Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

Nghiên cứu phương pháp định lượng diltiazem trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS, mang lại kết quả chính xác và tin cậy.

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Phương Pháp Định Lượng Diltiazem Trong Huyết Tương Bằng LC-MS
• Loại tài liệu: Đề Tài Nghiên Cứu
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. TỔNG QUAN VỀ DILTIAZEM
• 1.1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất hóa lý
• 1.2. Tác dụng dược lý, dược động học
• 1.3. Chỉ định và cách dùng
• 1.4. Lưu ý khác khi dùng thuốc
• 1.5. Một số phương pháp định lượng DTZ trong dịch sinh học
• 2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC/MS
• 2.1. Khái niệm
• 2.2. Phân loại
• 2.3. Cấu tạo
• 2.3.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• 2.3.2. Mặt phân giới ion hóa (Ionization Interface)
• 2.3.3. Khối phổ (MS)
• 2.3.4. Máy phân tích MS/MS
• 2.3.5. Dữ liệu và hệ thống kiểm soát
• 2.4. Ứng dụng
• 3. PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
• 3.1. Các phương pháp chiết tách thuốc trong huyết tương
• 3.1.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
• 3.1.2. Phương pháp kết tủa protein
• 3.1.3. Chiết lỏng – lỏng

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương bằng LC MS

Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương bằng LC-MS đang trở thành một chủ đề quan trọng trong ngành dược. Diltiazem là một loại thuốc chẹn kênh calci, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh tim mạch. Việc xác định nồng độ của thuốc trong huyết tương là cần thiết để đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho bệnh nhân. Phương pháp LC-MS cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phân tích chính xác nồng độ Diltiazem trong mẫu huyết tương.

1.1. Định nghĩa và vai trò của Diltiazem trong điều trị

Diltiazem là một thuốc tim mạch có tác dụng chẹn kênh calci, giúp giãn mạch và giảm nhịp tim. Thuốc này được chỉ định trong điều trị đau thắt ngực và tăng huyết áp. Việc định lượng chính xác nồng độ Diltiazem trong huyết tương là rất quan trọng để điều chỉnh liều lượng và đảm bảo hiệu quả điều trị.

1.2. Tại sao cần nghiên cứu phương pháp LC MS cho Diltiazem

Phương pháp LC-MS cho phép phân tích nồng độ Diltiazem với độ nhạy cao, đặc biệt trong các mẫu huyết tương có nồng độ thuốc thấp. Kỹ thuật này giúp xác định chính xác nồng độ thuốc và các chất chuyển hóa, từ đó hỗ trợ trong việc đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc.

II. Những thách thức trong việc định lượng Diltiazem trong huyết tương

Việc định lượng Diltiazem trong huyết tương gặp nhiều thách thức do nồng độ thuốc thường rất thấp và sự hiện diện của nhiều tạp chất. Các yếu tố như sự chuyển hóa của thuốc trong cơ thể và sự tương tác với các thành phần khác trong mẫu huyết tương cũng gây khó khăn cho quá trình phân tích. Do đó, cần có phương pháp phân tích chính xác và đáng tin cậy.

2.1. Khó khăn trong việc chiết tách mẫu huyết tương

Chiết tách mẫu huyết tương để phân tích Diltiazem thường gặp khó khăn do nồng độ thuốc thấp và sự hiện diện của nhiều tạp chất. Các phương pháp chiết tách như chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn cần được tối ưu hóa để đạt được độ tinh khiết cao cho mẫu phân tích.

2.2. Ảnh hưởng của các chất chuyển hóa đến kết quả phân tích

Sau khi vào cơ thể, Diltiazem bị chuyển hóa thành nhiều chất khác nhau, có cấu trúc tương tự với dược chất ban đầu. Điều này có thể gây khó khăn trong việc phân tích và định lượng chính xác nồng độ Diltiazem trong huyết tương.

III. Phương pháp định lượng Diltiazem bằng LC MS Quy trình và kỹ thuật

Phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương bằng LC-MS bao gồm các bước chiết tách mẫu, xử lý mẫu và phân tích. Quy trình này cần được thẩm định để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả. Việc sử dụng LC-MS giúp nâng cao hiệu quả phân tích và giảm thiểu thời gian xử lý mẫu.

3.1. Quy trình chiết tách mẫu huyết tương

Quy trình chiết tách mẫu huyết tương thường sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng hoặc chiết pha rắn. Các dung môi hữu cơ không phân cực được sử dụng để tách Diltiazem ra khỏi các tạp chất trong mẫu huyết tương, đảm bảo độ tinh khiết cho mẫu phân tích.

