Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Xác Định Vi Khuẩn Bacillus Laterosporus Trong Phân Bón Hữu Cơ

Trong bối cảnh nông nghiệp hiện đại, việc sử dụng phân bón hữu cơ ngày càng trở nên quan trọng để đảm bảo sự… 65 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2023.

• Tác giả: Vũ Thị Như Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Ninh Thị Thảo
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ thực vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Xác Định Vi Khuẩn Bacillus Laterosporus Trong Phân Bón Hữu Cơ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu và yêu cầu
• 1.2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus
• 1.2.2. Lịch sử phát hiện
• 1.2.3. Đặc điểm hình thái
• 1.2.4. Khả năng kháng khuẩn
• 1.2.5. Khả năng gây bệnh cho động vật không xương sống
• 1.2.6. Các công dụng khác
• 1.2.7. Phương pháp nghiên cứu để định danh vi khuẩn
• 1.2.7.1. Phương pháp truyền thống
• 1.2.7.2. Phương pháp hiện đại
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nguyên cứu
• 3.2. Vật liệu thí nghiệm
• 3.3. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu cơ
• 3.3.1.1. Phương pháp làm thuần, giữ giống
• 3.3.2. Nội dung 2: Đánh giá các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus được phân lập từ phân bón hữu cơ
• 3.3.3. Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phương pháp xác định trình tự 16S rRNA và phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
• 4. PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu cơ
• 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ pha loãng mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 4.5. Ảnh hưởng của thời gian xử lý mẫu đến kết quả phân lập vi khuẩn
• 4.6. Đánh giá hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định được phân lập từ phân bón hữu cơ
• 4.6.1. Lựa chọn các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định
• 4.6.2. Đánh giá đặc điểm hình thái các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định
• 4.6.3. Phân tích đặc tính hóa sinh các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định
• 4.6.4. Tổng hợp kết quả khảo sát đặc điểm hóa sinh
• 4.7. Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
• 4.7.1. Kết quả tách chiết DNA
• 4.7.2. Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập bằng phương pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA
• 4.7.3. Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus bằng phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu
• 4.8. Tính toán tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus phân bón hữu cơ
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Bacillus Laterosporus

Trong bối cảnh nông nghiệp hiện đại, việc sử dụng phân bón hữu cơ ngày càng trở nên quan trọng để đảm bảo sự phát triển bền vững. Bacillus Laterosporus là một trong những vi khuẩn có lợi được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất phân bón, nhờ khả năng kháng nấm, kháng khuẩn và thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Nghiên cứu về phương pháp xác định vi khuẩn này trong phân bón hữu cơ là vô cùng cần thiết để kiểm soát chất lượng và đảm bảo hiệu quả của sản phẩm. Các sản phẩm phân bón vi sinh chứa Bacillus Laterosporus đã được thương mại hóa, nhưng việc kiểm tra chất lượng phân bón vẫn còn nhiều thách thức do thiếu các tiêu chuẩn cụ thể. Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng một quy trình phân tích vi sinh vật hiệu quả, giúp định danh Bacillus Laterosporus một cách chính xác và tin cậy.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Bacillus Laterosporus

Bacillus Laterosporus, trước đây còn được gọi là Brevibacillus laterosporus, là một loài vi khuẩn hiếu khí có khả năng hình thành bào tử. Đặc điểm nổi bật của vi khuẩn này là khả năng tạo ra một bao thể bào tử dạng lamellar hình chiếc xuồng, tiếp giáp với bào tử. Một số chủng còn tạo ra các thể vùi tinh thể với hình dạng và kích thước khác nhau, được giải phóng khi túi bào tử phân giải. Bacillus Laterosporus có tiềm năng lớn trong việc kiểm soát sinh học, thể hiện hoạt động sinh học rộng hơn so với Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus.

1.2. Lịch Sử Phát Hiện và Ứng Dụng

Mối liên hệ giữa Bacillus Laterosporus và côn trùng được ghi nhận lần đầu vào đầu thế kỷ 20. Tuy nhiên, vi khuẩn này được đặt tên và mô tả bởi Laubach, người đã phân lập nó từ nước ngọt. Bacillus Laterosporus được tìm thấy trong nhiều môi trường khác nhau như đất, nước ngọt, nước biển, côn trùng, bề mặt lá, phân hữu cơ, sữa, phô mai, mật ong và nước thải nhà máy gelatin. Năm 1980, Donnell phát hiện ra vi khuẩn này trong đất ở Iceland, nơi nó giúp cây trồng phát triển mạnh mẽ mà không cần phân bón.

II. Vấn Đề Thách Thức Trong Xác Định Bacillus

Mặc dù Bacillus Laterosporus mang lại nhiều lợi ích trong nông nghiệp, việc xác định chính xác và định lượng chúng trong phân bón hữu cơ vẫn còn nhiều thách thức. Các tiêu chuẩn cơ sở hiện tại ở Việt Nam chưa đủ khả năng để định tính hoặc định lượng Bacillus Laterosporus một cách hiệu quả. Điều này gây khó khăn cho việc kiểm tra chất lượng phân bón và đảm bảo hiệu quả sử dụng. Việc sử dụng các phương pháp truyền thống để phân lập Bacillus Laterosporus đòi hỏi thời gian và kỹ thuật phức tạp, trong khi các phương pháp hiện đại như PCR cần thiết bị và chuyên môn cao. Do đó, cần có một phương pháp phân tích định lượng vi khuẩn đơn giản, nhanh chóng và chính xác để đáp ứng nhu cầu thực tiễn.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Truyền Thống

Các phương pháp truyền thống để xác định vi khuẩn thường dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh hóa. Tuy nhiên, Bacillus Laterosporus có nhiều đặc điểm tương đồng với các loài Bacillus khác, gây khó khăn trong việc phân biệt. Việc nuôi cấy và phân lập vi khuẩn đòi hỏi môi trường và điều kiện đặc biệt, tốn nhiều thời gian và công sức. Ngoài ra, các phương pháp này thường không đủ nhạy để phân tích định tính vi khuẩn với số lượng nhỏ trong mẫu phân bón.

