Nghiên cứu phát hiện đột biến gene CALR type 1 và type 2 trong bệnh lý huyết học tại Hà Nội

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện đột biến gene CALR type 1 và type 2 ở bệnh nhân hội chứng tăng sinh tủy âm tính với JAK2V617F.

• Tác giả: Phạm Thị Phương Thảo
• Người hướng dẫn: Ts. Dương Quốc Chính
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học
• Đề tài: Nghiên cứu phát hiện đột biến gene CALR và JAK2 trong bệnh lý huyết học
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về hội chứng tăng sinh tuỷ
• 1.2. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học
• 1.3. Cơ chế sinh bệnh
• 1.4. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng rối loạn tăng sinh tuỷ
• 1.5. Tổng quan về gen CALR
• 1.6. Đặc điểm di truyền của gen CALR
• 1.7. Vai trò của gen CALR trong hội chứng tăng sinh tuỷ
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tiêu chuẩn lựa chọn
• 2.2. Tiêu chuẩn loại trừ
• 2.3. Phương pháp chọn mẫu
• 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.5. Thời gian nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7. Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang
• 2.8. Phương pháp nghiên cứu
• 2.9. Vật tư, hóa chất và trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
• 2.10. Quy trình nghiên cứu
• 2.11. Quy trình kỹ chiết DNA tủy xương
• 2.12. Kiểm tra, đánh giá năng độ DNA trên máy quang phổ Nano Drop
• 2.13. Kỹ thuật PCR trong phát hiện đột biến CALR type 1 và type 2
• 2.14. Quản lý và phân tích số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân nghiên cứu
• 3.2. Đặc điểm về giới tính của nhóm nghiên cứu
• 3.3. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu
• 3.4. Đặc điểm về các thể bệnh của nhóm nghiên cứu
• 3.5. Xây dựng và hoàn thiện quy trình PCR phát hiện đột biến CALR type 1 và type 2
• 3.6. Nghiên cứu các cặp mồi cho qui trình PCR
• 3.7. Các cặp mồi suy biến cho đột biến CALR type 1
• 3.8. Các cặp mồi đặc hiệu cho đột biến CALR type 2
• 3.9. Tái ủ nhiệt độ kỹ thuật PCR phát hiện đột biến CALR
• 3.10. Kết quả ứng dụng quy trình PCR phát hiện đột biến CALR type 1 và type 2
• 3.11. Đặc điểm, phân bố hai loại đột biến gen CALR trong nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đột biến gene CALR và JAK2 trong bệnh lý huyết học

Đột biến gene CALR và JAK2 là hai yếu tố quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý huyết học, đặc biệt là hội chứng tăng sinh tủy (MPNs). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến JAK2V617F xuất hiện ở khoảng 95% bệnh nhân mắc bệnh đa hồng cầu nguyên phát và 50% bệnh nhân mắc bệnh tăng tiểu cầu tiên phát. Trong khi đó, đột biến gene CALR đã được xác định là một dấu hiệu chẩn đoán quan trọng cho những bệnh nhân âm tính với JAK2. Việc phát hiện sớm các đột biến này có thể giúp cải thiện kết quả điều trị và tiên lượng cho bệnh nhân.

1.1. Định nghĩa và vai trò của gene CALR và JAK2

Gene CALR mã hóa cho protein Calreticulin, có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phát triển và chức năng của tế bào. Gene JAK2, ngược lại, là một phần của con đường truyền tín hiệu cho các yếu tố tăng trưởng huyết học. Sự đột biến ở hai gene này có thể dẫn đến rối loạn sản xuất tế bào máu.

1.2. Tình hình nghiên cứu hiện tại về CALR và JAK2

Nghiên cứu về đột biến gene CALR và JAK2 đang ngày càng được chú trọng. Các phương pháp như PCR và NGS đang được áp dụng để phát hiện các đột biến này, giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và điều trị.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện đột biến gene CALR và JAK2

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong việc phát hiện đột biến gene CALR và JAK2, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc áp dụng các phương pháp này vào thực tiễn lâm sàng. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự thiếu hụt các bộ kit xét nghiệm phù hợp tại Việt Nam, dẫn đến khó khăn trong việc chẩn đoán chính xác. Ngoài ra, việc đào tạo nhân lực có chuyên môn cao cũng là một thách thức lớn.

2.1. Khó khăn trong việc tiếp cận công nghệ xét nghiệm hiện đại

Nhiều cơ sở y tế vẫn chưa có đủ trang thiết bị và công nghệ để thực hiện các xét nghiệm phát hiện đột biến gene CALR và JAK2. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán không chính xác và chậm trễ trong điều trị.

2.2. Thiếu hụt nhân lực chuyên môn trong lĩnh vực xét nghiệm

Việc thiếu hụt nhân lực có chuyên môn trong lĩnh vực xét nghiệm gene cũng là một vấn đề lớn. Điều này ảnh hưởng đến khả năng thực hiện và phân tích kết quả xét nghiệm một cách chính xác.

III. Phương pháp phát hiện đột biến gene CALR và JAK2 hiệu quả

Để phát hiện đột biến gene CALR và JAK2, các phương pháp như PCR, AS-PCR và NGS đã được áp dụng rộng rãi. Những phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán. Việc sử dụng các kỹ thuật này có thể giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và hiệu quả hơn.

3.1. Kỹ thuật PCR trong phát hiện đột biến gene

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những phương pháp phổ biến nhất để phát hiện đột biến gene. Phương pháp này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể, giúp dễ dàng phát hiện các đột biến.

