CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Theo Technavio Medicinal Mushrooms Market quy mô thị trường nấm ăn dự kiến đạt 72,5 tỷ USD vào 2027, trong đó thị trường nấm dược liệu ước tính tăng đến 13,88 tỷ USD vào 2022, tốc độ tăng trưởng đạt 9,54% vào năm 2023 [1] cho thấy thị trường nấm nói chung và nấm dược liệu nói riêng có quy mô lớn và mức tăng trưởng cao. Số liệu này cho thấy con người ngày càng quan tâm hơn đến vấn đề sức khỏe, tìm kiếm những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên như một biện pháp hỗ trợ hoặc thay thế trong chế độ dinh dưỡng hàng ngày. Từ đó, một thách thức đặt ra đối với ngành thực phẩm là tìm kiếm giải pháp giúp nâng cao sức khỏe có nguồn gốc thiên nhiên. Trong đó, nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.) thuộc họ Hymenochaetaceae là loài nấm gỗ, mọc kí sinh trên các cây thân gỗ như Dâu tằm, Dương, Liễu, Bạch dương,… thường xuất hiện trong các cánh rừng nguyên sinh nhiệt đới, cận nhiệt đới và được biết đến như một loại nấm dược liệu có tác dụng tăng cường sức khỏe do chứa nhiều hoạt chất thuộc các nhóm polysaccharide, terpenoid, steroid, polyphenol có tác dụng kháng oxi hóa, kháng viêm.
Bên cạnh Linh chi, nấm Thượng hoàng được biết đến là một loại dược liệu quý, được sử dụng phổ biến tại Hàn Quốc, Nhật Bản. Các công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở mức độ in vivo, in vitro đối với loại nguyên liệu này bước đầu chỉ rõ các tác dụng tích cực đối với con người. Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện các sản phẩm thực phẩm chức năng từ chiết xuất nấm Phellinus, sự đa dạng các sản phẩm đã đặt ra nhiều thách thức cho việc xác định nguồn gốc, chất lượng nhằm bảo vệ người tiêu dùng. Vì vậy, đề tài đặt ra hai mục tiêu nghiên cứu chính bao gồm: - Thiết lập phương pháp định lượng đồng thời hai hợp chất inoscavin A và meshimakobnol A - Nghiên cứu điều kiện trích ly có hỗ trợ của sóng siêu âm để đạt hàm lượng inoscavin A và meshimakobnol A cao nhất.
Đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng bằng HPLC và quá trình trích ly inoscavin A và meshimakobnol A trong nấm Thượng hoàng (Phellinus spp.)” thực hiện hai nội dung chính bao gồm: 2 - Tách chiết, tinh sạch inoscavin A và meshimakobnol A, sử dụng như chất chuẩn để phát triển quy trình phân tích đồng thời hai hợp chất này trên thiết bị HPLC nhằm xác định hàm lượng trong nguyên liệu. - Nghiên cứu về phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm nhằm thu nhận các hoạt chất có lợi từ nấm Thượng hoàng làm tiền đề cho các ứng dụng nguyên liệu tự nhiên có hoạt tính sinh học cao vào các sản phẩm thực phẩm. Phương pháp phân tích đồng thời inoscavin A và meshimakobnol A có thể cung cấp cơ sở khoa học nhằm đánh giá chất lượng nấm Thượng hoàng và các sản phẩm có nguồn gốc từ nấm thuộc chi Phellinus. Đồng thời, kết quả nghiên cứu trích ly có hỗ trợ sóng siêu âm hai hợp chất trên còn là tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng nguồn nguyên liệu quý vào thực phẩm, tăng giá trị kinh tế cho nấm Thượng hoàng.
3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2. Nguồn gốc và đặc tính nấm thuộc chi Phellinus 2. Nguồn gốc và đặc điểm Chi Phellinus là một loại nấm được sử dụng từ cách đây 2000 năm và được nhắc đến nhiều trong y học cổ truyền Trung Quốc. Chi Phellinus có khoảng 220 loài phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Mông Cổ, Hàn Quốc và một số nước châu Á khác cũng như Mỹ và Châu Phi.