2.2. Yêu Cầu Về Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Hiện Đại

Để khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, cần áp dụng các kỹ thuật phân tích vi sinh vật hiện đại như PCR Bacillus Laterosporus và giải trình tự gen 16S rRNA. Các phương pháp này cho phép định danh Bacillus Laterosporus ở cấp độ phân tử, dựa trên các đoạn gen đặc hiệu. Tuy nhiên, việc triển khai các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất chuyên dụng và đội ngũ kỹ thuật viên có trình độ cao. Chi phí thực hiện cũng là một yếu tố cần cân nhắc.

2.3. Sự Cần Thiết Của Tiêu Chuẩn Bacillus Laterosporus

Việc thiếu các tiêu chuẩn Bacillus Laterosporus trong phân bón gây khó khăn cho các nhà sản xuất và người tiêu dùng. Cần có các tiêu chuẩn cụ thể về hàm lượng Bacillus Laterosporus trong phân bón vi sinh để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Các tiêu chuẩn này cần dựa trên các phương pháp phân tích định lượng vi khuẩn chính xác và tin cậy, được công nhận rộng rãi trong ngành nông nghiệp.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Xác Định Bacillus Hiệu Quả

Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng một phương pháp kết hợp giữa các kỹ thuật truyền thống và hiện đại để xác định vi khuẩn Bacillus Laterosporus trong phân bón hữu cơ. Quy trình bao gồm các bước: phân lập Bacillus Laterosporus từ mẫu phân bón, đánh giá đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng phân lập, và định danh Bacillus Laterosporus bằng phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu. Phương pháp này nhằm mục đích cung cấp một quy trình phân tích vi sinh vật toàn diện, có độ chính xác cao và dễ dàng áp dụng trong thực tế.

3.1. Phân Lập Bacillus Laterosporus Từ Phân Bón

Quá trình phân lập Bacillus Laterosporus bắt đầu bằng việc lấy mẫu phân bón hữu cơ và tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau. Mẫu pha loãng được nuôi cấy trên môi trường LB (Luria Bertani Broth) để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển. Sau thời gian nuôi cấy, các khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của Bacillus Laterosporus sẽ được chọn lọc và cấy chuyển để thu được các chủng thuần khiết.

3.2. Đánh Giá Đặc Điểm Hình Thái và Sinh Hóa

Các chủng Bacillus Laterosporus phân lập được sẽ được đánh giá về đặc điểm hình thái như hình dạng khuẩn lạc, màu sắc, kích thước tế bào và khả năng hình thành bào tử. Đồng thời, các đặc tính sinh hóa như khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau, khả năng sinh enzyme và phản ứng với các chất chỉ thị cũng sẽ được kiểm tra. Các kết quả này sẽ giúp xác định các chủng Bacillus Laterosporus giả định.

3.3. Định Danh Bacillus Laterosporus Bằng PCR

Để xác định chính xác các chủng Bacillus Laterosporus, phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu sẽ được áp dụng. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các đoạn gen đặc trưng cho Bacillus Laterosporus, cho phép khuếch đại đoạn gen này trong quá trình PCR. Kết quả PCR sẽ cho biết sự hiện diện của Bacillus Laterosporus trong mẫu, đồng thời giúp phân biệt chúng với các loài Bacillus khác.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn và Kết Quả Nghiên Cứu

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng một phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus Laterosporus trong phân bón hữu cơ bằng cách kết hợp các kỹ thuật phân lập, đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa và PCR. Kết quả cho thấy, có thể sử dụng các phương pháp này để phân tích định tính vi khuẩn và phân tích định lượng vi khuẩn một cách hiệu quả. Phương pháp này có thể được áp dụng trong các phòng thí nghiệm kiểm tra chất lượng phân bón để đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn và mang lại hiệu quả cao cho người sử dụng.

4.1. Kết Quả Phân Lập và Đánh Giá Đặc Điểm

Nghiên cứu đã phân lập được nhiều chủng vi khuẩn từ các mẫu phân bón hữu cơ khác nhau. Sau khi đánh giá đặc điểm hình thái và sinh hóa, một số chủng đã được xác định là Bacillus Laterosporus giả định. Các chủng này có khuẩn lạc tròn, màu be hoặc trắng, viền ria, nhẵn, phẳng, tế bào Gram dương, trực khuẩn, kết quả âm tính với phản ứng MR-VP, không có khả năng biến dưỡng citrate và có khả năng sinh enzyme ngoại bào protease và amylase.

4.2. Kết Quả Định Danh Bằng Phương Pháp PCR

Phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu đã xác nhận sự hiện diện của gen cpbB mã hóa cho protein của phức hợp SC-CSPB trên vi khuẩn Bacillus Laterosporus ở một số chủng phân lập. Điều này chứng tỏ có thể sử dụng gen cpbB làm dấu hiệu nhận diện vi khuẩn Bacillus Laterosporus ở mức độ phân tử. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp kiểm tra chất lượng phân bón nhanh chóng và chính xác.