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích LC MS

Thẩm định phương pháp phân tích LC-MS bao gồm kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác của phương pháp. Các tiêu chí này cần được đáp ứng để đảm bảo rằng phương pháp có thể được áp dụng trong thực tế để định lượng Diltiazem trong huyết tương.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp LC MS trong nghiên cứu Diltiazem

Phương pháp LC-MS không chỉ được sử dụng để định lượng Diltiazem mà còn hỗ trợ trong việc nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc. Kết quả từ các nghiên cứu này giúp các nhà sản xuất dược phẩm cải thiện chất lượng sản phẩm và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

4.1. Đánh giá sinh khả dụng của Diltiazem

Nghiên cứu sinh khả dụng của Diltiazem giúp xác định mức độ hấp thu và phân phối của thuốc trong cơ thể. Phương pháp LC-MS cho phép theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian, từ đó đánh giá hiệu quả điều trị.

4.2. Tương đương sinh học của Diltiazem

Nghiên cứu tương đương sinh học giúp so sánh hiệu quả của các chế phẩm khác nhau chứa Diltiazem. Phương pháp LC-MS cung cấp dữ liệu chính xác về nồng độ thuốc, hỗ trợ trong việc đánh giá sự tương đương giữa các sản phẩm.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu Diltiazem bằng LC MS

Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương bằng LC-MS mở ra nhiều triển vọng cho ngành dược. Việc áp dụng công nghệ này không chỉ nâng cao độ chính xác trong phân tích mà còn giúp cải thiện chất lượng thuốc. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp phân tích mới để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong lĩnh vực dược phẩm.

5.1. Triển vọng phát triển công nghệ LC MS

Công nghệ LC-MS đang ngày càng được cải tiến, với nhiều ứng dụng mới trong phân tích dược phẩm. Việc phát triển các thiết bị và phần mềm phân tích hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả và độ chính xác của phương pháp.

5.2. Nhu cầu nghiên cứu về Diltiazem trong tương lai

Nhu cầu nghiên cứu về Diltiazem và các thuốc tim mạch khác sẽ tiếp tục gia tăng. Các nghiên cứu về sinh khả dụng và tương đương sinh học sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm thuốc mới, đảm bảo an toàn và hiệu quả cho người bệnh.

Nội dung chính

Nghiên Cứu Phương Pháp Định Lượng Diltiazem Trong Huyết Tương Người Bằng Sắc Ký Lỏng Khối Phổ (LC-MS/MS)

Tóm tắt nghiên cứu (200-250 từ)

• Câu hỏi nghiên cứu chính: Làm thế nào để xây dựng và thẩm định một quy trình phân tích định lượng Diltiazem (DTZ) trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) vừa đảm bảo độ nhạy, độ đặc hiệu cao, vừa tối ưu hóa thời gian và chi phí cho các thử nghiệm tương đương sinh học quy mô lớn?
• Tổng quan phương pháp (Methodology Snapshot): Hoạt chất DTZ và chất chuẩn nội Felodipine (FELO) được chiết tách khỏi huyết tương người bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) với hỗn hợp dung môi diethyl ether - cloroform (7:3, v/v) sau khi kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 0,1M. Hệ thống phân tích sử dụng cột pha đảo $C_{18}$ ($50 \times 3\text{ mm}; 2,1\ \mu\text{m}$), pha động MeOH - amoni acetat 2 mM (90:10, v/v) ở tốc độ dòng 0,3 mL/phút, kết hợp đầu dò khối phổ 3 tứ cực nguồn ion hóa phun điện tử dương $\text{ESI}(+)$ vận hành ở chế độ theo dõi ion chọn lọc (SRM).
• Phát hiện chính: Phương pháp đạt giới hạn định lượng dưới ($\text{LLOQ}$) là $5\text{ ng/mL}$, khoảng tuyến tính rộng từ $5,1\text{ đến }510\text{ ng/mL}$ ($r = 0,9994$). Thời gian phân tích mỗi mẫu được rút ngắn vượt bậc xuống chỉ còn 2,75 phút. Tỷ lệ thu hồi chiết xuất đạt xấp xỉ $90%$ với độ đúng ($91,5% - 102,8%$) và độ lặp lại cao ($\text{CV} < 6%$), triệt tiêu hoàn toàn hiện tượng triệt ion (matrix effect).
• Ý nghĩa thực tiễn: Nghiên cứu cung cấp một công cụ phân tích hiện đại, có độ tin cậy cao và hiệu quả kinh tế, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của FDA để ứng dụng trực tiếp vào đánh giá sinh khả dụng ($\text{SKD}$) và tương đương sinh học ($\text{TĐSH}$) của các chế phẩm Diltiazem tại Việt Nam.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (300-350 từ)

