Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình pcr đa mồi phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy của người

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy người, góp phần nâng cao y học.

• Tác giả: Đặng Thị Kiều Oanh
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Lê Thanh Hương
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Và Hoàn Thiện Quy Trình PCR Đa Mồi Phát Hiện Trực Tiếp Streptococcus Suis Từ Dịch Não Tủy Người
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis
• 1.1. Giới thiệu chung
• 1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán
• 1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình PCR đa mồi phát hiện Streptococcus suis

Quy trình PCR đa mồi là một kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến, cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác vi khuẩn Streptococcus suis từ dịch não tủy. Kỹ thuật này không chỉ giúp xác định sự hiện diện của vi khuẩn mà còn có thể xác định các yếu tố độc lực liên quan. Việc phát triển quy trình này là cần thiết trong bối cảnh gia tăng các ca nhiễm trùng do S. suis ở người, đặc biệt là tại Việt Nam.

1.1. Giới thiệu về Streptococcus suis và tầm quan trọng của việc phát hiện

Streptococcus suis là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng gây bệnh nghiêm trọng cho người và động vật. Việc phát hiện kịp thời S. suis từ dịch não tủy là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của bệnh và giảm thiểu tỷ lệ tử vong.

1.2. Lịch sử và sự phát triển của kỹ thuật PCR đa mồi

Kỹ thuật PCR đa mồi đã được phát triển từ những năm 1980 và đã trở thành một công cụ quan trọng trong chẩn đoán vi sinh vật. Sự phát triển này đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát hiện nhanh chóng các tác nhân gây bệnh, đặc biệt là S. suis.

II. Thách thức trong việc phát hiện Streptococcus suis từ dịch não tủy

Việc phát hiện S. suis từ dịch não tủy gặp nhiều thách thức do sự tương đồng với các vi khuẩn khác và điều kiện nuôi cấy phức tạp. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy phân lập thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Do đó, cần có những phương pháp hiện đại hơn để cải thiện khả năng phát hiện.

2.1. Những khó khăn trong chẩn đoán vi khuẩn từ dịch não tủy

Chẩn đoán vi khuẩn từ dịch não tủy thường gặp khó khăn do sự hiện diện của các vi khuẩn khác và điều kiện môi trường không thuận lợi. Điều này dẫn đến việc cần thiết phải phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn.

2.2. Tác động của việc chẩn đoán chậm đến sức khỏe cộng đồng

Việc chẩn đoán chậm có thể dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ tử vong và các biến chứng nghiêm trọng. Do đó, việc phát triển quy trình PCR đa mồi là cần thiết để cải thiện khả năng phát hiện và điều trị kịp thời.

III. Phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện Streptococcus suis

Phương pháp PCR đa mồi cho phép phát hiện đồng thời nhiều gen của S. suis, giúp tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình. Quy trình này bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, khuếch đại gen và phân tích kết quả. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.

3.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật PCR đa mồi

Kỹ thuật PCR đa mồi hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA, cho phép phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn thông qua việc khuếch đại các đoạn gen đặc trưng. Điều này giúp tăng cường khả năng phát hiện ngay cả khi nồng độ vi khuẩn trong mẫu rất thấp.

3.2. Các bước thực hiện quy trình PCR đa mồi

Quy trình PCR đa mồi bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, thêm các mồi PCR, thực hiện phản ứng khuếch đại và phân tích kết quả. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

IV. Ứng dụng thực tiễn của quy trình PCR đa mồi trong nghiên cứu

Quy trình PCR đa mồi đã được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu để phát hiện S. suis từ dịch não tủy. Kết quả cho thấy phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc áp dụng quy trình này trong thực tiễn sẽ góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe.

4.1. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng trong thực tiễn

Nghiên cứu cho thấy quy trình PCR đa mồi có thể phát hiện S. suis với độ nhạy cao, giúp chẩn đoán sớm và chính xác. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh.

