MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc. Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả thế giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phòng chống dịch, thực hiện các chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới.
Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên toàn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phòng thường không đạt được hiệu quả cao.
Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ không trầm trọng như giai đoạn trước đây nhưng nếu không được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát. Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và chính xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). Đây là kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 giờ nếu thực hiện Realtime RT-PCR và 12-24 giờ nếu thực hiện RT- 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PCR và điện di trên gel agarose.
Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định subtype N1. Để đơn giản hóa quá trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RT-PCR thay vì phải làm ba phản ứng RT-PCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RT-PCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phòng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán cúm A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: 1.
Thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1. Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,. Thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1.
ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1. Phân loại học và danh pháp 1. Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3 type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32].
Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngoài ra, hệ gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA còn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA [36]. Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen rất lớn và nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua.
Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên của hai glycoprotein là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A còn được chia thành 16 subtype HA (H1-H16) và 9 subtype NA (N1-N9). Sự tái tổ hợp giữa các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus lưu hành ở các loài thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11].
Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người. Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên HA và NA. Do có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành còn được phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có các đặc điểm di truyền đặc trưng [2]. Các genotype của virus cúm A/H5N1 Trong những năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype). Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể hiện đặc điểm di truyền của virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen.
Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen còn lại từ các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên 2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14].
Các clade của virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50]. Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, mỗi clade còn có thể phân thành các subclade (phân dòng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5].
Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp của virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng nguyên HA và kháng nguyên NA đặt trong dấu ngoặc đơn. Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1.
A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng nguyên HA là H5 và kháng nguyên NA là N1. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 Virus cúm H 5N1 là một subtype của virus cúm A , thuô ̣c ho ̣ Orthomyxoviridea. Virus cúm A/H5N1 mang các đă ̣c điể m của virus cúm A (hình 1. Cấu trúc của virus cúm A.com/news/6684/ human-antibodies-neutralize-avian-flu.html 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80- 120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200-300 nm, đường kính 20 nm.
Vỏ bọc của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật chủ, trên màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhô ra. Các cấu trúc này chính là các kháng nguyên bề mặt của virus, dài khoảng 10-14 nm, đường kính 4-6 nm, bản chất là các glycoprotein HA, NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng nguyên trên bề mặt của hạt virus không đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 4-5/1. Bên trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36].
Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tùy theo từng chủng virus mà có thể có hoặc không có protein PB 1-F2). Bên trong hạt virus, mỗi phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, và PA) hình thành nên các phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37].