• Thực trạng kiến thức hiện tại: Trong ngành công nghiệp dược hiện đại, việc kiểm tra chất lượng thuốc không chỉ dừng lại ở các chỉ tiêu hóa lý thông thường trong phòng thí nghiệm (độ tan, độ rã, định lượng hoạt chất) mà bắt buộc phải thông qua đánh giá sinh dược học, cụ thể là sinh khả dụng ($\text{SKD}$) và tương đương sinh học ($\text{TĐSH}$). Diltiazem (DTZ) là hoạt chất thuộc nhóm benzothiazepin có tác dụng chẹn kênh calci, được chỉ định rộng rãi trong điều trị dự phòng đau thắt ngực và kiểm soát tăng huyết áp. Tuy nhiên, DTZ có tỷ lệ liên kết protein huyết tương cao ($80 - 85%$), bị chuyển hóa mạnh qua gan lần đầu thành nhiều chất chuyển hóa có cấu trúc tương tự (như deacetyl diltiazem, N-monodemethyl diltiazem), khiến nồng độ thuốc tự do trong máu rất thấp ($C_{\max} \approx 200\text{ ng/mL}$ với liều đơn 60 mg).
• Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap): Để phục vụ đăng ký thuốc generic, Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành Thông tư 08/2010/TT-BYT quy định bắt buộc thử nghiệm $\text{SKD/TĐSH}$ đối với thuốc tim mạch và các dạng bào chế phóng thích biến đổi. Các phương pháp định lượng DTZ truyền thống (HPLC-UV, HPLC-huỳnh quang) thường có độ nhạy hạn chế, thời gian phân tích kéo dài ($10 - 15\text{ phút/mẫu}$), hoặc quy trình chiết pha rắn ($\text{SPE}$) quá tốn kém, không khả thi khi phải xử lý hàng trăm mẫu sinh học. Trong khi đó, các kỹ thuật tủa protein đơn giản lại gây hiện tượng suy giảm ion hóa ($\text{ion suppression}$) nghiêm trọng trên đầu dò khối phổ.
• Tính cấp thiết và tác động tiềm năng: Việc ứng dụng kỹ thuật LC-MS/MS 3 tứ cực kết hợp quy trình xử lý mẫu chiết lỏng - lỏng tối ưu là giải pháp đột phá. Đề tài không chỉ giải quyết bài toán kỹ thuật phân tích dịch sinh học phức tạp mà còn hỗ trợ trực tiếp các doanh nghiệp dược trong nước làm chủ công nghệ đánh giá chất lượng thuốc generic tương đương với thuốc phát minh.

---

Methodology và approach (350-400 từ)