4.3. Ứng Dụng Trong Kiểm Tra Chất Lượng Phân Bón

Phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus Laterosporus được xây dựng trong nghiên cứu này có thể được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm tra chất lượng phân bón. Quy trình này giúp đảm bảo rằng các sản phẩm phân bón vi sinh chứa đủ hàm lượng Bacillus Laterosporus để mang lại hiệu quả mong muốn. Điều này góp phần nâng cao chất lượng nông sản và bảo vệ môi trường.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng và kiểm chứng một phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus Laterosporus trong phân bón hữu cơ. Phương pháp này kết hợp các kỹ thuật phân lập, đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa và PCR để đảm bảo độ chính xác và tin cậy. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm tra chất lượng phân bón và phát triển các sản phẩm phân bón vi sinh hiệu quả. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng phạm vi ứng dụng của phương pháp này.

5.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã xây dựng một quy trình phân tích vi sinh vật toàn diện để xác định vi khuẩn Bacillus Laterosporus trong phân bón hữu cơ. Quy trình này bao gồm các bước: phân lập Bacillus Laterosporus, đánh giá đặc điểm hình thái và sinh hóa, và định danh Bacillus Laterosporus bằng phương pháp PCR. Kết quả cho thấy, có thể sử dụng các phương pháp này để phân tích định tính vi khuẩn và phân tích định lượng vi khuẩn một cách hiệu quả.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình xác định vi khuẩn Bacillus Laterosporus và mở rộng phạm vi ứng dụng của phương pháp này. Cần nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của Bacillus Laterosporus trong phân bón hữu cơ. Ngoài ra, cần phát triển các phương pháp phân tích định lượng vi khuẩn nhanh chóng và chính xác hơn để đáp ứng nhu cầu thực tiễn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong canh tác nông nghiệp, việc lạm dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã dẫn đến tình trạng suy thoái, bạc màu đất canh tác, gây ô nhiễm môi trường đất, môi trường nước và để lại dư lượng độc hại trên nông sản. Trước yêu cầu phát triển nền nông nghiệp bền vững, các chế phẩm phân bón hữu cơ sinh học chứa vi sinh vật có ích ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Trong số các loài vi sinh vật hữu ích, Bacillus laterosporus (tên gọi trước đây là Brevibacillus laterosporus) là vi khuẩn hình thành nội bào tử có hoạt tính sinh học đa dạng: khả năng sinh enzyme ngoại bào, tiết kháng sinh ức chế nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật, phân giải chất hữu cơ và kích thích sinh trưởng cây trồng.

Tại thị trường Việt Nam, nhiều sản phẩm phân bón hữu cơ thương mại đã công bố thành phần chứa vi khuẩn Bacillus laterosporus (như phân bón "Nấm đối kháng Trichoderma", Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun). Tuy nhiên, hệ thống tiêu chuẩn cơ sở và tiêu chuẩn kỹ thuật hiện hành ở nước ta chưa có quy trình chuẩn hóa để định tính hoặc định lượng loài vi khuẩn này trong các chế phẩm sinh học phức hợp. Việc nghiên cứu xây dựng một quy trình đồng bộ từ phân lập, kiểm tra đặc tính sinh hóa đến định danh phân tử nhằm phát hiện và định lượng Bacillus laterosporus là vấn đề khoa học và thực tiễn cấp thiết.

Khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể như sau:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ.
2. Các nhiệm vụ nghiên cứu:
   • Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus có trong phân bón hữu cơ thông qua khảo sát các điều kiện xử lý mẫu thích hợp.
   • Đánh giá đặc điểm hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định phân lập được.
   • Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định bằng phương pháp sinh học phân tử: giải trình tự gen 16S rRNA và kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Bacillus laterosporus hiện diện trong mẫu phân bón hữu cơ thương phẩm "Nấm đối kháng Trichoderma" do Công ty TNHH Tân Nông Phát sản xuất (sản phẩm công bố phối trộn nhiều loài vi sinh vật gồm các chủng Trichoderma và các loài Bacillus).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 6 năm 2022 đến tháng 12 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài dựa trên các nghiên cứu phân loại học vi sinh vật của Laubach (1916), Ghazanchyan & cs. (2018) và Ruiu & cs. (2016, 2017). Bacillus laterosporus là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, có khả năng hình thành nội bào tử hình bầu dục nằm lệch tâm làm phồng tế bào. Điểm đặc trưng hình thái học độc nhất của loài này là sự hình thành thể ký sinh hình xuồng (Canoe-Shaped Parasporal Body - CSPB) gắn chặt vào vỏ bào tử (phức hợp SC-CSPB). Nghiên cứu phân tử từ sáng chế quốc tế (Patent WO 2016/135766 A1) chỉ ra rằng phức hợp SC-CSPB chứa các protein đặc hiệu gồm CpbA, CpbB, CHRD và ExsC. Trong đó, gen cpbB (mã hóa protein liên kết kích thước khoảng 14 kDa hoặc phân đoạn 42 kDa theo phân tích SDS-PAGE) là chỉ thị phân tử đặc thù của loài Bacillus laterosporus, không xuất hiện ở các loài vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được xây dựng gồm các kỹ thuật:

• Phương pháp xử lý nhiệt và phân lập vi sinh vật sinh nội bào tử: Sử dụng dung dịch sinh lý NaCl 0,85% để hòa tan mẫu, gia nhiệt ở các mức nhiệt độ và thời gian khác nhau nhằm tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dưỡng và vi sinh vật không sinh bào tử, nuôi cấy gạt đĩa trên môi trường thạch Luria Bertani (LB). Số lượng khuẩn lạc được đối chiếu theo giới hạn đếm quy định tại tiêu chuẩn TCVN 6404:2016 (10 – 300 khuẩn lạc/đĩa).
• Phương pháp hình thái và hóa sinh: Quan sát hình thái khuẩn lạc; nhuộm Gram; phản ứng Methyl Red (MR) phát hiện khả năng tạo acid bền từ glucose; phản ứng Voges-Proskauer (VP) phát hiện acetoin; thử nghiệm biến dưỡng citrate trên môi trường thạch Simmons Citrate Agar (SCA); đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào (protease trên thạch gelatin 1% nhuộm Aminoblack 10B; amylase trên thạch tinh bột 1% nhuộm dung dịch Lugol 1%).
• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số theo quy trình CTAB cải tiến (bổ sung 2-mercaptoethanol, SDS 20%, Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 và kết tủa bằng ethanol lạnh).
  • Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng cặp mồi phổ quát 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), chu kỳ luân nhiệt với nhiệt độ gắn mồi 53°C, gửi giải trình tự tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc) và phân tích so sánh bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank.
  • Phản ứng PCR phát hiện gen đặc hiệu loài cpbB (sản phẩm 600 bp) sử dụng cặp mồi CPBB_F (5'-CTA TTT ACA CGG GCG TAC G-3') và CPBB_R (5'-CAT TCT TTT GAA AGTAGTAAG AAG-3'), nhiệt độ bắt mồi 48°C, sử dụng mẫu DNA của vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm đối chứng âm và mẫu không DNA làm đối chứng trắng.

Nguồn dữ liệu: Toàn bộ số liệu thu thập từ các thí nghiệm lặp lại 3 lần tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực vật, xử lý thống kê tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả trình bày tính cấp thiết của việc thay thế hóa chất nông nghiệp bằng các chế phẩm sinh học an toàn, phân tích tiềm năng của Bacillus laterosporus trong kiểm soát sinh học nấm bệnh và kích thích cây trồng sinh trưởng. Nội dung khẳng định khoảng trống thực tiễn tại Việt Nam: các sản phẩm phân bón hữu cơ đã thương mại hóa chứa chủng này nhưng chưa có phương pháp phân tích, kiểm nghiệm tiêu chuẩn. Trên cơ sở đó, tác giả xác định mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện, định danh và định lượng loài vi khuẩn này.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp hệ thống các nghiên cứu trong và ngoài nước về:

• Lịch sử phát hiện từ các công trình của White (1912), Laubach (1916), Donnell (1980) cùng sự phân bố của vi khuẩn trong nhiều hệ sinh thái (đất, nước ngọt, bề mặt lá, phân hữu cơ).
• Cấu trúc siêu vi thể của thể ký sinh hình xuồng (CSPB), các protein cấu trúc đặc thù (ExsC, CHRD, CpbA, CpbB) và mã số GenBank tương ứng (KY124461 đến KY124464).
• Các hoạt tính sinh học: kháng nấm gây bệnh thực vật (Fusarium oxysporum, Colletotrichum gloeosporioides), gây độc động vật không xương sống gây hại, phân hủy chất ô nhiễm công nghiệp.
• So sánh ưu nhược điểm giữa phương pháp định danh truyền thống (hình thái, thử nghiệm sinh hóa) và phương pháp hiện đại (giải trình tự 16S rRNA, PCR khuếch đại gen đặc hiệu loài).

Phần 3: Vật liệu và phương pháp

Nội dung chi tiết hóa quy trình thí nghiệm:

• Hóa chất, môi trường nuôi cấy (LB, MR-VP Broth, SCA, thạch thử hoạt tính enzyme, hệ đệm phosphate 0,1 M pH 7,0).
• Thiết kế 4 thí nghiệm khảo sát phân lập: nồng độ pha loãng ($10^{-2}$ đến $10^{-8}$), tỷ lệ mẫu ban đầu (1:9 đến 1:49 w/v), nhiệt độ xử lý nhiệt (nhiệt độ phòng, 60°C, 80°C, 90°C, 100°C trong 5 phút), thời gian xử lý nhiệt ở 80°C (3, 5, 7, 10 phút).
• Quy trình chuẩn bị tiêu bản nhuộm Gram và 5 phép thử hóa sinh.
• Các bước tách chiết DNA bằng CTAB, chương trình luân nhiệt phản ứng PCR cho gen 16S rRNA và gen cpbB, phương pháp điện di trên gel agarose 1%.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả tập trung trình bày số liệu khảo sát và các phân tích định danh:

• Tối ưu hóa điều kiện phân lập: Xác định tỷ lệ mẫu 1:9 (w/v), xử lý sốc nhiệt ở 80°C trong 5 phút và độ pha loãng $10^{-7}, 10^{-8}$ là điều kiện tối ưu để thu nhận khuẩn lạc đơn lẻ, thỏa mãn TCVN 6404:2016.
• Phân lập và sàng lọc 20 mẫu khuẩn lạc giả định (ký hiệu Q1 đến Q20): Tất cả đều là trực khuẩn Gram dương. Trong đó, 12 mẫu mang hình thái khuẩn lạc tròn, phẳng, viền ria, màu be hoặc trắng ngà.
• Phân tích sinh hóa 20 mẫu: 11 mẫu MR(+), 9 mẫu MR(-); 4 mẫu VP(+), 16 mẫu VP(-); 7 mẫu biến dưỡng citrate(+), 13 mẫu citrate(-); 12 mẫu sinh protease; các mẫu thử nghiệm sinh amylase. Tổng hợp cho thấy 3 mẫu Q2, Q6, Q11 đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn sinh hóa của B. laterosporus (MR âm tính, VP âm tính, Citrate âm tính, Protease dương tính, Amylase dương tính).
• Định danh phân tử: Mẫu Q11 giải trình tự 16S rRNA cho thấy độ tương đồng cao với chi Bacillus. Thử nghiệm PCR với cặp mồi CPBB_F/CPBB_R trên cả 3 mẫu Q2, Q6, Q11 đều khuếch đại phân đoạn gen cpbB đặc hiệu 600 bp, trong khi mẫu đối chứng âm Bacillus thuringiensis không xuất hiện băng vạch.
• Tính toán mật độ: Xác định mật độ tế bào Bacillus laterosporus có trong mẫu phân bón hữu cơ thương phẩm.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các thông số tối ưu của quy trình phân lập, khẳng định sự phối hợp giữa đặc điểm hình thái, sinh hóa và chỉ thị phân tử gen cpbB cho phép định danh chính xác vi khuẩn; kiến nghị tiếp tục ứng dụng quy trình trên nhiều dạng phân bón hữu cơ khác nhau trên thị trường.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xác lập các thông số định lượng cụ thể trong quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu cơ:

Thông số khảo sát	Dải giá trị thử nghiệm	Kết quả số lượng khuẩn lạc TB/đĩa	Điều kiện tối ưu được lựa chọn
Nồng độ pha loãng	$10^{-2}$ đến $10^{-8}$	$10^{-2}$: Không đếm được $10^{-3}$: 430,67 ± 8,39 $10^{-4}$: 379,33 ± 22,74 $10^{-5}$: 341,00 ± 18,33 $10^{-6}$: 248,33 ± 23,97 $10^{-7}$: 72,00 ± 14,80 $10^{-8}$: 53,67 ± 12,22	Độ pha loãng $10^{-7}$ và $10^{-8}$ (phù hợp khoảng 10-300 khuẩn lạc của TCVN 6404:2016)
Tỷ lệ hòa tan mẫu (w/v trong NaCl 0,85%)	1:9 đến 1:49	$10^{-7}$: 84,66 ± 9,60 ($1:9$); 35,66 ± 2,51 ($1:19$); 19,66 ± 1,52 ($1:29$); 10,00 ± 3,60 ($1:39$); 1,33 ± 1,52 ($1:49$) $10^{-8}$: 49,66 ± 13,42 ($1:9$); 22,00 ± 3,60 ($1:19$); 11,66 ± 2,08 ($1:29$); 7,33 ± 2,08 ($1:39$); 1,00 ± 1,00 ($1:49$)	Tỷ lệ 1:9 (w/v)
Nhiệt độ xử lý mẫu (trong 5 phút)	Phòng, 60°C, 80°C, 90°C, 100°C	Nhiệt độ phòng: >500 60°C: 426 ± 13,08 ($10^{-7}$); 369 ± 18,03 ($10^{-8}$) 80°C: 197 ± 7,00 ($10^{-7}$); 101,67 ± 13,50 ($10^{-8}$) 90°C: 71,67 ± 3,79 ($10^{-7}$); 32,00 ± 7,00 ($10^{-8}$) 100°C: 26,00 ± 3,61 ($10^{-7}$); 7,67 ± 3,06 ($10^{-8}$)	Nhiệt độ 80°C (loại bỏ triệt để vi khuẩn không sinh bào tử)
Thời gian xử lý ở 80°C	3, 5, 7, 10 phút	3 phút: 295,00 ± 21,38 ($10^{-7}$) 5 phút: 137,67 ± 34,27 ($10^{-7}$) 7 phút: 53,00 ± 7,00 ($10^{-7}$) 10 phút: 15,00 ± 5,00 ($10^{-7}$)	Thời gian 5 phút

Kết quả sàng lọc và định danh chủng:

• Từ 20 mẫu vi khuẩn giả định tuyển chọn ban đầu, đề tài đã xác định được 3 chủng (Q2, Q6, Q11) mang các đặc điểm sinh học trùng khớp hoàn toàn với mô tả chuẩn của Bacillus laterosporus: khuẩn lạc tròn, phẳng, viền ria, màu be hoặc trắng ngà; tế bào trực khuẩn Gram dương; phản ứng MR âm tính; phản ứng VP âm tính; không sử dụng citrate; sinh enzyme ngoại bào protease và amylase mạnh.
• Phản ứng PCR khuếch đại thành công phân đoạn gen đặc hiệu cpbB kích thước 600 bp trên cả 3 mẫu Q2, Q6 và Q11. Độ đặc hiệu được kiểm chứng khi đối chứng âm (Bacillus thuringiensis) và đối chứng trắng hoàn toàn không xuất hiện vạch khuếch đại.

Đóng góp của khóa luận:

• Tác giả đã thiết lập thành công một quy trình hoàn chỉnh, kết hợp có hệ thống giữa phương pháp vi sinh truyền thống (xử lý nhiệt chọn lọc, hình thái, hóa sinh) và kỹ thuật sinh học phân tử (PCR mồi đặc hiệu gen cpbB) để định danh chính xác loài Bacillus laterosporus.
• Cung cấp cơ sở thực nghiệm để giải quyết sự thiếu hụt phương pháp kiểm tra vi sinh vật này trong các tiêu chuẩn cơ sở hiện nay tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