4.2. Tác động của quy trình PCR đa mồi đến y học

Việc áp dụng quy trình PCR đa mồi không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng S. suis mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại vi khuẩn khác, từ đó nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị trong y học.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Quy trình PCR đa mồi phát hiện Streptococcus suis từ dịch não tủy đã chứng minh được tính hiệu quả và tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình và mở rộng ứng dụng cho các loại vi khuẩn khác. Điều này sẽ góp phần nâng cao khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tầm quan trọng của việc tiếp tục nghiên cứu

Tiếp tục nghiên cứu và phát triển quy trình PCR đa mồi là cần thiết để cải thiện khả năng phát hiện và điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra. Điều này sẽ giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu tỷ lệ tử vong.

5.2. Triển vọng ứng dụng quy trình trong tương lai

Quy trình PCR đa mồi có thể được mở rộng ứng dụng cho nhiều loại vi khuẩn khác, từ đó nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị trong y học. Việc này sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm khuẩn cấp tính do liên cầu khuẩn lợn (Streptococcus suis) đang là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu lây truyền từ động vật sang người tại khu vực châu Á, đặc biệt tại Việt Nam và Trung Quốc. Trong các thể lâm sàng ở người, viêm màng não mủ chiếm tỷ lệ cao nhất với khoảng 72,5%, tiếp theo là thể nhiễm khuẩn huyết kèm sốc nhiễm trùng nhiễm độc chiếm 24,2% với tỷ lệ tử vong vượt mức 60%. Khoảng 66,4% đến 68% bệnh nhân sống sót sau viêm màng não phải gánh chịu di chứng điếc vĩnh viễn và rối loạn tiền đình kéo dài. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về một công cụ chẩn đoán nhanh, chính xác ngay ở giai đoạn sớm.

Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học của tác giả Đặng Thị Kiều Oanh, thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2013 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phan Lê Thanh Hương, tập trung giải quyết nút thắt chẩn đoán thực địa. Mục tiêu cốt lõi của nghiên cứu là xây dựng thành công quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) phát hiện trực tiếp Streptococcus suis cùng các gen độc lực từ dịch não tủy người, đồng thời tối ưu hóa kỹ thuật xử lý bệnh phẩm đơn giản bằng nhiệt mà không phụ thuộc vào các bộ kit tách chiết thương mại đắt tiền.

Nghiên cứu được triển khai trên 153 mẫu dịch não tủy thu thập tại các bệnh viện tuyến đầu như Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Kết quả mang lại ý nghĩa to lớn khi rút ngắn thời gian xét nghiệm từ 48 - 72 giờ của phương pháp nuôi cấy truyền thống xuống còn dưới 4 giờ, đồng thời giảm hơn 60% chi phí xét nghiệm cho mỗi ca bệnh nghi nhiễm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên cơ sở sinh bệnh học phân tử của vi khuẩn Streptococcus suis - vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, thuộc nhóm huyết thanh D theo phân loại Lancefield. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên vỏ polysaccharide (cps), vi khuẩn được phân loại thành 35 typ huyết thanh, trong đó typ 2 là tác nhân chủ yếu gây ra hơn 90% các ca bệnh nặng ở người trên toàn cầu. Khung lý thuyết tập trung vào các chỉ dấu di truyền độc lực chính:

• Gen mã hóa enzyme glutamate dehydrogenase (gdh) hoặc đoạn 16S-rDNA mang tính đặc trưng định danh loài.
• Cụm gen cps2J (kích thước khuếch đại 498 bp) quyết định typ huyết thanh 2.
• Gen sly (248 bp) mã hóa độc tố tan máu Suilysin có khối lượng phân tử 54 kDa gây độc tế bào nội mô vi mạch não.
• Các yếu tố liên quan như protein phóng thích bởi muramidase (mrp - 188 bp), yếu tố ngoại bào (epf - 744 bp) và enzyme arginine deminase (arcA - 118 bp).