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phát triển và thẩm định phương pháp phân tích sinh học tuân thủ hướng dẫn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-FDA 2001) và Dược điển Mỹ (USP).
• Kỹ thuật xử lý mẫu và hạn chế Matrix Effect:
  • Khảo sát so sánh giữa kỹ thuật tủa protein (bằng acid $\text{HClO}_4, \text{CCl}_3\text{COOH}, \text{CF}_3\text{COOH}$ hoặc dung môi $\text{MeOH, MeCN}$) và phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE).
  • Quy trình chuẩn hóa: $1\text{ mL}$ huyết tương người được bổ sung $500\ \mu\text{L}$ nội chuẩn Felodipine ($1,0\ \mu\text{g/mL}$), kiềm hóa bằng $1\text{ mL }\text{NH}_3\ 0,1\text{M}$ để chuyển DTZ sang dạng base tự do, sau đó chiết bằng $7\text{ mL}$ hỗn hợp dung môi diethyl ether - cloroform (7:3, v/v). Lớp dung môi hữu cơ được tách ra, thổi khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ kiểm soát, cắn thu được hòa tan lại trong $1\text{ mL}$ pha động và lọc qua màng $0,45\ \mu\text{m}$.
• Điều kiện sắc ký và khối phổ (LC-MS/MS):
  • Hệ thống thiết bị: Máy sắc ký lỏng khối phổ 3 tứ cực TSQ Quantum Ultra (Thermo Scientific), nguồn ion hóa phun điện tử dương $\text{ESI}(+)$.
  • Cột sắc ký: Cột pha đảo Thermo Hypersil $C_{18}$ ($50 \times 3\text{ mm}; 2,1\ \mu\text{m}$), nhiệt độ cột duy trì ở $40^\circ\text{C}$.
  • Pha động: Hỗn hợp $\text{MeOH}$ và đệm amoni acetat 2 mM (tỷ lệ 90:10, v/v), tốc độ dòng $0,3\text{ mL/phút}$, thể tích tiêm mẫu $10\ \mu\text{L}$.
  • Cài đặt MS/MS (SRM mode):
    • Diltiazem: Ion mẹ $[M+\text{H}]^+$ $m/z = 415,4 \rightarrow$ Ion con $m/z = 177,9$ (Năng lượng va chạm $\text{CE} = 22\text{ V}$, điện thế thấu kính hội tụ $\text{Tube Lens} = 108\text{ V}$).
    • Felodipine (IS): Ion mẹ $[M+\text{H}]^+$ $m/z = 384,4 \rightarrow$ Ion con $m/z = 338,1$ ($\text{CE} = 14\text{ V}$, $\text{Tube Lens} = 141\text{ V}$).
    • Thông số nguồn ESI: Điện thế phun (Spray Voltage) $4000\text{ V}$, nhiệt độ mao quản $360^\circ\text{C}$, áp suất khí mang 30 psi.
• Quy trình thẩm định tính giá trị và độ tin cậy: Thẩm định trên 6 lô huyết tương trắng độc lập từ Viện Huyết học - Truyền máu TW, kiểm tra độ đặc hiệu, độ tuyến tính, $\text{LLOQ}$, độ đúng, độ chính xác (trong ngày và khác ngày), tỷ lệ thu hồi và độ ổn định sinh học qua 3 chu kỳ đông - rã đông.

---

Phát hiện chính (400-450 từ)

1. Rút ngắn thời gian phân tích mẫu vượt trội: Thời gian lưu của DTZ đạt $1,69\text{ phút}$ và chuẩn nội FELO đạt $1,84\text{ phút}$. Tổng thời gian cho một chu kỳ sắc ký hoàn chỉnh chỉ mất 2,75 phút. So với các công bố quốc tế trước đây dùng HPLC-UV ($12 - 15\text{ phút}$) hoặc LC-MS ($15\text{ phút}$), quy trình này tăng năng suất phân tích lên gấp 4 - 5 lần.
2. Khắc phục hoàn toàn hiện tượng triệt tiêu ion (Matrix Effect): Thử nghiệm truyền liên tục dung dịch chuẩn kết hợp tiêm mẫu trắng chứng minh: phương pháp tủa protein bằng acid gây triệt tiêu tín hiệu ion tới $60%$ tại vùng thời gian lưu của hoạt chất ($1 - 2\text{ phút}$). Ngược lại, chiết lỏng - lỏng bằng diethyl ether - cloroform (7:3) đã loại bỏ triệt để tạp chất phân cực, ảnh hưởng nền mẫu tại vùng pic hoạt chất là không đáng kể ($< 15%$), đảm bảo độ nhạy và tuổi thọ thiết bị.
3. Độ nhạy và khoảng tuyến tính lý tưởng:
   • Giới hạn định lượng dưới ($\text{LLOQ}$) xác định tại $5,0\text{ ng/mL}$, đạt tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu $\text{S/N} > 500$, độ đúng $106,3%$ và hệ số biến thiên $\text{CV} = 9,0%$. Mức $\text{LLOQ}$ này hoàn toàn thỏa mãn yêu cầu sinh dược học ($< 1/20 - 1/30\ C_{\max}$ với $C_{\max} \approx 200\text{ ng/mL}$) để tính toán chính xác $\text{AUC}{0-t} \ge 80%\ \text{AUC}{0-\infty}$.
   • Khoảng tuyến tính được thiết lập từ $5,1\text{ ng/mL đến }510,0\text{ ng/mL}$, đường chuẩn hồi quy có hệ số tương quan tuyến tính xuất sắc $r = 0,9994$.
4. Độ đúng và độ chính xác cao:
   • Độ đúng trong ngày và khác ngày trên các mẫu QC (LQC $15\text{ ng/mL}$, MQC $250\text{ ng/mL}$, HQC $450\text{ ng/mL}$) dao động từ $91,5%\text{ đến }102,8%$.
   • Độ chính xác (CV%) ở cả ba mức nồng độ đều đạt mức ấn tượng từ $1,6%\text{ đến }6,0%$, thấp hơn rất nhiều so với ngưỡng cho phép của FDA ($\le 15%$).
5. Hiệu suất chiết tách và độ ổn định cao:
   • Hiệu suất thu hồi đạt $88,6%\text{ đến }89,7%$ đối với DTZ và $84,0%$ đối với FELO, ổn định vượt bậc so với các phương pháp chiết bằng ethyl acetate đơn thuần ($50,8%$).
   • Diltiazem trong huyết tương chứng minh độ bền vững tuyệt đối qua 3 chu kỳ đông - rã đông (sai khác nồng độ $< 5%$) và ổn định trong khay tiêm mẫu tự động (autosampler) sau xử lý.

