ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dược thì lĩnh vực đánh giá kiểm tra chất lượng thuốc có một vai trò rất quan trọng. Theo quan điểm sinh dược học đánh giá chất lượng thuốc không chỉ thông qua các chỉ tiêu hoá lý thông thường như định tính, định lượng, độ rã, độ hoà tan … như quy định trong dược điển mà phải bằng đánh giá sinh khả dụng (SKD)và tương đương sinh học (TĐSH) [6]. Nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH đã được các doanh nghiệp dược Việt Nam quan tâm trong vài năm gần đây. Nhờ đó, các nhà sản xuất có thể lựa chọn công thức, kỹ thuật bào chế tối ưu để tạo ra các sản phẩm có chất lượng tương đương với thuốc phát minh.
Đồng thời, các nghiên cứu này còn cung cấp thêm bằng chứng chất lượng làm cơ sở cho bác sỹ lựa chọn thuốc thay thế hoặc điều chỉnh liều trong thực hành lâm sàng. Trên thế giới, các nước có nền công nghiệp dược phát triển và một số nước trong khu vực đã qui định danh mục các loại chế phẩm cần phải xem xét kết quả nghiên cứu SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành thuốc [17,29]. Hầu hết các thuốc có khoảng điều trị hẹp, có dược động học bất thường, thuốc phóng thích chậm, thuốc tim mạch đều thuộc nhóm nằm trong danh mục bắt buộc phải nghiên cứu. Trước xu thế hội nhập và nhu cầu nâng cao chất lượng điều trị, Bộ Y tế đã ban hành thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26/4/2010 về việc Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học trong đăng ký thuốc.
Tại thông tư này, Bộ Y tế đã đưa ra nguyên tắc lựa chọn dược chất đưa vào danh mục bắt buộc phải nghiên cứu SKD hoặc TĐSH gồm các nhóm thuốc ưu tiên: thuốc tim mạch, chống co giật, kháng sinh… Đồng thời, thông tư này cũng qui định giới hạn với (1) các thuốc generic ở dạng bào chế quy ước có chứa 12 dược chất trong danh mục và (2) những thuốc bào chế ở dạng phóng thích biến đổi. Dilitiazem (DTZ) là một thuốc tim mạch có tác dụng chẹn kênh calci được sử dụng rộng rãi trong điều trị dự phòng các cơn đau thắt ngực, một loại -1- bệnh có tỷ lệ ngày càng tăng ở Việt Nam. Trên thị trường hiện nay hoạt chất này được bào chế ở cả 2 dạng thuốc qui ước và phóng thích biến đổi. Một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất dạng bào chế phóng thích biến đổi có chứa hoạt chất này, do vậy nhu cầu nghiên cứu về SKD, TĐSH đối với DTZ là điều cần thiết và xuất phát từ thực tế.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH các thuốc nói chung và DTZ nói riêng, một trong những nội dung quan trọng đầu tiên là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…). Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp; mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với dược chất nên việc phân tách để định lượng gặp nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được thẩm định chặt chẽ theo những qui định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.
Hệ thống phân tích LC/MS/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều kiện cho các nhà khoa học dược thực hiện được các nghiên cứu sinh khả dụng phức tạp. Với ưu điểm vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu cao, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp dụng nhiều trong nghiên cứu các chế phẩm có hàm lượng thấp. Tuy nhiên, ở Việt Nam kỹ thuật này còn rất mới mẻ và khả năng ứng dụng còn hạn chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)” với các mục tiêu sau: 1.
Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu và định lượng DTZ trong huyết tương người bằng LC-MS 2. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng. TỔNG QUAN VỀ DILTIAZEM 1. Đặc điểm cấu tạo và tính chất hóa lý [24,28] a.
Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C22H26N2O4S. HCl - Khối lượng phân tử: 450.98 g/mol - Tên khoa học: 1,5-Benzothiazepin-4(5H)-one,3-(acetyloxy)-5-[2- (dimethylamino)ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyphenyl), monohydrochloride, b. Tính chất vật lý, hóa học: - Bột kết tinh hoặc tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi. - Nhiệt độ nóng chảy: Từ 207,50 C đến 212,00 C.
- Hệ số phân bố: Log P(octanol/nước) = 2,79. - Dạng muối tan tốt trong nước, và acid formic, it tan trong ethanol, không tan trong ether. Dạng base tan tốt trong cloroform, ether. Do đó khi chiết DTZ trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng nên kiềm hóa -3- để chuyển sang dạng base rồi chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực như cloroform, diclormethan, diethyl ether, n-hexan… - Dạng dược dụng thường kết hợp với 1 phân tử acid hydrocloric nên có thể định lượng DTZ theo phương pháp chuẩn độ bạc nitrat.
- Phổ hấp thụ UV-Vis: Đỉnh hấp thụ trong dung dịch acid H 2SO4 0,2M là 236 nm, trong dung dịch kiềm là 237 nm. Do đó với dạng nguyên liệu và chế phẩm có thể định lượng bằng cách đo trực tiếp phổ hấp thụ UV hoặc HPLC với detector UV. - Góc quay cực riêng: + 1100 đến + 1160+. Tác dụng dược lý, dược động học: a.
Tác dụng dược lý [3,4,5,21] Diltiazem là một dẫn chất của benzothiazepin có tác dụng chẹn kênh calci gây giãn động mạch vành và mạch ngoại vi. Ngoài ra nó còn làm chậm dẫn truyền điện tử của cơ tim do đó làm chậm nhịp tim, giảm co bóp cơ tim và làm chậm dẫn truyền nút nhĩ thất. Thuốc được sử dụng trong điều trị đau thắt ngực và tăng huyết áp. Dược động học [16,23,25,26]: - Thuốc được hấp thu nhanh theo đường tiêu hóa, không bị ảnh hưởng bởi thức ăn.
Trong thực tế bệnh nhân thường được khuyên dùng ngay trước bữa ăn để tránh quên thuốc. Thuốc bị chuyển hóa qua gan lần đầu, tạo thành nhiều chất chuyển hóa khác nhau. Tỷ lệ thuốc liên kết với protein cao (khoảng 80 - 85%). Vì vậy khi dùng liều duy nhất 60 mg DTZ, nồng độ thuốc trong huyết tương đạt cực đại khoảng 200 ng/ml.
Thể tích phân bố biểu kiến từ 3 đến 8 l/kg, đào thải chủ yếu qua phân, chỉ có khoảng 2 – 4 % đào thải dạng không biến đổi qua nước tiểu. Thời gian bán thải khoảng 3 - 8 giờ. -4- - Sản phẩm chuyển hóa bao gồm: o Deacetyl diltiazem(1) o N mono demethyl diltiazem(2) o Deacetyl-N-monodemethyl diltiazem(3) o Deacetyl diltiazemN-oxid(4) o Deacetyl O-demethyl diltiazem(5) o Deacetyl N,O-didemethyl diltiazem(6) - Khi xây dựng phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học phương pháp cần có giới hạn định lượng dưới khoảng 7 - 10 ng/ml (1/20 đến 1/30 Cmax) để đảm bảo AUCt > 80% AUC∞. Chỉ định và cách dùng [3,4,5] Liều thông thường: Uống 60 mg, 3 lần một ngày ngay trước khi ăn.