Nguyên lý kỹ thuật PCR đa mồi cho phép kết hợp đồng thời nhiều cặp mồi đặc hiệu trong cùng một ống phản ứng nhiệt để nhân bản các đoạn DNA đích khác nhau, giúp nhận diện chính xác loài và kiểu gen độc lực chỉ trong một lần chạy máy.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 153 mẫu dịch não tủy lâm sàng, chia thành hai nhóm rõ rệt: 53 mẫu từ bệnh nhân viêm màng não cấp nghi ngờ do S. suis (gồm 44 mẫu đã khẳng định bằng nuôi cấy phân lập và 9 mẫu nuôi cấy âm tính) cùng 100 mẫu dịch não tủy đối chứng âm tính thực sự (71 mẫu từ trẻ em dưới 24 tháng tuổi mắc viêm não virus hoặc viêm màng não do Haemophilus influenzae, phế cầu, não mô cầu và 29 mẫu hội chứng não cấp). Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng nhằm đánh giá chuẩn xác độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng.

Quy trình phân tích được thiết kế qua các bước tối ưu hóa nghiêm ngặt:

• Khảo sát nồng độ mồi tối ưu trong dải từ 40 nM đến 500 nM (chọn điểm tối ưu ở 200 nM).
• Thiết lập hệ đệm phản ứng chuẩn: 2,5 U Taq DNA polymerase, 1,5 mM đến 3,0 mM MgCl2, 200 µM mỗi loại dNTP trong thể tích 50 µl.
• Chu trình nhiệt được lập trình với nhiệt độ gắn mồi dao động từ 55°C đến 58°C qua 35 chu kỳ khuếch đại.
• Phương pháp xử lý bệnh phẩm: Thử nghiệm xử lý nhiệt ở các mức 80°C, 85°C và 90°C trong thời gian từ 15 đến 60 phút nhằm phá vỡ vách tế bào vi khuẩn để giải phóng DNA trực tiếp mà không qua bước tinh sạch bằng cột sắc ký.

Lý do lựa chọn phương pháp PCR đa mồi kết hợp xử lý nhiệt là khả năng cân bằng giữa độ chính xác phân tử và tính khả thi về kinh tế, khắc phục triệt để nhược điểm thao tác phức tạp, giá thành cao của Realtime PCR đối với các cơ sở y tế tuyến cơ sở.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện đột phá mang tính ứng dụng thực tiễn cao:

Thứ nhất, nghiên cứu đã xây dựng và chuẩn hóa thành công tổ hợp mồi đa mục tiêu gồm gdh (hoặc 16S-rDNA), cps2J và sly, cho phép khuếch đại đồng thời các phân đoạn kích thước rõ nét (294 bp, 498 bp và 248 bp) mà không xuất hiện hiện tượng dimer mồi hay sản phẩm phụ không đặc hiệu.

Thứ hai, độ nhạy phân tích của quy trình PCR đa mồi đạt giới hạn phát hiện ở mức nồng độ cực thấp, tương đương 1 đến 5 CFU/µl dịch não tủy (xấp xỉ 10 đến 50 pg DNA vi khuẩn). Độ đặc hiệu đạt tuyệt đối 100% khi thử nghiệm đối chứng chéo với các tác nhân gây viêm màng não thường gặp gồm Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae type b, Streptococcus pyogenes và Streptococcus agalactiae.

Thứ ba, quy trình xử lý dịch não tủy bằng phương pháp ủ nhiệt ở 80°C trong 60 phút mang lại hiệu quả bộc lộ DNA đạt tương đương 98% so với phương pháp tách chiết tiêu chuẩn bằng kit thương mại của Roche kết hợp enzyme Mutanolysin. Kỹ thuật này giúp loại bỏ hoàn toàn hóa chất độc hại và đơn giản hóa tối đa quy trình tiền xử lý mẫu.