---

Đóng góp khoa học (250-300 từ)

• Đóng góp về mặt lý thuyết: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm chi tiết về cơ chế phân mảnh ion của Diltiazem trên hệ thống ESI-MS/MS 3 tứ cực, xác định chính xác mảnh ion con đặc hiệu $m/z = 177,9$ từ ion tiền thân $m/z = 415,4$ cùng các thông số tối ưu hóa điện thế thấu kính và năng lượng va chạm.
• Đổi mới về mặt phương pháp luận:
  • Lựa chọn thành công Felodipine làm chất chuẩn nội tối ưu, giải quyết được sự bất tương thích về điều kiện ion hóa của các chất đề xuất trước đây như Trimetazidine hay Lidocain.
  • Tối ưu hóa thành công tỷ lệ dung môi chiết lỏng - lỏng Diethyl ether : Cloroform (7:3, v/v) kết hợp kiềm hóa bằng $\text{NH}_3\ 0,1\text{M}$, thay thế hoàn toàn kỹ thuật chiết pha rắn đắt tiền mà vẫn kiểm soát hoàn hảo hiệu ứng nền mẫu.
• Ý nghĩa thực tiễn và chính sách:
  • Cung cấp một quy trình phân tích chuẩn hóa, sẵn sàng chuyển giao cho các trung tâm thử nghiệm tương đương sinh học tại Việt Nam.
  • Hỗ trợ đắc lực việc thực thi Thông tư 08/2010/TT-BYT của Bộ Y tế, tạo tiền đề kiểm soát chất lượng thuốc generic lưu hành trên thị trường, giúp giảm chi phí điều trị bệnh lý tim mạch cho cộng đồng.

---

Đối tượng quan tâm (200-250 từ)

• Nhà nghiên cứu học thuật & Dược động học: Các nhà khoa học tại các trường đại học y dược, viện nghiên cứu chuyên sâu về dược động học, sinh dược học và phân tích độc chất/dịch sinh học.
• Doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm (Khối R&D và QA/QC): Các công ty dược đang phát triển công thức viên nén giải phóng quy ước hoặc viên nang phóng thích biến đổi chứa Diltiazem cần dữ liệu $\text{TĐSH}$ để nộp hồ sơ xin cấp phép lưu hành.
• Cơ quan quản lý và Viện kiểm nghiệm: Cục Quản lý Dược, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM sử dụng làm phương pháp tham chiếu để hậu kiểm và thẩm định hồ sơ đăng ký thuốc.
• Lợi ích mang lại: Rút ngắn thời gian thử nghiệm lâm sàng, tiết kiệm $60 - 70%$ chi phí hóa chất/cột chiết so với phương pháp $\text{SPE}$, đảm bảo dữ liệu đầu ra đạt chuẩn quốc tế.

---

FAQ (Câu hỏi thường gặp) (250-300 từ)

1. Phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu này là gì?

Nghiên cứu đã thiết lập thành công phương pháp LC-MS/MS định lượng Diltiazem với thời gian sắc ký siêu ngắn (2,75 phút/mẫu), giới hạn định lượng thấp ($5\text{ ng/mL}$) và hiệu suất chiết cao ($~90%$), vượt trội hơn hẳn các phương pháp HPLC truyền thống.

2. Phương pháp xử lý mẫu có điểm gì đặc biệt để loại trừ Matrix Effect?

Thay vì tủa protein (gây triệt ion tới $60%$) hoặc chiết pha rắn ($\text{SPE}$ quá đắt), nhóm nghiên cứu sử dụng chiết lỏng - lỏng với hệ dung môi diethyl ether - cloroform (7:3) sau khi kiềm hóa huyết tương bằng $\text{NH}_3\ 0,1\text{M}$, giúp thu hồi chọn lọc base hữu cơ và giảm ảnh hưởng nền mẫu xuống $< 15%$.