Trong đó có nhiều loài nhiều được công bố có hoạt tính sinh học như: Phellinus linteus, Phellinus baumii, Phellinus igniarius,. gọi chung là Sanghuang (Trung Quốc), Meshimakobu (Nhật Bản) hay còn có tên gọi khác là nấm Thượng hoàng (Việt Nam) [2]. Ở Việt Nam, nấm Thượng hoàng sinh trưởng tự nhiên xung quanh khu vực rừng nguyên sinh thuộc khu bảo tồn tồn thiên nhiên Pù huống (Nghệ An), khu bảo tồn thiên nhiên Ba Bể (Bắc Cạn) hoặc Phia Oắc - Phia Đén (Cao Bằng) [3]. Vị trí và phân loại nấm học [4]: Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycete Bộ: Hymenochaetales Họ: Hymenochaetaceae Chi: Phellinus 4 A B C D Hình 2.
1: Phellinus sinh trưởng tự nhiên [5] A, B. Quả thể non sinh trưởng tự nhiên C. Quả thể trên 10 năm D. Quả thể già Quả thể Phellinus thường có dạng quạt, thân gỗ cứng, mặt trên có màu vàng đến nâu đậm, mặt dưới có thể có lông mịn, màu nhạt, sống lâu năm, qua thời gian dài các sợi nấm tạo thành lớp mới chồng lên lớp cũ, các lớp này sẽ trở nên cứng và khô tạo thành quả thể cho nấm Phellinus.
Phellinus thường mọc ở vùng rừng sâu, núi, các khu rừng nguyên sinh, có thể chịu được các yếu tố khắc nghiệt như mưa kéo dài hay hạn hán cao, các khu rừng nguyên sinh. Loài nấm này thường mọc trên các cây họ Liễu, Dương, Bạch dương và Dâu tằm [6, 7]. Thành phần hóa học 5 2. Thành phần các hợp chất sơ cấp Các nghiên cứu về thành phần trong nấm cũng chỉ ra rằng các loài nấm thuộc chi Phellinus có giá trị dinh dưỡng, đóng góp thông qua các thành phần chủ yếu bao gồm protein, acid amin, chất béo và một số khoáng chất.
Kết quả thành phần dinh dưỡng được trình bày ở bảng 2.2 dưới đây: Bảng 2. 1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể P. linteus Thành phần P. linteus Tham khảo Ẩm 16,0 ± 1,28 15,2 ± 1,20 [8] Protein thô (%) 5,6 ± 0,11 5,4 ± 0,10 [8] Chất béo (%) 1.
2: Thành phần khoáng chất trong quả thể nấm P.linteus Thành phần P. linteus Tham Dịch chiết Dịch chiết khảo ethanol nước Na (µg/g) 0,8 ± 0,3 51 2,6 - 393 [8, 9] Mg (µg/g) 5,1 ± 0,1 57 1,0 - 263 [8, 9] K (µg/g) 44,0 ± 2,8 906 130,6 - 2395 [8, 9] Ca (µg/g) 14,8 ± 2,8 15 118,1 - 235 [8, 9] Mn (µg/g) 0,6 ± 0,0 0,9 0,6 - 18,8 [8, 9] Fe (µg/g) 1,0 ± 0,0 10 1,0 - 18 [8, 9] Cu (µg/g) 0,3 ± 0,0 0,1 0,1 - 18,5 [8, 9] Zn (µg/g) 0,2 ± 0,0 0,7 1,0 - 20,8 [8, 9] Si (µg/g) - 5 38 [9] Al (µg/g) - 3,1 0,2 [9] 6 P (µg/g) - 573 1371 [9] Fe (µg/g) - 10 18 [9] B (µg/g) - 1,1 13,7 [9] Ni (µg/g) - 0,8 2,8 [9] “-“ : chưa xác định 2. Thành phần các hợp chất thứ cấp Các hợp chất thứ cấp trong nấm Phellinus bao gồm nhiều nhóm khác nhau thuộc polysaccharide, steroid, terpenoid, polyphenol. Nhóm polysaccharide cấu tạo từ nhiều đơn phân bao gồm arabinose (Ara), fructose (Fru), fucose (Fuc), galactose (Gal), galacturonic acid (GalA), glucose (Glc), glucuronic acid (GlcA), mannose (Man), rhamnose (Rha), ribose (Rib) và xylose (Xyl) khối lượng phân tử từ 1,00 × 103 đến 1,00 × 107 kDa, liên kết α-(1 → 4), α-(1 → 3) và α-(1 → 6) phụ thuộc vào loài khác nhau, có tác dụng hạ đường huyết, chống tiểu đường, kháng viêm, kháng khối u [10, 11].