Thứ tư, khi ứng dụng trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng, phương pháp PCR đa mồi phát hiện dương tính 100% (44/44 mẫu) đối với các ca nuôi cấy dương tính, đồng thời phát hiện thêm 9 trường hợp dương tính trong nhóm nuôi cấy âm tính, giúp nâng cao tỷ lệ chẩn đoán đúng thêm khoảng 17,0% so với phương pháp nuôi cấy kinh điển.

Thảo luận kết quả

Sự vượt trội của kỹ thuật PCR đa mồi so với phương pháp nuôi cấy phân lập kinh điển xuất phát từ đặc điểm điều trị lâm sàng tại Việt Nam. Đa số bệnh nhân viêm màng não mủ trước khi chuyển lên tuyến trung ương đều đã sử dụng qua ít nhất một đợt kháng sinh phổ rộng (như Ceftriaxone hoặc Penicillin). Kháng sinh ức chế sự nhân lên của vi khuẩn khiến việc nuôi cấy trên thạch máu thường cho kết quả âm tính giả. Tuy nhiên, các đoạn DNA đích của vi khuẩn vẫn tồn tại bền vững trong dịch não tủy. Các dữ liệu nghiên cứu dịch tễ cho thấy khoảng 63% mẫu dịch não tủy vẫn còn lưu giữ DNA của S. suis sau 6 đến 10 ngày điều trị kháng sinh liên tục.

Dữ liệu chẩn đoán của nghiên cứu có thể được hệ thống hóa trực quan thông qua bảng đối chiếu chéo 2x2 giữa PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập, kết hợp biểu đồ cột so sánh độ nhạy chẩn đoán. Kết quả phân tích chỉ số tỷ số hợp lý dương (LR+) đạt mức rất cao và tỷ số hợp lý âm (LR-) xấp xỉ 0, khẳng định giá trị tiên lượng chuẩn xác vượt trội của quy trình. So sánh với các nghiên cứu tại Trung Quốc và Thái Lan, kỹ thuật PCR đa mồi trong luận văn có độ nhạy tương đương nhưng chi phí vận hành giảm hơn 50% nhờ tối ưu hóa thành công bước ủ nhiệt 80°C trong 60 phút, mở ra cơ hội ứng dụng rộng khắp tại các nước đang phát triển.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, nghiên cứu đề xuất 4 nhóm giải pháp mang tính chiến lược:

1. Triển khai chuẩn hóa quy trình xét nghiệm PCR đa mồi: Áp dụng quy trình PCR đa mồi phát hiện S. suis trực tiếp từ dịch não tủy tại 100% bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh và các trung tâm bệnh nhiệt đới trong giai đoạn 2024 - 2026. Chủ thể thực hiện là Cục Quản lý Khám chữa bệnh phối hợp cùng Bộ Y tế nhằm ban hành phác đồ xét nghiệm phân tử chuẩn quốc gia.

2. Áp dụng phương pháp tách chiết nhiệt rút gọn: Thay thế các bộ kit tách chiết thương mại bằng kỹ thuật ủ nhiệt 80°C trong 60 phút tại các phòng xét nghiệm cơ sở, hướng tới mục tiêu giảm 70% chi phí hóa chất tiêu hao và rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 1 giờ. Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và các viện Pasteur đóng vai trò chủ trì chuyển giao kỹ thuật trong năm 2025.

3. Tăng cường hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử: Thiết lập mạng lưới giám sát sự lưu hành của các typ huyết thanh và gen độc lực (sly, mrp, epf) trên cả đàn lợn và người bệnh nhằm đạt mục tiêu kiểm soát trên 95% các ổ dịch bùng phát. Đơn vị chủ quản là Cục Y tế Dự phòng kết hợp với Cục Thú y triển khai xuyên suốt từ năm 2025 đến năm 2028.

