Tổng quan nghiên cứu

Dịch cúm gia cầm độc lực cao tại Việt Nam trong giai đoạn 2003–2015 đã gây ra thiệt hại nghiêm trọng với 5.611 ổ dịch bùng phát, buộc tiêu hủy khoảng 60 triệu con gia cầm và ghi nhận 127 ca nhiễm trên người với 64 trường hợp tử vong. Chủng virus cúm gia cầm A/H5N6 lần đầu tiên được phát hiện gây chết người tại Tứ Xuyên, Trung Quốc vào tháng 4 năm 2014, sau đó nhanh chóng xâm nhập và bùng phát tại Việt Nam vào tháng 8 năm 2014 tại Lạng Sơn và Hà Tĩnh.

Lạng Sơn và Quảng Ninh là hai tỉnh biên giới phía Bắc trọng yếu, sở hữu tổng đàn gia cầm hàng năm duy trì ở mức cao từ 3,6 đến 4,4 triệu con tại Lạng Sơn và trên 3,5 triệu con tại Quảng Ninh. Tuy nhiên, hoạt động chăn nuôi tại đây chủ yếu theo quy mô nông hộ nhỏ lẻ, kết hợp với mạng lưới chợ buôn bán gia cầm sống phức tạp và thói quen giết mổ tại chỗ chưa đảm bảo an toàn sinh học. Trong giai đoạn 2013 đến đầu năm 2017, toàn khu vực đã ghi nhận 30 ổ dịch cúm gia cầm bùng phát, buộc tiêu hủy 34.121 con gia cầm, trong đó Quảng Ninh chịu ảnh hưởng nặng nề với 21 ổ dịch khiến 32.041 con bị tiêu hủy và Lạng Sơn ghi nhận 9 ổ dịch với 2.080 con bị tiêu hủy.

Luận văn thạc sĩ của tác giả Hoàng Bạch Tuyết được thực hiện nhằm giám sát sự lưu hành và xác định đặc tính sinh học phân tử của virus cúm A/H5N6 tại 8 chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn hai tỉnh trong giai đoạn 2016–2017. Nghiên cứu cung cấp hệ thống dữ liệu định lượng chính xác với tỷ lệ phát hiện virus cúm type A đạt 39,40%, subtype H5 đạt 5,90% và subtype N6 đạt 3,70%. Kết quả này là cơ sở khoa học then chốt để cảnh báo sớm nguy cơ dịch tễ, định hướng công tác lựa chọn vắc xin phòng bệnh phù hợp và hoàn thiện các giải pháp kiểm soát dịch bệnh truyền lây nguy hiểm giữa động vật và con người.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Virus cúm gia cầm thuộc nhóm type A của họ Orthomyxoviridae, mang vật chất di truyền là hệ gen RNA sợi đơn phân đoạn âm gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 11 protein chức năng. Cấu trúc kháng nguyên bề mặt của virus được xác định bởi 18 phân type Hemagglutinin (H1–H18) và 11 phân type Neuraminidase (N1–N11), trong đó sự phối hợp giữa các kháng nguyên này tạo nên các biến chủng có độc lực và phổ vật chủ khác nhau.

Khung lý thuyết tiến hóa của virus cúm A dựa trên hai cơ chế biến dị di truyền cơ bản: lệch kháng nguyên (antigenic drift) do đột biến điểm tích lũy trong quá trình sao chép với tần suất khoảng 1 nucleotide trên 10.000 nucleotide, và trộn kháng nguyên (antigenic shift) do hiện tượng tái tổ hợp các phân đoạn gen khi hai hay nhiều chủng virus đồng nhiễm trên cùng một tế bào vật chủ.

Kháng nguyên Hemagglutinin (HA) là một glycoprotein có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, gồm hai tiểu đơn vị HA1 và HA2 liên kết với nhau qua cầu nối disulfide. Vùng chuỗi nối (cleavage site) giữa HA1 và HA2 chứa các acid amin kiềm nhạy cảm với enzyme protease của tế bào chủ, đóng vai trò chỉ thị phân tử quyết định độc lực. Ở các chủng cúm độc lực cao (HPAI), chuỗi nối xuất hiện nhiều acid amin kiềm liên tiếp như Arginine (R) và Lysine (K), cho phép virus nhân lên nhanh chóng tại nhiều cơ quan nội tạng và gây tỷ lệ chết lên tới 100% trong vòng 48 đến 72 giờ sau khi nhiễm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả kết hợp dịch tễ học phân tích để thu thập dữ liệu chăn nuôi và diễn biến dịch bệnh giai đoạn 2013–2016. Cỡ mẫu giám sát thực địa được thu thập có hệ thống tại 8 chợ buôn bán gia cầm sống tiêu biểu, bao gồm 4 chợ tại Lạng Sơn (Đồng Đăng, Thất Khê, Hội Hoan, Na Dương) và 4 chợ tại Quảng Ninh (Minh Thành, Rừng, Địa Chất, Cái Răm).

