ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, công nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi (TĂCN) tại Việt Nam có xu hướng tăng tuy nhiên vẫn không đáp ứng được nhu cầu trong nước. Cùng với việc phát triển mạnh mẽ về quy mô, sản lượng, chủng loại thì chất lượng của sản phẩm cũng còn khá nhiều bất cập như công bố chất lượng không đúngtrên bao bì, nguyên liệu không đạt chuẩn, tỷ lệ các chất phụ gia quá cao, lạm dụng kháng sinh, chất cấm nhằm mục đích tạo nạc, đặc biệt việc sử dụng chất tạo màu công nghiệp trong TĂCNđang gây bức xúc dư luận, được người tiêu dùng, các cơ quan quản lý, phương tiện thông tin đại chúng rất quan tâm. Những năm gần đây, cục cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường đã phát hiện hàng trăm tấn thức ăn chăn nuôi tại các cơ sở sản xuất ở Việt Nam đã sử dụng chất tạo màu công nghiệp, chủ yếu là Auramin O (AO), để tạo màu vàng cho thức ăn chăn nuôi. Auramin O là chất tạo màu công nghiệp, căn cứ vào cấu tạo hóa học, tính chất vật lý hóa học và độc tính của AO, Viện Ung thư quốc gia NCI Hoa Kỳ, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế IRAC của Tổ chức Y tế thế giới WHO xếp các thuốc nhuộm vat yellow trong đó có AO thuộc nhóm 3 các chất gây ung thư[52].Ngoài ra còn nhiều thí nghiệm trên chuột cho thấy chất AO còn gây hại các tế bào gan, thận và tủy xương [18].Vì vậy khi vật nuôi ăn phải thức ăn có chứa AO sẽ gây tổn hại trực tiếp đến sức khỏe gia súc, gia cầm.
Tồn dư của loại hóa chất này trong thực phẩm sẽ dẫn đến nguy cơ gây ung thư cho con người. Hầu hết các nhà nghiên cứu đều chú ý nhiều hơn đến việc xác định hàm lượng thuốc nhuộm trong thực phẩm vì mối liên hệ trực tiếp đối với sức khoẻ con người. Tuy nhiên, như chúng ta đã biết, có rất nhiều chất tạo màu độc hại được thêm vào thức ăn cho động vật, những chất này sẽ chuyển hoá và tồn dư trong cơ thể vật nuôi và chính những vật nuôi này lại là nguồn thực phẩm cho con người. Vì vậy việc phát hiện sớm các chất độc hại này trong TĂCN là để ngăn ngừa chúng bước vào chuỗi thức ăn của con người, đồng thời tăng chất lượng vật nuôi, đảm bảo một nguồn thực phẩm sạch cung cấp trong nước và xuất khẩu nước ngoài.Ở nước ta, kể từ khi các cơ quan chức năng phát hiện AO được các cơ sở sản xuất TĂCN sử 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com dụng làm chất tạo màu, đã có rất nhiều phòng thử nghiệm Việt Nam nghiên cứu phương pháp phân tích loại chất này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có báo cáo nghiên cứu chính thức nào về việc đánh giá các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa phương pháp xác định Auramin O bằng LC-MS/MS.
Từ những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát triển phƣơng pháp phân tích Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)” Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật phân tích hiện đại sắc ký lỏng khối phổi 2 lần (LC-MS/MS) để phân tích nhằm đưa ra những kết quả đáng tin cậy. Việc sử dụng phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay để tối ưu hóa các điều kiện phân tích giúp tránh lãng phí thời gian phân tích, hóa chất sử dụng nhưng vẫn đạt được hệ số thu hồi cao nhất. Quy trình phân tích đã được ứng dụng để xác định AO trong mẫu thực tế tại phòng thí nghiệm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam Thức ăn chăn nuôi là những sản phẩm mà vật nuôi ăn, uống ở dạng tươi sống hoặc đã qua chế biến, bảo quản, bao gồm: nguyên liệu TĂCN hay thức ăn đơn, thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh, thức ăn đậm đặc, thức ăn bổ sung, phụ gia TĂCN, premix, hoạt chất và chất mang [8].
Thức ăn chăn nuôi hoàn chỉnh là hỗn hợp của nhiều nguyên liệu thức ăn được phối chế theo công thức nhất định đảm bảo có đủ các chất dinh dưỡng để duy trì đời sống và khả năng sản xuất vật nuôi theo từng giai đoạn sinh trưởng của chu kỳ sản xuất mà không cần thêm bất kỳ loại thức ăn nào khác ngoài nước uống [8]. Chất lượng của thực phẩm thường được đánh giá thông qua màu sắc của nó. Tạo màu trong thực phẩm nói chung, hay tạo màu trong TĂCN nói riêng đều nhằm mục đích: phục hồi lại màu sắc cho sản phẩm do những biến đổi trong tự nhiên, bảo quản, chế biến, đóng gói, phân phối…; làm tăng độ đồng nhất cho sản phẩm; giúp duy trì những tính chất đặc chung của sản phẩm; tăng cường màu sắc, làm tăng tính hấp dẫn của sản phẩm. Việc sử dụng phụ gia tạo màu có những yêu cầu bắt buộc như: không dùng để che đậy khuyết điểm của thực phẩm, không độc tính, chất màu sử dụng là những chất không gây ung thư, những sản phẩm chuyển hóa của những chất màu trong quá trình chế biến và bảo quản không gây độc hại… [42].