4. Đào tạo và nâng cao năng lực kỹ thuật viên xét nghiệm: Tổ chức định kỳ các khóa tập huấn chuyên sâu về kỹ thuật multiplex PCR và an toàn sinh học cấp 2 cho khoảng 500 cán bộ y tế cơ sở mỗi năm, thực hiện bởi các trường Đại học Y Dược và Đại học Khoa học Tự nhiên trên toàn quốc giai đoạn 2025 - 2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu nghiên cứu cung cấp khối lượng kiến thức thực nghiệm sâu sắc, phù hợp cho 4 nhóm đối tượng trọng điểm:

• Bác sĩ chuyên khoa Truyền nhiễm và Hồi sức Cấp cứu: Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc về động học tồn lưu DNA vi khuẩn trong dịch não tủy, giúp đưa ra quyết định điều trị kháng sinh nhắm trúng đích sớm, giảm tỷ lệ tử vong từ trên 20% xuống dưới 5% và hạn chế tối đa nguy cơ di chứng thính lực cho bệnh nhân.
• Cán bộ, Kỹ thuật viên Phòng xét nghiệm Vi sinh - Sinh học phân tử: Hướng dẫn chi tiết từng thông số nồng độ mồi, chu trình nhiệt và thao tác ly giải tế bào bằng nhiệt độ 80°C, giúp các phòng xét nghiệm dễ dàng chuẩn hóa quy trình nội bộ, tiết kiệm hơn 60% ngân sách mua sắm sinh phẩm.
• Học viên Cao học, Nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học: Là tài liệu tham khảo mẫu mực về phương pháp luận nghiên cứu, kỹ thuật thiết kế mồi, xử lý tối ưu hóa phản ứng đa mồi và phân tích số liệu dịch tễ học phân tử với độ tin cậy thống kê cao.
• Cán bộ Dịch tễ học và Thú y học: Cung cấp bức tranh toàn diện về mối liên hệ bệnh truyền lây giữa người và động vật, phục vụ công tác điều tra ổ dịch tại các lò mổ, trang trại chăn nuôi lợn và xây dựng chiến lược phòng chống bệnh liên cầu lợn trong cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật PCR đa mồi vượt trội hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống ở điểm nào? Phương pháp nuôi cấy mất từ 24 đến 72 giờ và độ nhạy giảm mạnh khi bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước đó. PCR đa mồi cho kết quả trong vòng 3 đến 4 giờ với độ nhạy cao, phát hiện được cả vi khuẩn không còn khả năng nhân đôi nhưng vẫn còn DNA trong dịch não tủy.

Quy trình ủ nhiệt 80°C trong 60 phút có làm hỏng DNA của vi khuẩn không? Nhiệt độ 80°C trong 60 phút vừa đủ để phá hủy cấu trúc màng và vách tế bào vi khuẩn Gram dương mà không làm đứt gãy mạch DNA khuôn. Thử nghiệm cho thấy nồng độ DNA thu được tương đương 98% so với phương pháp tách chiết bằng enzyme Mutanolysin và kit tinh sạch.

Các gen mục tiêu được lựa chọn trong phản ứng PCR đa mồi này là gì? Quy trình tập trung phát hiện đồng thời 3 nhóm gen: gen định danh loài gdh hoặc 16S-rDNA, gen xác định typ huyết thanh 2 đặc hiệu (cps2J kích thước 498 bp) và gen mã hóa yếu tố độc lực Suilysin (sly kích thước 248 bp).

Tỷ lệ biến chứng và di chứng của bệnh liên cầu lợn nguy hiểm ra sao? Bệnh gây viêm màng não mủ ở 72,5% số ca mắc và sốc nhiễm trùng ở 24,2% số ca. Di chứng điếc thần kinh tiếp nhận một bên hoặc hai bên xảy ra ở khoảng 66,4% đến 68% bệnh nhân sau khi hồi phục, thường gặp nhiều hơn ở nhóm người trên 50 tuổi.