Quy trình chọn mẫu tuân thủ nghiêm ngặt kỹ thuật lấy mẫu dịch tễ học thú y chủ động: tại mỗi chợ ở từng đợt giám sát, tiến hành lấy 30 mẫu dịch ngoáy hầu họng gà và 30 mẫu dịch ngoáy hầu họng vịt. Các mẫu bệnh phẩm đơn được gộp theo tỷ lệ 5:1 ngay tại thực địa để tạo thành 12 mẫu xét nghiệm đại diện, kết hợp thu thập 6 mẫu môi trường gồm 1 mẫu phân tươi, 2 mẫu chất thải lồng nhốt, 2 mẫu nước thải và 1 mẫu nước uống cho gia cầm.

Kỹ thuật Realtime RT-PCR được lựa chọn áp dụng theo quy trình TCCS 16:2016/TYV2-CĐ của Cơ quan Thú y vùng II nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, xác định mẫu dương tính khi ngưỡng chu kỳ Ct nhỏ hơn hoặc bằng 35. Đối với các mẫu dương tính, gen kháng nguyên HA được khuếch đại bằng hai cặp mồi đặc hiệu S17-S18 (đoạn HA1 kích thước 1.100 bp) và S19-S20 (đoạn HA2 kích thước 1.000 bp), sau đó giải trình tự gen và phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.0 cùng MEGA 6.0 theo phương pháp Neighbor-Joining với hệ số lặp lại bootstrap 1.000 lần.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Kết quả xét nghiệm dịch tễ phân tử tại 8 chợ thuộc hai tỉnh Lạng Sơn và Quảng Ninh đã ghi nhận những phát hiện quan trọng:

Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trung bình đạt 39,40%, trong đó tỉnh Quảng Ninh ghi nhận tỷ lệ dương tính là 48,97%, cao hơn đáng kể so với tỉnh Lạng Sơn với mức 29,42%.

Tỷ lệ lưu hành kháng nguyên subtype H5 đạt 5,90% với khoảng tin cậy 95% CI từ 4,43% đến 7,69%, trong đó Lạng Sơn đạt 6,71% (95% CI: 4,54%–9,50%) và Quảng Ninh đạt 5,09% (95% CI: 3,22%–7,61%). Đối với subtype N6, tỷ lệ dương tính toàn vùng là 3,70% (95% CI: 2,55%–5,19%), cụ thể tại Lạng Sơn là 4,40% và Quảng Ninh là 3,01%.

Phạm vi lưu hành không gian và thời gian cho thấy có tới 7 trên 8 chợ khảo sát (chiếm tỷ lệ 87,5%) có sự xuất hiện của virus cúm A/H5N6. Mầm bệnh tập trung cao độ vào các tháng 1, tháng 2 và tháng 3 hàng năm.

Về mặt đặc tính sinh học phân tử, độ dài gen HA của các chủng virus nghiên cứu không biến đổi so với các chủng gây dịch năm 2014. Tỷ lệ tương đồng trình tự nucleotide của gen HA đạt từ 97,5% đến 97,7% và tương đồng amino acid đạt từ 93,9% đến 94,2% so với chủng tham chiếu A/Chicken/VN/LangSon/2014. Trình tự chuỗi nối giữa HA1 và HA2 mang motif đa kiềm đặc trưng PLRERRRKR/GLF và tất cả các chủng phân lập đều thuộc nhánh tiến hóa Clade 2.3.4.4.

Thảo luận kết quả

Sự khác biệt về tỷ lệ dương tính cúm type A giữa Quảng Ninh (48,97%) và Lạng Sơn (29,42%) phản ánh rõ nét mật độ giao thương và tập quán tiêu thụ gia cầm tại các đô thị du lịch biển so với khu vực miền núi. Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm phân type H5 và N6 tại Lạng Sơn lại cao hơn, nguyên nhân chủ yếu do vị trí giáp biên giới với nhiều đường mòn, lối mở tạo điều kiện cho hoạt động vận chuyển gia cầm không rõ nguồn gốc. Sự lưu hành tập trung vào quý 1 hàng năm trùng khớp với chu kỳ tiêu thụ thực phẩm dịp Tết Nguyên đán, khi lưu lượng vận chuyển gia cầm tăng từ 200% đến 300% kết hợp điều kiện thời tiết đông - xuân lạnh ẩm kéo dài giúp virus tồn lưu lâu trong môi trường.