• Nghiên cứu mới chỉ tiến hành giải trình tự gen 16S rRNA đại diện trên một chủng vi khuẩn (chủng Q11) do giới hạn về nguồn lực, chưa thực hiện giải trình tự trên toàn bộ các chủng phân lập được.
• Mẫu phân bón khảo sát thực tế mới dừng lại ở một sản phẩm thương phẩm duy nhất là "Nấm đối kháng Trichoderma" của Công ty TNHH Tân Nông Phát, chưa mở rộng đánh giá độ ổn định của phương pháp trên nhiều nền cơ chất phân bón hữu cơ có thành phần phụ gia khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Thử nghiệm và hoàn thiện quy trình kiểm nghiệm trên các chế phẩm phân bón vi sinh và phân bón hữu cơ sinh học khác đang lưu thông trên thị trường (như Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun).
• Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR (qPCR) dựa trên chỉ thị gen cpbB nhằm trực tiếp định lượng số lượng bản sao tế bào vi khuẩn trong mẫu mà không cần qua bước nuôi cấy đếm khuẩn lạc kéo dài.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Bảo vệ thực vật và Khoa học đất đang thực hiện các đề tài về phân lập, định danh vi khuẩn chi Bacillus sinh nội bào tử.
• Các cán bộ kiểm nghiệm chất lượng vi sinh tại các trung tâm phân tích, phòng kiểm nghiệm phân bón và chế phẩm sinh học phục vụ công tác quản lý chất lượng phân bón hữu cơ.
• Các nội dung có giá trị tham khảo cao gồm:
  • Bảng thông số kỹ thuật tối ưu hóa xử lý mẫu phân bón (nhiệt độ 80°C trong 5 phút, độ pha loãng $10^{-7}$ đến $10^{-8}$).
  • Quy trình và kết quả đối sánh các phản ứng sinh hóa đặc trưng (MR, VP, Simmons Citrate, Protease, Amylase).
  • Trình tự cặp mồi CPBB_F / CPBB_R và chu trình nhiệt PCR nhân gen cpbB (600 bp) dùng làm công cụ nhận diện phân tử đặc hiệu loài.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu cần xử lý mẫu phân bón ở 80°C trong 5 phút trước khi tiến hành phân lập?
Trong phân bón hữu cơ chứa hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm khác nhau. Bacillus laterosporus là vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử chịu nhiệt. Việc xử lý mẫu ở nhiệt độ 80°C trong thời gian 5 phút có tác dụng tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật tạp nhiễm không sinh bào tử, tạo điều kiện thuận lợi để nội bào tử B. laterosporus nảy mầm và phát triển chiếm ưu thế trên đĩa thạch LB.

2. Vì sao phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA không đủ để định danh chính xác loài Bacillus laterosporus?
Trình tự gen 16S rRNA là gen chỉ thị phổ biến ở vi khuẩn nhưng có độ tương đồng nucleotide rất cao giữa các loài trong cùng chi Bacillus. Kết quả phân tích BLAST mẫu Q11 cho thấy mức độ đồng nhất cao với nhiều loài Bacillus khác nhau, do đó không thể phân biệt tuyệt đối ở cấp độ loài. Do đó, nghiên cứu bắt buộc phải sử dụng thêm kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen cpbB (gen mã hóa protein thể ký sinh CSPB chỉ có ở B. laterosporus) để khẳng định loài.

3. Ba mẫu vi khuẩn Q2, Q6, Q11 có những đặc điểm hình thái và sinh hóa cụ thể nào?
Ba mẫu Q2, Q6, Q11 đều có khuẩn lạc dạng tròn, bề mặt phẳng, viền ria, màu be hoặc trắng ngà; tế bào dạng trực khuẩn, bắt màu Gram dương; phản ứng Methyl Red âm tính (dịch màu vàng); phản ứng Voges-Proskauer âm tính (không tạo phức màu đỏ); không có khả năng sử dụng citrate trên môi trường SCA (môi trường giữ màu xanh lục); có khả năng sinh enzyme ngoại bào protease (tạo vòng phân giải gelatin rõ nét) và enzyme amylase.

4. Cặp mồi đặc hiệu nào được sử dụng để nhận diện Bacillus laterosporus ở cấp độ phân tử và kích thước sản phẩm PCR là bao nhiêu?
Nghiên cứu sử dụng cặp mồi CPBB_F (5'-CTA TTT ACA CGG GCG TAC G-3') và CPBB_R (5'-CAT TCT TTT GAA AGTAGTAAG AAG-3') với nhiệt độ gắn mồi là 48°C để khuếch đại đoạn gen cpbB. Kích thước sản phẩm khuếch đại PCR đặc hiệu là 600 bp.

5. Mẫu vi sinh vật nào được tác giả sử dụng làm đối chứng âm trong phản ứng PCR mồi đặc hiệu?
Tác giả sử dụng DNA khuôn của loài vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm đối chứng âm và ống phản ứng không chứa DNA làm đối chứng trắng. Kết quả điện di gel agarose ghi nhận băng vạch 600 bp chỉ xuất hiện ở các mẫu B. laterosporus (Q2, Q6, Q11) và hoàn toàn vắng mặt ở mẫu Bacillus thuringiensis cũng như mẫu đối chứng trắng.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Vũ Thị Như Quỳnh đã hoàn thiện quy trình thực nghiệm xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ thông qua điều kiện phân lập tối ưu (tỷ lệ mẫu 1:9 w/v, xử lý nhiệt 80°C trong 5 phút, độ pha loãng $10^{-7} - 10^{-8}$). Công trình đã sàng lọc và xác định được 3 chủng vi khuẩn (Q2, Q6, Q11) đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn hình thái, đặc tính hóa sinh đặc trưng của loài. Sự kết hợp giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật PCR mồi đặc hiệu gen cpbB (600 bp) đem lại độ chính xác cao, tạo tiền đề khoa học cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vi sinh vật trong phân bón hữu cơ tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón đóng vai trò quan trọng quyết định cả về chất lượng và sản lượng thu hoạch. Hiện nay có rất nhiều dạng phân bón khác nhau đã được sản xuất sử dụng trong nông nghiệp như: phân hoá học đa lượng hoặc vi lượng: phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh. Trên thế giới cũng như ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp cho nông dân biết chọn lựa những loại phân có ích nhất và cách sử dụng phân như: bón phân vào thời điểm nào và liều lượng bao nhiêu là có hiệu quả cao nhất. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nước ta hiện nay chủ yếu sử dụng phân bón hóa học trong canh tác và sản xuất.

