai sót thao tác của kỹ thuật viên.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và vi sinh vật học: Tiếp cận phương pháp luận khoa học về thiết kế hệ thống đa mồi (multiplex primers), kỹ thuật tạo dòng plasmid pJET1.2/blunt phục vụ phiên mã RNA in vitro để đánh giá độ nhạy phân tử tuyệt đối.
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm y tế và thú y: Ứng dụng trực tiếp thông số chu trình luân nhiệt, thành phần hóa chất và kỹ thuật xử lý bệnh phẩm (mô, dịch ngoáy họng) để triển khai xét nghiệm chẩn đoán virus cúm A/H5N1 tại đơn vị.
• Giảng viên và học viên sau đại học khối ngành Công nghệ sinh học / Y sinh học: Sử dụng tài liệu như một nghiên cứu thực nghiệm mẫu mực về quy trình tối ưu hóa các thông số nhiệt độ gắn mồi, nồng độ dNTP, enzyme và phân tích dữ liệu điện di.
• Chuyên gia dịch tễ học và nhà quản lý y tế công cộng: Tham khảo dữ liệu đánh giá hiệu quả kinh tế - kỹ thuật giữa các phương pháp chẩn đoán nhằm xây dựng chiến lược phòng chống dịch bệnh theo mô hình Một sức khỏe (One Health), kết hợp bảo vệ đàn gia cầm và ngăn chặn lây nhiễm sang người.

Câu hỏi thường gặp

• Kỹ thuật Multiplex RT-PCR có điểm gì vượt trội so với RT-PCR đơn mồi truyền thống? Thay vì phải vận hành 3 phản ứng riêng rẽ cho từng gen M, HA và NA mất từ 12 đến 24 giờ, kỹ thuật Multiplex RT-PCR tích hợp cả 3 cặp mồi trong một ống nghiệm duy nhất. Phương pháp này rút ngắn thời gian chạy máy xuống còn khoảng 3,5 giờ, tiết kiệm hơn 50% chi phí hóa chất và giảm 66% công lao động của kỹ thuật viên.

• Nguyên nhân nào giúp phản ứng tránh được hiện tượng cạnh tranh mồi và tạo primer-dimer? Nghiên cứu đã tính toán kỹ lưỡng các thông số nhiệt động học bằng phần mềm FastPCR 5.4, kiểm soát hàm lượng GC ở mức 40% đến 55% và cân bằng nhiệt độ nóng chảy của các mồi quanh mức 55°C. Đồng thời, nồng độ từng cặp mồi được tối ưu hóa ở mức đồng đều 0,2 µM giúp các đoạn gen đích cạnh tranh enzyme công bằng.

• Độ nhạy phát hiện của quy trình đạt ngưỡng bao nhiêu bản sao virus? Thông qua việc chuẩn hóa bằng RNA phiên mã in vitro từ plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt chứa gen đích, ngưỡng phát hiện của phản ứng đạt từ 10^2 đến 10^3 bản copy RNA/µl mẫu bệnh phẩm. Mức độ nhạy này hoàn toàn tương đương với các phản ứng RT-PCR đơn mồi riêng biệt và đủ khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm.

• Quy trình này có thể áp dụng đồng thời cho mẫu bệnh phẩm trên người và gia cầm không? Quy trình đã được kiểm chứng thực nghiệm trên 6 mẫu RNA cúm A/H5N1 từ bệnh nhân và 8 mẫu từ gia cầm (gà, vịt, ngan), cho độ chính xác 100%. Các cặp mồi được thiết kế hướng tới các vùng gen bảo tồn của phân dòng virus lưu hành tại Đông Nam Á nên hoạt động ổn định trên cả mẫu người lẫn mẫu động vật.

• Nếu virus cúm A/H5N1 phát sinh biến chủng mới thì quy trình có bị giảm độ chính xác không? Gen M là gen siêu bảo tồn của virus cúm A nên phản ứng luôn nhận diện được sự có mặt của mầm bệnh. Tuy nhiên, trước nguy cơ đột biến trên gen HA và NA, các đơn vị xét nghiệm cần định kỳ giải trình tự khoảng 5% số mẫu dương tính để cập nhật nucleotide của mồi khi độ tương đồng suy giảm dưới 95%.

Kết luận

• Xây dựng hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật Multiplex RT-PCR một bước phát hiện đồng thời 3 gen M (154 bp), HA (371 bp) và NA (292 bp) của virus cúm gia cầm A/H5N1 trong một phản ứng duy nhất.
• Tối ưu hóa thành công các điều kiện luân nhiệt với nhiệt độ gắn mồi 54°C, thời gian kéo dài chuỗi 45 giây qua 40 chu kỳ, đạt độ nhạy phân tử từ 10^2 đến 10^3 bản copy RNA/µl và độ đặc hiệu 100%.
• Kiểm chứng hiệu quả chẩn đoán trên 44 mẫu bệnh phẩm thực tế (14 mẫu chuẩn và 30 mẫu thực địa) với kết quả trùng khớp hoàn toàn so với các phương pháp tiêu chuẩn.
• Đóng góp giải pháp kỹ thuật mang tính ứng dụng cao, giúp giảm hơn 50% chi phí hóa chất sinh phẩm và rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống dưới 4 giờ.
• Khuyến nghị các cơ quan y tế dự phòng và thú y sớm triển khai chuyển giao công nghệ diện rộng trong vòng 6 đến 12 tháng tới để tăng cường năng lực giám sát dịch bệnh chủ động.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc. Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới.

Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không đạt được hiệu quả cao.

Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát. Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Đây là kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RT- 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] PCR và điện di trên gel agarose.

Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định subtype N1. Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vì phải làm ba phản ứng RT-PCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: 1.

Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1. Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,. Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1.

ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1. Phân loại học và danh pháp 1. Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3 type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32].

Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA [36]. Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua.

Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16 subtype HA (H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9). Sự tái tổ hợp giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11].

Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người. Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có các đặc điểm di truyền đặc trưng [2]. Các genotype của virus cúm A/H5N1 Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype). Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen.

Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên 2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14].

Các clade của virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50]. Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5].

Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong dấu ngoặc đơn. Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1.

A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 Virus cúm H 5N1 là một subtype của virus cúm A , thuô ̣c ho ̣ Orthomyxoviridea. Virus cúm A/H5N1 mang các đă ̣c điể m của virus cúm A (hình 1. Cấu trúc của virus cúm A.com/news/6684/ human-antibodies-neutralize-avian-flu.html 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80- 120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm.

Vỏ bọc của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA, NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1. Bên trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36].

Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tùy theo từng chủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB 1-F2). Bên trong hạt virus, mỗi phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37].