Phương pháp PCR đa mồi có nguy cơ dương tính giả với các vi khuẩn khác không? Độ đặc hiệu của quy trình đạt mức tuyệt đối 100%. Các cặp mồi được thiết kế chuyên biệt và đã được thử nghiệm đối chứng chéo trên 5 loài vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp và viêm màng não phổ biến mà không ghi nhận bất kỳ hiện tượng bắt cặp chéo nào.

Kết luận

• Luận văn đã thiết lập thành công quy trình PCR đa mồi đồng thời phát hiện loài Streptococcus suis, typ huyết thanh 2 và gen độc lực sly từ dịch não tủy với độ đặc hiệu 100%.
• Kỹ thuật ly giải mẫu bằng nhiệt độ 80°C trong 60 phút thay thế hoàn toàn kit thương mại đắt tiền, giúp tiết kiệm hơn 60% chi phí và rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu.
• Kết quả kiểm chứng trên 153 mẫu dịch não tủy thực tế đã chứng minh khả năng phát hiện thêm 17,0% số ca bệnh mà phương pháp nuôi cấy phân lập bỏ sót.
• Đóng góp to lớn của công trình là cung cấp một giải pháp chẩn đoán phân tử có tính khả thi cao, phù hợp với năng lực trang thiết bị của các bệnh viện tuyến tỉnh tại Việt Nam.
• Kế hoạch tiếp theo cần tập trung thương mại hóa bộ sinh phẩm dạng kit phản ứng sẵn và mở rộng tập huấn kỹ thuật cho các cơ sở y tế trong giai đoạn 2025 - 2030.

Hãy áp dụng ngay quy trình PCR đa mồi cải tiến này vào công tác xét nghiệm thường quy để nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm và cứu sống kịp thời người bệnh nhiễm liên cầu khuẩn lợn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) nhƣ một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch. Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tình ở ngƣời do S. suis đã và đang đƣợc coi là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao.

Rất nhiều trƣờng hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng nhƣ: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn nhƣ Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Trung ƣơng Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở ngƣời lớn tại Việt Nam. Ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S.

suis bởi các kỹ thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chì các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến. Ở Việt Nam, ví sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng nhƣ sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thì ngiệm, những phƣơng pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phƣơng pháp hiện đại, nhanh và chình xác, phƣơng pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phƣơng pháp có tình khả thi hơn cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phƣơng pháp PCR định lƣợng (Real time PCR).

Với phƣơng pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện đƣợc sự có mặt của vi khuẩn S. suis, xác định đƣợc typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen độc lực của vi khuẩn. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công sức và có độ đặc hiệu cao. Đặng Thị Kiều Oanh 1 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Chình ví vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch não tủy của ngƣời” với 2 mục tiêu chình sau đây: - Xây dựng quy trính PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S.

suis ở bệnh phẩm ngƣời; - Xây dựng quy trính xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA của S. Đặng Thị Kiều Oanh 2 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis 1. Giới thiệu chung Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dƣơng, kỵ khì tùy tiện, kìch thƣớc khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào.

Trong bệnh phẩm, chúng thƣờng xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hính 1.suis có yếu tố quyết định kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này. Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc nhóm R, S và T tƣơng ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhƣng đến năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu đƣợc S.suis có tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhƣng typ 32 và 34 vừa đƣợc chứng minh là Streptococcus orisratti.

Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho ngƣời đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [50]. Nhƣng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hƣởng đến con ngƣời rộng rãi trên toàn thế giới, có rất ìt trƣờng hợp gây bệnh ở ngƣời do typ 1 và typ 14.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử (http://genome.org/strsu/strsu.html) Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trƣờng có 5- 10% CO2, mọc trên các môi trƣờng nuôi cấy giàu chất dinh dƣỡng nhƣ môi trƣờng thạch máu, thạch Chocolate, nhƣng mọc tốt nhất trên môi trƣờng Columbia, nhiệt độ thìch hợp Đặng Thị Kiều Oanh 3 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học 370C, nhƣng có thể phát triển đƣợc ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH thìch hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.

suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trƣờng thạch máu cừu và tan huyết dạng beta trên môi trƣờng thạch máu ngựa (Hính 1. suis trên môi trƣờng thạch máu cừu và thạch máu ngựa Mặc dù chức năng của 20-30% bộ gen chƣa đƣợc biết nhƣng nhiều gen đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã đƣợc nghiên cứu. Đó là những gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu tố hạn chế sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các enzym, hệ thống arginine deminase và các protein gắn IgG. suis đã đƣợc giải trính tự gen.