Tỷ lệ dương tính với virus A/H5N6 tại các chợ trong nghiên cứu (3,70%) tương đương với kết quả giám sát quốc gia giai đoạn 2015–2016 của Cục Thú y trên 68 chợ thuộc 32 tỉnh thành (đạt 3,50% với 108/3.084 mẫu dương tính). Trình tự chuỗi cắt cleavage site chứa motif nhiều acid amin kiềm (RERRRKR) là bằng chứng phân tử khẳng định các chủng lưu hành đều mang độc lực cao (HPAI). Cây phả hệ phân tử xác định virus thuộc nhánh Clade 2.3.4.4 chỉ ra mối liên hệ dịch tễ học mật thiết với các chủng virus đang lưu hành rộng rãi tại khu vực Đông Á. Các dữ liệu dịch tễ này có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ lưu hành theo tháng, bản đồ GIS phân bố mật độ tại 8 chợ và sơ đồ cây phả hệ gen HA để hỗ trợ công tác dự báo dịch tễ trực quan.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng dịch tễ và sinh học phân tử, bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể được khuyến nghị triển khai:

Thứ nhất, tăng cường giám sát chủ động định kỳ tại các chợ buôn bán gia cầm sống. Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Lạng Sơn và Quảng Ninh cần duy trì tần suất lấy mẫu giám sát 1 tháng/lần vào các tháng cao điểm từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau tại 8 chợ đầu mối, nhằm phát hiện sớm và kiểm soát tỷ lệ dương tính môi trường chợ xuống dưới mức 1%.

Thứ hai, triển khai tiêm phòng vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên cao. Cơ quan chuyên môn cần chỉ đạo sử dụng các dòng vắc xin đạt hiệu lực bảo hộ với chủng Clade 2.3.4.4 như Navet-Vifluvac, Re-5 và Re-6, phấn đấu đạt tỷ lệ bao phủ tiêm phòng trên 80% tổng đàn gia cầm nuôi tại các vùng nguy cơ cao trong giai đoạn 2018–2020.

Thứ ba, chuẩn hóa quy trình vệ sinh tiêu độc khử trùng tại các chợ gia cầm. Ban quản lý 8 chợ dân sinh cần thực hiện nghiêm quy định nghỉ bán để tiêu độc tổng thể 1 lần/tuần, yêu cầu 100% hộ kinh doanh thu gom xử lý nước thải và chất thải lồng nhốt bằng hóa chất sát trùng chuyên dụng trước khi xả thải ra môi trường.

Thứ tư, siết chặt kiểm dịch vận chuyển động vật liên tỉnh và khu vực biên giới. Các lực lượng liên ngành cần tăng cường chốt chặn trên các tuyến quốc lộ huyết mạch như Quốc lộ 1A và Quốc lộ 18, xử lý và tiêu hủy bắt buộc 100% các lô gia cầm nhập lậu hoặc không rõ nguồn gốc theo đúng quy định tại Thông tư 07/2016/TT-BNNPTNT.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị thực tiễn cao cho bốn nhóm đối tượng chính:

Cơ quan quản lý Thú y và Y tế dự phòng: Cục Thú y, Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh biên giới phía Bắc cùng Trung tâm Kiểm soát bệnh tật (CDC) có thể sử dụng dữ liệu lưu hành tại 8 chợ và quy trình TCCS 16:2016/TYV2-CĐ để xây dựng kịch bản phòng chống dịch liên ngành y tế - thú y theo Thông tư 16/2013/TTLT-BYT-BNNPTNT.

Nhà khoa học, giảng viên và sinh viên ngành Thú y: Cung cấp nguồn tài liệu học thuật giá trị về phương pháp dịch tễ học thực địa, kỹ thuật Realtime RT-PCR gộp mẫu và các thông số di truyền học phân tử của gen HA với độ tương đồng 97,5%–97,7% phục vụ công tác giảng dạy và nghiên cứu chuyên sâu.

Doanh nghiệp sản xuất và phân phối vắc xin thú y: Khai thác dữ liệu về cấu trúc amino acid chuỗi nối (PLRERRRKR/GLF) và sự phân nhánh Clade 2.3.4.4 để định hướng nghiên cứu phát triển, kiểm nghiệm hoặc nhập khẩu các chủng vắc xin cúm gia cầm có độ tương thích kháng nguyên cao.

Ban quản lý chợ và thương lái buôn bán gia cầm: Nắm bắt thực trạng 87,5% chợ lưu hành mầm bệnh để chủ động áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, cải tiến khu vực giết mổ tập trung và trang bị bảo hộ lao động nhằm phòng ngừa nguy cơ lây nhiễm virus sang người.