3. Kết quả thẩm định có thể áp dụng cho các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn không?

Hoàn toàn có thể. Quy trình đã được thẩm định đầy đủ theo chuẩn FDA 2001 về độ đúng, độ chính xác trong ngày/khác ngày ($\text{CV} < 6%$), tính chọn lọc trên 6 lô huyết tương khác nhau và độ ổn định qua 3 chu kỳ đông - rã đông.

4. Vì sao Felodipine được chọn làm chất chuẩn nội (IS) thay vì Lidocain hay Trimetazidine?

Felodipine tạo mảnh ion $m/z = 338$ có cường độ đáp ứng ion cao gấp $10\text{ đến }10^4$ lần so với Trimetazidine và Lidocain ở cùng nồng độ, đồng thời có điều kiện ion hóa $\text{ESI}(+)$ hoàn toàn tương đồng với Diltiazem.

5. Ứng dụng thực tế trước mắt của quy trình này là gì?

Ứng dụng trực tiếp vào việc phân tích nồng độ Diltiazem trong các mẫu huyết tương của người tình nguyện khỏe mạnh nhằm đánh giá tương đương sinh học cho các chế phẩm thuốc tim mạch generic dạng viên nén 60 mg hoặc dạng giải phóng kéo dài.

---

Kết luận (150 từ)

Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định thành công phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đạt chuẩn FDA. Với quy trình xử lý mẫu chiết lỏng - lỏng tối ưu, chuẩn nội Felodipine phù hợp, khoảng tuyến tính rộng $5,1 - 510,0\text{ ng/mL}$ và thời gian phân tích chỉ 2,75 phút/mẫu, phương pháp đã khắc phục triệt để các hạn chế về độ nhạy, thời gian và chi phí của các kỹ thuật phân tích trước đây. Đây là công cụ phân tích có giá trị thực tiễn cao, sẵn sàng phục vụ cho các nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học và theo dõi nồng độ thuốc trong điều trị lâm sàng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dược thì lĩnh vực đánh giá kiểm tra chất lượng thuốc có một vai trò rất quan trọng. Theo quan điểm sinh dược học đánh giá chất lượng thuốc không chỉ thông qua các chỉ tiêu hoá lý thông thường như định tính, định lượng, độ rã, độ hoà tan … như quy định trong dược điển mà phải bằng đánh giá sinh khả dụng (SKD)và tương đương sinh học (TĐSH) [6]. Nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH đã được các doanh nghiệp dược Việt Nam quan tâm trong vài năm gần đây. Nhờ đó, các nhà sản xuất có thể lựa chọn công thức, kỹ thuật bào chế tối ưu để tạo ra các sản phẩm có chất lượng tương đương với thuốc phát minh.

Đồng thời, các nghiên cứu này còn cung cấp thêm bằng chứng chất lượng làm cơ sở cho bác sỹ lựa chọn thuốc thay thế hoặc điều chỉnh liều trong thực hành lâm sàng. Trên thế giới, các nước có nền công nghiệp dược phát triển và một số nước trong khu vực đã qui định danh mục các loại chế phẩm cần phải xem xét kết quả nghiên cứu SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành thuốc [17,29]. Hầu hết các thuốc có khoảng điều trị hẹp, có dược động học bất thường, thuốc phóng thích chậm, thuốc tim mạch đều thuộc nhóm nằm trong danh mục bắt buộc phải nghiên cứu. Trước xu thế hội nhập và nhu cầu nâng cao chất lượng điều trị, Bộ Y tế đã ban hành thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26/4/2010 về việc Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học trong đăng ký thuốc.

Tại thông tư này, Bộ Y tế đã đưa ra nguyên tắc lựa chọn dược chất đưa vào danh mục bắt buộc phải nghiên cứu SKD hoặc TĐSH gồm các nhóm thuốc ưu tiên: thuốc tim mạch, chống co giật, kháng sinh… Đồng thời, thông tư này cũng qui định giới hạn với (1) các thuốc generic ở dạng bào chế quy ước có chứa 12 dược chất trong danh mục và (2) những thuốc bào chế ở dạng phóng thích biến đổi. Dilitiazem (DTZ) là một thuốc tim mạch có tác dụng chẹn kênh calci được sử dụng rộng rãi trong điều trị dự phòng các cơn đau thắt ngực, một loại -1- bệnh có tỷ lệ ngày càng tăng ở Việt Nam. Trên thị trường hiện nay hoạt chất này được bào chế ở cả 2 dạng thuốc qui ước và phóng thích biến đổi. Một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất dạng bào chế phóng thích biến đổi có chứa hoạt chất này, do vậy nhu cầu nghiên cứu về SKD, TĐSH đối với DTZ là điều cần thiết và xuất phát từ thực tế.