Do sử dụng không đúng cách, lạm dụng các loại phân bón và thuốc trừ sâu hóa học làm tăng dư lượng các chất hóa học gây ô nhiễm môi trường đất, môi trường nước và ảnh hưởng đến sinh vật cũng như con người đồng thời làm đất canh tác bị bạc màu nhanh chóng. Dưới tác động của việc đẩy mạnh công nghiệp hóa hiện đại hóa đất nước góp phần làm diện tích đất nông nghiệp ngày một giảm đi. Chính vì vậy để tăng năng suất, sản lượng cây trồng đồng thời phải đảm bảo môi trường phát triển bền vững là một vấn đề cấp thiết hiện nay. Do đó, việc tìm ra giải pháp thay thế thân thiện sinh học là yêu cầu cấp thiết.

Phát triển phân bón sinh học có hiệu quả, phân hủy sinh học và thân thiện với môi trường là một hướng đi phù hợp. Xu hướng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học để thay thế dần thuốc trừ sâu hóa học đang ngày càng được mở rộng. Lợi ích của việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học trong các chương trình nông nghiệp và sức khỏe cộng đồng là rất lớn, đặc biệt không để lại dư lượng trên các nông sản, vấn đề gây lo ngại cho người tiêu dùng đặc biệt là đối với các sản phẩm rau quả. Bacillus laterosporus là một trong những loài vi khuẩn được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng để cho ra những chế phẩm sinh học đặc hiệu tốt cho môi trường.

Đã có khá nhiều sản phẩm phân bón hữu cơ có chứa vi khuẩn Bacillus laterosporus được thương mại trên thị trường Việt Nam như phân bón hữu cơ “Nấm đối kháng Trichoderma”, Kaito Nano Hữu Cơ, Bio Sun. Tuy 1 nhiên, các tiêu chuẩn cơ sở đã được thiết lập ở nước ta không thể định tính hoặc định lượng Bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học. Việc nghiên cứu thiết lập phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn trong mẫu chế phẩm vi sinh ở điều kiện Việt Nam là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Xuất phát từ thực tiễn đó, từ xu hướng nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nước, đề tài nghiên cứu nhằm phát triển phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ.

Mục tiêu và yêu cầu 1. Mục tiêu Xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng vi khuẩn Bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ. Yêu cầu - Phân lập được vi khuẩn Bacillus laterosporus có trong phân bón hữu cơ. - Đánh giá được đặc điểm hình thái và sinh hóa của các mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định phân lập từ phân bón hữu cơ.

- Định danh được vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus laterosporus Bacillus laterosporus trước đây được gọi là Brevibacillus laterosporus, là một loại vi khuẩn hình thành bào tử hiếu khí được đặc trưng bởi khả năng tạo ra một bao thể bào tử dạng lamellar hình chiếc xuồng tiếp giáp với bào tử. Một số chủng tạo ra các thể vùi tinh thể có hình dạng và kích cỡ khác nhau, chúng được giải phóng riêng biệt khỏi bào tử trong quá trình phân giải túi bào tử.

Bacillus laterosporus có tiềm năng được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học, so với các chủng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus thì Bacillus laterosporus thể hiện hoạt động sinh học rất rộng (Miljkovic & cs. Lịch sử phát hiện Mối quan hệ của Bacillus laterosporus và côn trùng được ghi nhận đầu tiên vào đầu thế kỉ 20 bởi White (1912), khi ông tiến hành nghiên cứu về vi khuẩn của ong mật bị ảnh hưởng bởi loài ong mật ở châu Âu. Trong số vi khuẩn gây bệnh phân lập được, White đã tìm ra được loài vi khuẩn mới được đặt tên là Bacillus orpheus White. Tuy nhiên, các mô tả chi tiết về vi khuẩn này được đưa ra vào năm 1917 bởi McCray, người đã phân lập các vi khuẩn sinh bào tử khác nhau từ ong (Roy & cs.

Tuy nhiên trên thực tế, vi khuẩn Bacillus laterosporus được đặt tên và mô tả bởi Laubach, người đã phân lập vi khuẩn này từ nước ngọt (Laubach, 1916). Do sự tương đồng của hai chủng phân lập nên tên thứ hai được ưu tiên sử dụng hơn và dùng để chỉ cho loài vi khuẩn này (Smith, 1952). Vào năm 1980 sau khi Donnell đến thăm Iceland ông đã phát hiện ra vi khuẩn này tồn tại ở trong đất nhờ sự phát triển mạnh mẽ của cây trồng mà không cần phân bón. Bacillus laterosporus còn được phân lập được từ nhiều loại nguồn khác nhau như đất (Oliveira & cs., 2004), đá quý (Khan, 2001), nước ngọt (Laubach, 1916), nước biển (Suslova & cs., 2012), côn trùng (White, 1912), bề mặt lá (Roy & cs., 2006), phân hữu cơ (Adegunloye & cs., 2007), sữa (Varadaraj & cs., 1993), phô mai (Román-Blanco & cs., 1999), mật ong (Iurlina, 2005), thực phẩm giàu tinh bột (Fangio, 2010), nước thải nhà máy gelatin (Sharma & cs.