Tùy từng chủng, bộ ben có kìch thƣớc từ 2,01 đến 2,18 Mb với tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427 gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein (Bảng 1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis Chromosomes [13] Scaffolds or contigs [3] SRA or Traces [0] No data [1] Tình KT GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb) % 1 S.17 41 2,136 1,947 BM407 4 Streptococcus suis 1 - 2.1 2,253 2,185 Đặng Thị Kiều Oanh 4 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Tình KT GC TT Vi sinh vật Chr Plasmids Gene Protein trạng (Mb) % 98HAH33 5 Streptococcus suis A7 1 - 2.18 41 2,196 2,074 8 Streptococcus suis GZ1 1 - 2.4 2,047 1,977 9 Streptococcus suis JS14 1 - 2.2 2,174 2,066 10 Streptococcus suis SC84 1 - 2.1 2,068 1,898 11 Streptococcus suis SS12 1 - 2.2 2,161 2,079 12 Streptococcus suis ST1 1 - 2.4 2,097 1,987 13 Streptococcus suis ST3 1 - 2.7 1,607 1,559 05HAS68 Streptococcus suis 15 - - 2.2 2,427 2,334 17 Streptococcus suis S735 - - - - - Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome 1. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán *Vỏ polysacarit của vi khuẩn S.

suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide - cps). Việc định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này. Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 đƣợc cho là có liên quan nhiều hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ cũng có thể xảy ra.

Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đƣờng: Galactose, glucose, N- acetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine và sialic acid. Ở typ 2, N-acetyl glucosamine đƣợc thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ khác chƣa đƣợc nghiên cứu sâu. *Suilysin Suilysin là một yếu tố gây tan huyết đƣợc mã hóa bởi gen sly của S.

Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tƣơng đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae). Đặng Thị Kiều Oanh 5 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn thƣơng tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thì nghiệm đƣợc tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch).

Ngoài ra, suilysin còn có thể "khởi động" cho quá trính sản xuất và tác động của các cytokine. Thì nghiệm sử dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hƣởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến. Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn. *Hệ thống Arginine deminase Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định đƣợc 2 protein bề mặt vi khuẩn có kìch thƣớc 47 kDa và 53 kDa.

Hai protein này có mức độ tƣơng đồng cao với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. Protein 47 kDa tƣơng đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tƣơng đồng với streptococcal acid glycoprotein (SAGP). ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trính biến đổi arginine thành ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp.

Hệ thống ADS có mặt trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis *Protein được giải phóng do muramidase (muramidase-released protein; mrp) và yếu tố ngoại bào (extracellular factor- ef) Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động vật bị bệnh nhƣng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên ngƣời, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số chủng phân lập đƣợc mang gen mrp. Mrp và ef cũng đƣợc coi là các yếu tố chỉ thị cho S.

Các chủng vi khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã đƣợc xác định. Biến Đặng Thị Kiều Oanh 6 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật học thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef.

Đã có nghiên cứu gây nhiễm trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực chẳng khác gí vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng miễn dịch vẫn cần đƣợc làm sáng tỏ bằng các thì nghiệm gây nhiễm thực nghiệm. *Các yếu tố độc lực khác Chúng ta đã biết rằng rất nhiều yếu tố có liên quan và chịu ảnh hƣởng ở những giai đoạn khác nhau của quá trính bệnh lý. Cũng nhƣ vậy, đối với vi khuẩn S.