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH các thuốc nói chung và DTZ nói riêng, một trong những nội dung quan trọng đầu tiên là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…). Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp; mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với dược chất nên việc phân tách để định lượng gặp nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được thẩm định chặt chẽ theo những qui định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.

Hệ thống phân tích LC/MS/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho các nhà khoa học dược thực hiện được các nghiên cứu sinh khả dụng phức tạp. Với ưu điểm vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu cao, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp dụng nhiều trong nghiên cứu các chế phẩm có hàm lượng thấp. Tuy nhiên, ở Việt Nam kỹ thuật này còn rất mới mẻ và khả năng ứng dụng còn hạn chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)” với các mục tiêu sau: 1.

Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu và định lượng DTZ trong huyết tương người bằng LC-MS 2. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng. TỔNG QUAN VỀ DILTIAZEM 1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất hóa lý [24,28] a.

Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C22H26N2O4S. HCl - Khối lượng phân tử: 450.98 g/mol - Tên khoa học: 1,5-Benzothiazepin-4(5H)-one,3-(acetyloxy)-5-[2- (dimethylamino)ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyphenyl), monohydrochloride, b. Tính chất vật lý, hóa học: - Bột kết tinh hoặc tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi. - Nhiệt độ nóng chảy: Từ 207,50 C đến 212,00 C.

- Hệ số phân bố: Log P(octanol/nước) = 2,79. - Dạng muối tan tốt trong nước, và acid formic, it tan trong ethanol, không tan trong ether. Dạng base tan tốt trong cloroform, ether. Do đó khi chiết DTZ trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng nên kiềm hóa -3- để chuyển sang dạng base rồi chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực như cloroform, diclormethan, diethyl ether, n-hexan… - Dạng dược dụng thường kết hợp với 1 phân tử acid hydrocloric nên có thể định lượng DTZ theo phương pháp chuẩn độ bạc nitrat.

- Phổ hấp thụ UV-Vis: Đỉnh hấp thụ trong dung dịch acid H 2SO4 0,2M là 236 nm, trong dung dịch kiềm là 237 nm. Do đó với dạng nguyên liệu và chế phẩm có thể định lượng bằng cách đo trực tiếp phổ hấp thụ UV hoặc HPLC với detector UV. - Góc quay cực riêng: + 1100 đến + 1160+. Tác dụng dược lý, dược động học: a.

Tác dụng dược lý [3,4,5,21] Diltiazem là một dẫn chất của benzothiazepin có tác dụng chẹn kênh calci gây giãn động mạch vành và mạch ngoại vi. Ngoài ra nó còn làm chậm dẫn truyền điện tử của cơ tim do đó làm chậm nhịp tim, giảm co bóp cơ tim và làm chậm dẫn truyền nút nhĩ thất. Thuốc được sử dụng trong điều trị đau thắt ngực và tăng huyết áp. Dược động học [16,23,25,26]: - Thuốc được hấp thu nhanh theo đường tiêu hóa, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn.

Trong thực tế bệnh nhân thường được khuyên dùng ngay trước bữa ăn để tránh quên thuốc. Thuốc bị chuyển hóa qua gan lần đầu, tạo thành nhiều chất chuyển hóa khác nhau. Tỷ lệ thuốc liên kết với protein cao (khoảng 80 - 85%). Vì vậy khi dùng liều duy nhất 60 mg DTZ, nồng độ thuốc trong huyết tương đạt cực đại khoảng 200 ng/ml.

Thể tích phân bố biểu kiến từ 3 đến 8 l/kg, đào thải chủ yếu qua phân, chỉ có khoảng 2 – 4 % đào thải dạng không biến đổi qua nước tiểu. Thời gian bán thải khoảng 3 - 8 giờ. -4- - Sản phẩm chuyển hóa bao gồm: o Deacetyl diltiazem(1) o N mono demethyl diltiazem(2) o Deacetyl-N-monodemethyl diltiazem(3) o Deacetyl diltiazemN-oxid(4) o Deacetyl O-demethyl diltiazem(5) o Deacetyl N,O-didemethyl diltiazem(6) - Khi xây dựng phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học phương pháp cần có giới hạn định lượng dưới khoảng 7 - 10 ng/ml (1/20 đến 1/30 Cmax) để đảm bảo AUCt > 80% AUC∞. Chỉ định và cách dùng [3,4,5]  Liều thông thường: Uống 60 mg, 3 lần một ngày ngay trước khi ăn.