Ðiều trị đau thắt ngực: Uống 60 mg diltiazem, 3 lần một ngày; hoặc khởi đầu bằng liều 30 mg, 4 lần một ngày, tăng liều khi cần thiết trong khoảng 1 - 2 ngày sau. Ðối với người bệnh bị đau thắt ngực không ổn định, có thể dùng viên giải phóng chậm với liều từ 360 - 480 mg hàng ngày. Ðiều trị tăng huyết áp: Dùng viên nén hoặc nang giải phóng chậm với liều ban đầu khoảng 60 - 120 mg, 2 lần một ngày; cứ 14 ngày một lần, có thể tăng liều nếu cần thiết tới liều tối đa mỗi ngày là 360 mg. Lưu ý khác khi dùng thuốc [21] - Tác dụng phụ : Thuốc có thể gây khó chịu ít nhiều ở một số người bệnh.
Khoảng 30% người bệnh dùng thuốc được ghi nhận gặp tác dụng không mong muốn liên quan đến khả năng gây giãn mạch của diltiazem. Những biểu hiện hay gặp nhất là nhức đầu, buồn nôn, chóng mặt và phù cổ chân. -5- - Chống chỉ định: o Rối loạn hoạt động nút xoang, blốc nhĩ thất độ 2 và độ 3. o Mẫn cảm với diltiazem.
o Suy thất trái kèm theo sung huyết phổi. o Nhịp tim chậm dưới 50 phút. Một số phương pháp định lượng DTZ trong dịch sinh học Đặc thù của phân tích thuốc trong dịch sinh học là phức tạp, lẫn nhiều tap chất, nồng độ hoạt chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên đòi hỏi những yêu cầu cơ bản sau: - Tính đặc hiệu cao: phân biệt được DTZ với các tạp chất lẫn trong mẫu, đặc biệt là chất chuyển hóa có công thức tương tự. - Độ nhạy cao: nồng độ thuốc trong dịch sinh học thường rất thấp, đòi hỏi phương pháp phải có độ nhạy cao.
Thời gian phân tích mẫu càng ngắn càng tốt: số lượng mẫu phân tích trong đánh giá TĐSH rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có thể ảnh hưởng tới kết quả phân tích. Một số phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học được tổng hợp ở bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích DTZ trong huyết tương Thời gian Phương pháp LLOQ Stt Tài liệu Xử lý mẫu phân tích mẫu phân tích (ng/ml) (phút) LC – MS/MS 1 [12] Kết tủa protein bằng acetonitrile 15 1 ESI HPLC – UV 2 [32] Chiết pha rắn (SPE) 10 20 215 nm HPLC – UV 3 [9] Chiết pha rắn (SPE) 15 2,5 238 nm Chiết lỏng – lỏng bằng ethyl (LC/MS/MS) 4 [18] acetate 2 2 ESI(+) Hiệu suất chiết 50.8% Chiết lỏng – lỏng bằng hexane – HPLC - UV 5 [19] chloroform - isopropanol 12 3 239 nm (60:40:5) Kiềm hóa bằng dung dịch KHCO3 0,01M, rồi chiết bằng ethyl acetate. Tiếp tục chiết bằng HPLC - UV 6 [14] 15 5 HCl 0,01 M đem bay hơi dưới dòng khí nitơ sau đó hòa tan cắn bằng HCl 0.002 M Kiềm hóa bằng amoni sulfat rồi 7 [13] chiết lỏng – lỏng bằng methyl-ter- HPLC - FL 9 2 butyl ether -7- (LC/MS/MS) 8 [22] Chiết pha rắn (SPE) 3 1 ESI(+) Kiềm hóa bằng amoni sulfat rồi HPLC – UV 9 [7] 14 10 chiết bằng ethyl acetate. 254 nm Kiềm hóa rồi chiết lỏng – lỏng HPLC – UV 10 [8] 15 1 bằng ter-butyl methyl ether 240 nm Từ các kết quả nghiên cứu về định lượng DTZ trong huyết tương, chúng tôi thấy: - PP 1: Sử dụng detector khối phổ, PP này có ưu điểm giới hạn định lượng đạt yêu cầu (1ng/ml) với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản bằng tủa protein, đồng thời định lượng DTZ và 2 chất chuyển hóa chính.