Đặc điểm hình thái Bacillus laterosporus là một loại vi khuẩn hình que, hình thành nội bào tử, có đặc điểm hình thái là tạo ra một cơ thể ký sinh hình xuồng (CSPB) điển hình gắn chặt vào bên trong túi bào tử. Bacillus laterosporus hình thành khuẩn lạc phẳng, nhẵn (trơn), màu trắng hoặc màu be với rìa hình thoi (Ghazanchyan & cs. Bacillus laterosporus là vi khuẩn Gram dương, nội bào tử hình bầu dục làm phồng tế bào, xếp ở hai bên, kích thước ô [µm]: 0,6-0,9 x 1,2 - 4,0. Tính cơ động của vi khuẩn di chuyển bằng Flagella, là vi khuẩn hiếu khí có chế độ dinh dưỡng là hóa dưỡng.

Bằng cách kiểm tra đồng thời độ phì nhiêu của đất và độ hoàn hảo của thảm thực vật địa phương, các chuyên gia đưa ra kết luận rằng một chủng nhất định của các loài Laterosporus hoặc Bacillus laterosporus là hợp lý với điều kiện tối ưu cho hệ thực vật địa phương phát triển mạnh. Vi khuẩn này có thể tiết ra rất nhiều chitinase, ức chế các nấm gây bệnh. Đồng thời, Bacillus laterosporus có thể ức chế các vi khuẩn có hại như Escherichiacoli, Baculovirus, v.1: (A): Ảnh nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus laterosporus (B): Hình thái vi khuẩn Bacillus laterosporus, (C): Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus laterosporus 4 Nguồn: (https://www.com/brevibacillus-laterosporus-nbrc- 15654.html; Ruiu & cs.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/brevb. Thể ký sinh (parasporal body) Đặc điểm hình thái chính đặc trưng cho Bacillus laterosporus là một khía cạnh đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khác nhau.

Vào giữa thế kỷ 20, Hannay đã tiến hành quan sát các tế bào bào tử cố định bằng kính hiển vi quang điện tử, đi đến kết luận rằng “thể ký sinh hình xuồng - Canoe-Shaped Parasporal Body” được hình thành trước khi hoàn thành quá trình tạo bào tử và vẫn tồn tại cùng bào tử bởi vì nó là “một phần của bào tử” (Hannay & cs. SW của vi khuẩn Bacillus laterosporus, túi bào tử; sp:- bào tử; SC:- áo bào tử; CSPB:- cơ thể parasporal hình xuồng (Ruiu & cs. Các giả thuyết khác nhau đã được đưa ra vai trò và chức năng của các cơ thể này có thể đóng vai trò là đơn vị lưu trữ nếu bào tử nảy mầm trong môi trường thiếu hụt, có thể hỗ trợ sự nảy mầm của bào tử hoặc có thể là vách phụ hoặc chỉ là biến dạng của vách bào tử. Tuy nhiên, chức năng cụ thể vẫn chưa được xác nhận cho đến nay.

James và Young (1958) đã phân tích thành phần hóa học của cấu trúc áo bào tử, sau khi phát triển một phương pháp tách nó ra khỏi nguyên sinh bào tử. Theo nghiên cứu của họ, các thành phần chính của CSPB là phosphate và nitrogen. Ngoài lượng phosphate dồi dào, vật liệu protein 5 được thu hồi thông qua chiết xuất kiềm với sự có mặt của chất khử (alkali- thioglicollate) phá vỡ liên kết S-S. Kết quả phân tích hình thái và hóa học kết hợp cho thấy rằng thành phần photpho là một phần của cấu trúc của thể ký sinh hình xuồng (Ruiu & cs.

Các cơ thể bào tử khác (PB), khác biệt với CSPB, đã được ghi nhận bên trong túi bào tử bởi Montaldi và Roth (1990), người đã xác định được loại thứ hai, hình cầu, hình góc và loại thứ ba, có vân với các dải song song xen kẽ. Chức năng của các cấu trúc này chưa được làm rõ, nhưng có giả thiết cho rằng cấu trúc này có vai trò trong hoạt động diệt côn trùng (Ruiu & cs. Bacillus laterosporus là một loại vi khuẩn được đặc trưng bởi „thể ký sinh hình xuồng SC – CSPB” bao xung quanh lõi bào tử. Vì vậy, Bacillus laterosporus đã được xác định và mô tả bởi các protein chính của phức hợp SC- CSPB.

Các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp sàng lọc protein để tìm ra được 4 protein quan trọng trong Bacillus laterosporus bao gồm với ExsC (42 kDa), CHRD (42 kDa), CpbA (54 kDa) và CpbB (42 kDa) (Ruiu & cs. Các gen mã hóa protein ExsC, CHRD, CpbA và CpbB của Bacillus laterosporus đã được khuếch đại thành công với các đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình tự tương đồng và đã được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI. Trình tự DNA của các gen này hiện nay đã được công bố trên cơ sở dữ liệu GenBank theo các mã số sau: KY124461 (CpbA), KY124462 (CpbB), KY124463 (CHRD) và KY124464 (ExsC) (Marche & cs. Khả năng kháng khuẩn Một số chủng Bacillus laterosporus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương đối rộng đối với các loại vi khuẩn và nấm khác nhau.

Đặc tính sinh học này có liên quan đến việc sản xuất nhiều loại enzyme và kháng sinh bởi Bacillus laterosporus. Chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus BPM3, phân lập từ bùn ở Ấn Độ, được xác định là có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh thực vật như Fusarium oxysporum, Aspergillus sp, Alternaria, Colletotrichum gloeosporioides và sự phát triển của vi khuẩn cầu khuẩn Gram 6 dương Staphylococcus aureus. Các hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm từ chủng vi khuẩn này đã được tinh sạch và mô tả.