ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) nhƣ một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch. Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tình ở ngƣời do S. suis đã và đang đƣợc coi là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao.
Rất nhiều trƣờng hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng nhƣ: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn nhƣ Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Trung ƣơng Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở ngƣời lớn tại Việt Nam. Ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S.
suis bởi các kỹ thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chì các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến. Ở Việt Nam, ví sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng nhƣ sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thì ngiệm, những phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phƣơng pháp hiện đại, nhanh và chình xác, phƣơng pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phƣơng pháp có tình khả thi hơn cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phƣơng pháp PCR định lƣợng (Real time PCR).
Với phƣơng pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện đƣợc sự có mặt của vi khuẩn S. suis, xác định đƣợc typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao. Đặng Thị Kiều Oanh 1 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Chình ví vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của ngƣời” với 2 mục tiêu chình sau đây: - Xây dựng quy trính PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S.
suis ở bệnh phẩm ngƣời; - Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. Đặng Thị Kiều Oanh 2 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis 1. Giới thiệu chung Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dƣơng, kỵ khì tùy tiện, kìch thƣớc khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào.
Trong bệnh phẩm, chúng thƣờng xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hính 1.suis có yếu tố quyết định kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này. Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc nhóm R, S và T tƣơng ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhƣng đến năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu đƣợc S.suis có tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhƣng typ 32 và 34 vừa đƣợc chứng minh là Streptococcus orisratti.
Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho ngƣời đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [50]. Nhƣng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hƣởng đến con ngƣời rộng rãi trên toàn thế giới, có rất ìt trƣờng hợp gây bệnh ở ngƣời do typ 1 và typ 14.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử (http://genome.org/strsu/strsu.html) Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trƣờng có 5- 10% CO2, mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy giàu chất dinh dƣỡng nhƣ môi trƣờng thạch máu, thạch Chocolate, nhƣng mọc tốt nhất trên môi trƣờng Columbia, nhiệt độ thìch hợp Đặng Thị Kiều Oanh 3 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 370C, nhƣng có thể phát triển đƣợc ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH thìch hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.
suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trƣờng thạch máu cừu và tan huyết dạng beta trên môi trƣờng thạch máu ngựa (Hính 1. suis trên môi trƣờng thạch máu cừu và thạch máu ngựa Mặc dù chức năng của 20-30% bộ gen chƣa đƣợc biết nhƣng nhiều gen đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã đƣợc nghiên cứu. Đó là những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu tố hạn chế sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. suis đã đƣợc giải trính tự gen.
Tùy từng chủng, bộ ben có kìch thƣớc từ 2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein (Bảng 1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis Chromosomes [13] Scaffolds or contigs [3] SRA or Traces [0] No data [1] Tình KT GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb) % 1 S.17 41 2,136 1,947 BM407 4 Streptococcus suis 1 - 2.1 2,253 2,185 Đặng Thị Kiều Oanh 4 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Tình KT GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb) % 98HAH33 5 Streptococcus suis A7 1 - 2.18 41 2,196 2,074 8 Streptococcus suis GZ1 1 - 2.4 2,047 1,977 9 Streptococcus suis JS14 1 - 2.2 2,174 2,066 10 Streptococcus suis SC84 1 - 2.1 2,068 1,898 11 Streptococcus suis SS12 1 - 2.2 2,161 2,079 12 Streptococcus suis ST1 1 - 2.4 2,097 1,987 13 Streptococcus suis ST3 1 - 2.7 1,607 1,559 05HAS68 Streptococcus suis 15 - - 2.2 2,427 2,334 17 Streptococcus suis S735 - - - - - Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome 1. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán *Vỏ polysacarit của vi khuẩn S.
suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide - cps). Việc định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này. Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 đƣợc cho là có liên quan nhiều hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ cũng có thể xảy ra.
Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đƣờng: Galactose, glucose, N- acetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine và sialic acid. Ở typ 2, N-acetyl glucosamine đƣợc thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ khác chƣa đƣợc nghiên cứu sâu. *Suilysin Suilysin là một yếu tố gây tan huyết đƣợc mã hóa bởi gen sly của S.
Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tƣơng đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae). Đặng Thị Kiều Oanh 5 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn thƣơng tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thì nghiệm đƣợc tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch).
Ngoài ra, suilysin còn có thể "khởi động" cho quá trính sản xuất và tác động của các cytokine. Thì nghiệm sử dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hƣởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến. Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn. *Hệ thống Arginine deminase Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định đƣợc 2 protein bề mặt vi khuẩn có kìch thƣớc 47 kDa và 53 kDa.
Hai protein này có mức độ tƣơng đồng cao với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. Protein 47 kDa tƣơng đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tƣơng đồng với streptococcal acid glycoprotein (SAGP). ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trính biến đổi arginine thành ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp.
Hệ thống ADS có mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis *Protein được giải phóng do muramidase (muramidase-released protein; mrp) và yếu tố ngoại bào (extracellular factor- ef) Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động vật bị bệnh nhƣng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên ngƣời, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số chủng phân lập đƣợc mang gen mrp. Mrp và ef cũng đƣợc coi là các yếu tố chỉ thị cho S.
Các chủng vi khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã đƣợc xác định. Biến Đặng Thị Kiều Oanh 6 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef.
Đã có nghiên cứu gây nhiễm trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực chẳng khác gí vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng miễn dịch vẫn cần đƣợc làm sáng tỏ bằng các thì nghiệm gây nhiễm thực nghiệm. *Các yếu tố độc lực khác Chúng ta đã biết rằng rất nhiều yếu tố có liên quan và chịu ảnh hƣởng ở những giai đoạn khác nhau của quá trính bệnh lý. Cũng nhƣ vậy, đối với vi khuẩn S.