Câu hỏi thường gặp

Virus cúm gia cầm A/H5N6 lưu hành tại các chợ có khả năng lây truyền sang người không? Virus cúm A/H5N6 là chủng virus độc lực cao (HPAI) có khả năng gây chết 100% trên gia cầm và đã ghi nhận nhiều ca tử vong ở người tại Trung Quốc từ năm 2014. Dù hiện tại chưa có bằng chứng lây truyền dễ dàng từ người sang người, sự hiện diện của virus tại 7 trên 8 chợ khảo sát với tỷ lệ nhiễm N6 đạt 3,70% tạo ra nguy cơ lây nhiễm trực tiếp cho người buôn bán và giết mổ gia cầm.

Vì sao mầm bệnh cúm A/H5N6 lại bùng phát mạnh vào các tháng 1, 2 và 3 hàng năm? Khoảng thời gian 3 tháng đầu năm trùng với dịp Tết Nguyên đán, khiến nhu cầu vận chuyển và tiêu thụ thịt gia cầm tăng vọt từ 200% đến 300%. Đồng thời, điều kiện thời tiết đông - xuân lạnh và ẩm tại miền Bắc giúp virus kéo dài thời gian tồn tại trong các mẫu nước thải, phân và chất thải lồng nhốt tại các chợ buôn bán gia cầm sống.

Đặc tính chuỗi nối cleavage site của virus trong nghiên cứu có ý nghĩa khoa học gì? Trình tự amino acid tại chuỗi nối giữa HA1 và HA2 của các chủng phân lập đều mang motif PLRERRRKR/GLF chứa nhiều gốc acid amin kiềm Arginine và Lysine. Đây là chỉ thị phân tử khẳng định virus có độc lực cao, cho phép enzyme protease phân cắt dễ dàng để virus xâm nhập và nhân lên nhanh chóng tại nhiều cơ quan nội tạng của vật chủ.

Những loại vắc xin nào hiện nay có khả năng bảo hộ tốt trước chủng cúm A/H5N6 Clade 2.3.4.4? Dựa trên phân tích phả hệ di truyền với độ tương đồng nucleotide trên 97,5%, các chủng virus phân lập đều thuộc Clade 2.3.4.4. Do đó, các loại vắc xin như Navet-Vifluvac, Re-5 và Re-6 được chứng minh có khả năng tạo miễn dịch bảo hộ chéo hiệu quả trên đàn gia cầm khi đạt tỷ lệ tiêm phòng trên 80%.

Phương pháp gộp mẫu 5:1 trong xét nghiệm Realtime RT-PCR mang lại lợi ích gì cho công tác giám sát? Quy trình gộp 5 mẫu tăm bông ngoáy hầu họng thành 1 mẫu xét nghiệm giúp tiết kiệm khoảng 80% chi phí sinh phẩm và tăng tốc độ xử lý hàng trăm mẫu bệnh phẩm trong các đợt giám sát thực địa. Kỹ thuật Realtime RT-PCR với độ nhạy cao (ngưỡng Ct ≤ 35) vẫn đảm bảo phát hiện chính xác tỷ lệ nhiễm cúm type A lên tới 39,40% mà không làm giảm độ tin cậy.

Kết luận

Nghiên cứu của luận văn mang lại những kết luận dịch tễ và sinh học phân tử cốt lõi:

  • Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trung bình tại các chợ là 39,40%, trong khi tỷ lệ dương tính với phân type độc lực cao H5 là 5,90% và N6 là 3,70%.
  • Mầm bệnh cúm A/H5N6 lưu hành phổ biến tại 7 trên 8 chợ khảo sát (chiếm 87,5%) và tập trung đột biến vào các tháng 1, tháng 2 và tháng 3 hàng năm.
  • Toàn bộ các chủng virus phân lập thuộc nhánh tiến hóa Clade 2.3.4.4, có độ tương đồng nucleotide từ 97,5% đến 97,7% so với chủng tham chiếu năm 2014 và mang cấu trúc chuỗi cắt độc lực cao PLRERRRKR/GLF.
  • Kế hoạch giám sát dịch tễ giai đoạn 2018–2020 cần duy trì lấy mẫu hàng tháng tại các chợ biên giới và nâng tỷ lệ tiêm vắc xin bao phủ đàn nuôi đạt trên 80%.
  • Các cấp quản lý thú y, chính quyền địa phương và cộng đồng kinh doanh gia cầm cần lập tức phối hợp thực hiện nghiêm ngặt các biện pháp vệ sinh tiêu độc và kiểm dịch liên ngành để ngăn chặn nguy cơ bùng phát dịch bệnh trên diện rộng.