Thức ăn chăn nuôi được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như: cám gạo, khoai lang, ngô, đỗ tương, bột thịt xương, bột đầu tôm…tùy thuộc vào mỗi nguồn nguyên liệu, các cơ sở sản xuất sẽ tạo cho sản phẩm có màu đặc trưng theo từng nguyên liệu bằng cách trộn với các chất phẩm màu tự nhiên hoặc tổng hợp. Tuy nhiên, nhằm tính toán đến lợi nhuận, một số cơ sở sản xuất đã không sử dụng những phụ gia tạo màu được phép [3] như vàng curcumin, vàng Riboflavin, tartrazin, sunset FCF với hàm lượng được phép mà sử dụng chất tạo màu công nghiệp, rẻ tiền và vô cùng độc hại như AO.Điều đáng lo ngại, dù trên thùng sản phẩm hóa chất công nghiệp đều khuyến cáo chỉ sử dụng trong công nghiệp không sử dụng trong TĂCNvà thực phẩm nhưng các công ty sản xuất TĂCN vẫn cố tình 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com mua và sử dụng sai mục đích nhằm trục lợi. Chính điều này đã gây hoang man và bức xúc trong toàn xã hội. Để chấn chỉnh tình trạng sử dụng chất cấm trong chăn nuôi, Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn đã ban hành thông tư số 42 về danh mục bổ sung hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong TĂCN gia súc, gia cầm tại Việt Nam[1].Theo đó, bổ sung 5 loại Vàng Ô (vat yellow) vào danh mục này gồm: vat yellow 1, vat yellow 2, vat yellow 3, vat yellow 4, Auramin và các dẫn xuất của Auramin hay còn được gọi là màu vàng cơ bản 2, sử dụng trong công nghệ dệt nhuộm.
Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất lén sử dụng AO để tạo màu vàng cho thức ăn gia súc gia cầm vì vậy việc định lượng chính xác hàm lượng chất này trong TĂCN là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời cũng rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng AO trong chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có,nhằm kiểm soát việc sử dụng chất cấm cũng như đảm bảo cung cấp một nguồn thực phẩm sạch trong nội địa và xuất khẩu.2 Tổng quan về Auramin O Auramine O thuộc nhóm thuốc nhuộm Diphenylmethane, trong nhóm này có hai loại thuốc nhuộm quan trọng có tính thương mại là Auramin O và Auramine G. Ở dạng tinh khiết, tinh thể Auramin có màu vàng, tan tốt trong nước và ethanol [24], [33]. Công thức cấu tạo của Auramin O [44]: Công thức phân tử: C17H21N3.HCl Tên đầy đủ của AO: 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4,4’-Carbonimidoylbis[N,N-dimethylbenzenamine]hydrochlorid Tên thương mại: Auramin O, Vàng Ô, basic yellow 2 Auramin và muối của nó có thể được tạo ra bằng cách nung nóng đimethylaminođiphenyl với hỗn hợp urê, axit sufamic, và sulfur trong amoni tại 175 o C.
Muối của Auramin được tạo thành trong phản ứng có thể sử dụng trực tiếp trong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển đổi thành Auramin cơ bản hay Auramin hyđrochloric [33], [38],[47]. Auramine G cũng được tạo ra từ dimethylamino điphenylmethan, thu được bằng cách ngưng tụ N-methyl o-toluidin với fomandehit[33]. Việc sản xuất Auramindiễn ra lần đầu tiên ở Châu Âu (Thụy Sĩ, Đức, Mỹ, Pháp) nhưng đã bị ngưng.Hiện giờ Auramin chủ yếu được sản xuất tại Ấn độ và Trung Quốc[24], [47]. Auramin được dùng trong công nghiệp nhuộm sợi như lụa và sợi bông; ngoài ra còn để nhuộm da, giấy.Nó cũng được sử dụng trong việc in ấn, tạo màu trong các loại mực.Ngoài ra, AO còn được áp dụng trong các nghiên cứu về y tế như sử dụng AOnhư một chất huỳnh quang để phát hiện nhiễm trùng vi khuẩn lao không điển hình (ví dụ như Mycobacterium) trong mô tế bào[29], [39] hoặc nó được kết hợp với Rhodamine B tạo thành chất auramine-rhodamine được sử dụng như chất khử trùng[45].Ngoài ra các thuốc nhuộm huỳnh quang như Rhodamine và AO còn được áp dụng trong nghiên cứu hóa học, sinh học, y tế [19,[45].
Thuốc nhuộm tổng hợp đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp cũng như thực phẩm vì so với hầu hết các thuốc nhuộm tự nhiên, chúng có độ ổn định cao hơn và giảm được chi phí sản xuất.Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của một số thuốc nhuộm tổng hợp có thể gây tác động xấu đến sức khỏe con người.Vì những lý do này, việc sử dụng các thuốc nhuộm tổng hợp trong các sản phẩm thực phẩm hiện nay bị cấm ở Châu Âu và nhiều nước trên thế giới.Quy định EC số 1333/2008 phụ lục II đưa ra danh sách các phụ gia thực phẩm của Liên minh Châu Âu để sử dụng trong thực phẩm và các điều kiện của chúng, bao gồm một danh sách các chất tạo màu cho phép và AO không nằm trong danh sách[20].Tại Việt Nam, cấm nhập 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong chế biến TĂCN các loại chất tạo màu công nghiệp trong đó có AO. Theo quyết định số 846/QĐ-CN-TĂCN ngày 17/112015 của Cục trưởng Cục chăn nuôi về việc mở rộng phạm vi chỉ định phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm thì giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích AO phải đạt được 1 mg/kg [2].