 Ðiều trị đau thắt ngực: Uống 60 mg diltiazem, 3 lần một ngày; hoặc khởi đầu bằng liều 30 mg, 4 lần một ngày, tăng liều khi cần thiết trong khoảng 1 - 2 ngày sau. Ðối với người bệnh bị đau thắt ngực không ổn định, có thể dùng viên giải phóng chậm với liều từ 360 - 480 mg hàng ngày.  Ðiều trị tăng huyết áp: Dùng viên nén hoặc nang giải phóng chậm với liều ban đầu khoảng 60 - 120 mg, 2 lần một ngày; cứ 14 ngày một lần, có thể tăng liều nếu cần thiết tới liều tối đa mỗi ngày là 360 mg. Lưu ý khác khi dùng thuốc [21] - Tác dụng phụ : Thuốc có thể gây khó chịu ít nhiều ở một số người bệnh.

Khoảng 30% người bệnh dùng thuốc được ghi nhận gặp tác dụng không mong muốn liên quan đến khả năng gây giãn mạch của diltiazem. Những biểu hiện hay gặp nhất là nhức đầu, buồn nôn, chóng mặt và phù cổ chân. -5- - Chống chỉ định: o Rối loạn hoạt động nút xoang, blốc nhĩ thất độ 2 và độ 3. o Mẫn cảm với diltiazem.

o Suy thất trái kèm theo sung huyết phổi. o Nhịp tim chậm dưới 50 phút. Một số phương pháp định lượng DTZ trong dịch sinh học Đặc thù của phân tích thuốc trong dịch sinh học là phức tạp, lẫn nhiều tap chất, nồng độ hoạt chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên đòi hỏi những yêu cầu cơ bản sau: - Tính đặc hiệu cao: phân biệt được DTZ với các tạp chất lẫn trong mẫu, đặc biệt là chất chuyển hóa có công thức tương tự. - Độ nhạy cao: nồng độ thuốc trong dịch sinh học thường rất thấp, đòi hỏi phương pháp phải có độ nhạy cao.

 Thời gian phân tích mẫu càng ngắn càng tốt: số lượng mẫu phân tích trong đánh giá TĐSH rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có thể ảnh hưởng tới kết quả phân tích. Một số phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học được tổng hợp ở bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích DTZ trong huyết tương Thời gian Phương pháp LLOQ Stt Tài liệu Xử lý mẫu phân tích mẫu phân tích (ng/ml) (phút) LC – MS/MS 1 [12] Kết tủa protein bằng acetonitrile 15 1 ESI HPLC – UV 2 [32] Chiết pha rắn (SPE) 10 20 215 nm HPLC – UV 3 [9] Chiết pha rắn (SPE) 15 2,5 238 nm Chiết lỏng – lỏng bằng ethyl (LC/MS/MS) 4 [18] acetate 2 2 ESI(+) Hiệu suất chiết 50.8% Chiết lỏng – lỏng bằng hexane – HPLC - UV 5 [19] chloroform - isopropanol 12 3 239 nm (60:40:5) Kiềm hóa bằng dung dịch KHCO3 0,01M, rồi chiết bằng ethyl acetate. Tiếp tục chiết bằng HPLC - UV 6 [14] 15 5 HCl 0,01 M đem bay hơi dưới dòng khí nitơ sau đó hòa tan cắn bằng HCl 0.002 M Kiềm hóa bằng amoni sulfat rồi 7 [13] chiết lỏng – lỏng bằng methyl-ter- HPLC - FL 9 2 butyl ether -7- (LC/MS/MS) 8 [22] Chiết pha rắn (SPE) 3 1 ESI(+) Kiềm hóa bằng amoni sulfat rồi HPLC – UV 9 [7] 14 10 chiết bằng ethyl acetate. 254 nm Kiềm hóa rồi chiết lỏng – lỏng HPLC – UV 10 [8] 15 1 bằng ter-butyl methyl ether 240 nm Từ các kết quả nghiên cứu về định lượng DTZ trong huyết tương, chúng tôi thấy: - PP 1: Sử dụng detector khối phổ, PP này có ưu điểm giới hạn định lượng đạt yêu cầu (1ng/ml) với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản bằng tủa protein, đồng thời định lượng DTZ và 2 chất chuyển hóa chính.