Nhiều hợp chất steroid, terpenoid được phân lập từ Phellinus có tiềm năng trong kháng viêm, hỗ trợ điều trị ung thư, viêm khớp dạng thấp, tiểu đường, thoái hóa thần kinh, chống trầm cảm [12-14]. Trong đó, steroid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc khung chính từ 4 vòng cycloalkane xuất hiện ở nấm, thực vật bậc cao và trong cơ thể người. Sterois có nguồn gốc từ Acetyl-CoA, được tổng hợp thông qua con đường Mevalonate, sản phẩm là dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) và isopentenyl pyrophosphate (IPP) phụ thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loài. Sau đó, qua quá trình chuyển hóa tạo thành steroid [15, 16].
Terpenoid có cấu trúc khung cơ bản là khung 5 cacbon, hay 1 đơn vị isopren, thông qua các phản ứng đóng vòng, sắp xếp lại khung cacbon tạo thành các phân lớp terpenoid như monoterpenoid (C10), sesquiterpenoid (C15), diterpenoid (C20), sesterpenoid (C25), triterpenoid (C30). Tương tự steroid, terpenoid có nguồn gốc từ Acetyl-CoA thông qua con đường Mevalonate hoặc Pyruvate thông qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4- phosphate (MEP) tạo thành DMAPP và IPP sau đó chuyển hóa thành các hợp chất terpenoid [13, 14, 17]. 2: Cấu trúc hóa học khung chất A) Steroid; B) Terpenoid (đơn vị isopren cấu trúc khung terpenoid) Trong thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu tiến hành xác định các hợp chất mang hoạt tính sinh học có khối lượng phân tử thấp, tập trung vào nhóm chất polyphenol, cụ thể là lớp chất styrylpyrone trên các loài nấm lớn. Lớp chất này đa dạng, phổ biến và mang tính đại diện cho một số loài nấm dược liệu thuộc chi Phellinus và Inonotus [18].
3: Cấu trúc hóa học khung chất styrylpyrone Styrylpyrone là một phân lớp chất thuộc nhóm polyphenol thường xuất hiện ở các loài nấm dược liệu, đặc biệt là Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae, có màu vàng đặc trưng (từ vàng nhạt đến vàng cam phụ thuộc vào từng hợp chất hóa học riêng biệt) [2, 19]. Ở thực vật và nấm, các hợp chất styrylpyrone là lớp chất thứ cấp có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ, chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn từ các vết thương xuất hiện trên thân hoặc quả thể [18]. Ở người, stylpyrone là nhóm chất có hoạt tính sinh học cao có khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng virus, kháng ung thư, ức chế tiểu đường và an thần [2, 18, 19]. Styrylpyrone được tổng hợp (thông qua con đường Shikimic) từ các tiền chất tương tự như quá trình tổng hợp chalcone (phổ biến ở các thực vật bậc cao) nhưng chỉ xảy ra hai phản ứng ngưng tụ và đóng vòng tạo thành khung styrylpyrone [19, 20].
Trong đó, đơn vị styryl- có nguồn gốc từ phenylalanine thông qua con đường cinnamic acid, p-coumaric acid, caffeoyl- CoA; cấu trúc vòng pyrone- có nguồn gốc từ acetate [21]. Dựa vào cấu trúc hóa học, 8 các styrylpyrone có thể được phân thành styrylpyrone đơn giản (có cấu tạo từ 1 đơn vị styryl- và 1 vòng pyrone-), styrylpyrone phức tạp (có cấu tạo từ 2 hoặc nhiều đơn vị styryl- và vòng pyrone- trở lên). Theo báo cáo của In-Kyoung Lee, nấm sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên có thể xuất hiện nhiều styrylpyrone phức tạp do sự kết hợp của styrylpyrone đơn giản với hispolon (5) hoặc 3,4-dihydroxyphenylpropanoids; trong khi đó, nấm nuôi trồng thường xuất hiện styrylpyrone đơn giản và các polymer của chúng [18, 21]. Hispidin (3), bisnoryangonin (4) là hai hợp chất điển hình, có cấu tạo hóa học đơn giản thuộc styrylpyrone.
Hispidin, có tên khác là 6-(3′,4′-dihydroxystyryl)-4- hydroxy-2-pyrone, định danh lần đầu bởi Edwards vào 1961 và Bu’Lock năm 1962 [22]. Đến 1977, Gonindard công bố hispidin có khả năng ức chế protein kinase C, kể từ đó, hợp chất này được thương mại hóa trên thị trường và sử dụng cho các thử nghiệm ức chế protein kinase C [23].