3.2. Ứng dụng NGS trong nghiên cứu gene CALR và JAK2

Next Generation Sequencing (NGS) là một công nghệ tiên tiến cho phép giải trình tự gene một cách nhanh chóng và chính xác. NGS giúp phát hiện nhiều loại đột biến trong cùng một lần xét nghiệm, từ đó nâng cao khả năng chẩn đoán.

IV. Ứng dụng thực tiễn của việc phát hiện đột biến gene CALR và JAK2

Việc phát hiện đột biến gene CALR và JAK2 không chỉ có ý nghĩa trong chẩn đoán mà còn trong điều trị bệnh lý huyết học. Các bác sĩ có thể dựa vào kết quả xét nghiệm để đưa ra phác đồ điều trị phù hợp, từ đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng bệnh nhân có đột biến gene CALR thường có tiên lượng tốt hơn so với những bệnh nhân có đột biến JAK2.

4.1. Tác động của đột biến gene đến tiên lượng bệnh

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh nhân có đột biến gene CALR thường có tiên lượng tốt hơn so với bệnh nhân có đột biến JAK2. Điều này có thể giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị hiệu quả hơn.

4.2. Vai trò của xét nghiệm gene trong điều trị cá thể hóa

Xét nghiệm gene giúp xác định các đặc điểm di truyền của bệnh nhân, từ đó cho phép điều trị cá thể hóa, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về gene CALR và JAK2

Nghiên cứu về đột biến gene CALR và JAK2 đang mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực huyết học. Việc phát hiện sớm và chính xác các đột biến này có thể giúp cải thiện đáng kể kết quả điều trị cho bệnh nhân. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp xét nghiệm mới để nâng cao độ chính xác và khả năng tiếp cận cho tất cả bệnh nhân.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp xét nghiệm mới và cải thiện quy trình chẩn đoán để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong điều trị bệnh lý huyết học.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức về đột biến gene

Nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của việc phát hiện đột biến gene CALR và JAK2 trong cộng đồng y tế là rất cần thiết. Điều này sẽ giúp cải thiện chất lượng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hội chứng tăng sinh tủy (Myeloproliferative Neoplasms - MPNs) là nhóm bệnh lý ác tính dòng tế bào máu phát sinh từ sự tăng sinh vô tính của các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương. Nhóm bệnh này bao gồm các thể kinh điển không có nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph âm tính) như Tăng tiểu cầu tiên phát (Essential Thrombocythaemia - ET), Đa hồng cầu nguyên phát (Polycythaemia Vera - PV) và Xơ tủy nguyên phát (Primary Myelofibrosis - PMF). Bên cạnh đột biến phổ biến JAK2V617F, các đột biến trên exon 9 của gene CALR (Calreticulin) được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công nhận là tiêu chuẩn chẩn đoán quan trọng, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân âm tính với JAK2V617F.

Đột biến gene CALR chủ yếu bao gồm hai dạng: Type 1 (mất đoạn 52 nucleotide) chiếm khoảng 50% và Type 2 (chèn 5 nucleotide TTGTC) chiếm khoảng 30% các trường hợp đột biến CALR. Mặc dù các kỹ thuật như Real-time PCR hay giải trình tự thế hệ mới (NGS) có thể phát hiện đột biến này, kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) kết hợp điện di thông thường có ưu điểm về chi phí thấp, thời gian thực hiện nhanh (khoảng 1 giờ 10 phút), phù hợp với điều kiện cơ sở xét nghiệm tại Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai mục tiêu:

1. Xây dựng quy trình xét nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện đột biến gene CALR ở những bệnh nhân mắc hội chứng tăng sinh tủy âm tính với JAK2V617F.
2. Bước đầu áp dụng quy trình vào phát hiện đột biến gene CALR type 1 và type 2 ở những bệnh nhân tăng sinh tủy.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 196 bệnh nhân được chẩn đoán mắc hội chứng tăng sinh tủy mạn âm tính với đột biến JAK2V617F theo tiêu chuẩn WHO 2016.
• Không gian nghiên cứu: Khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2022 đến tháng 05/2023 (thời gian thu thập mẫu từ tháng 12/2022 đến hết tháng 01/2023; thời gian tối ưu hóa và hoàn thiện quy trình từ tháng 12/2022 đến tháng 05/2023).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên phân loại các khối u dòng tủy của Tổ chức Y tế Thế giới sửa đổi năm 2016 (WHO 2016), lý thuyết bệnh sinh phân tử của MPNs liên quan đến các đột biến kích hoạt con đường tín hiệu JAK-STAT (JAK2, CALR, MPL), và cấu trúc phân tử của gene CALR nằm trên nhiễm sắc thể số 19 (gồm 9 exon, dài 4,2 kb). Đột biến mất đoạn (Type 1) hoặc chèn đoạn (Type 2) trên exon 9 làm thay đổi khung đọc mã ở đầu C của protein Calreticulin, làm mất tín hiệu lưu giữ mạng lưới nội chất KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu), dẫn đến quá trình tăng sinh bất thường của các dòng tế bào máu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang:

• Nguồn mẫu: Mẫu máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA của 196 bệnh nhân, được bảo quản ở tủ âm sâu (-80°C).
• Kỹ thuật tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp tách chiết DNA tổng số tự động bằng hạt từ (Magnetic Particles) trên hệ thống đĩa 96 giếng sâu với chương trình Blood_DNA_M6399.
• Kiểm tra chất lượng DNA: Định lượng nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng máy quang phổ NanoDrop (Titertek-Berthold) dựa trên định luật Beer-Lambert ($A = \varepsilon \cdot C \cdot L$) ở bước sóng 260 nm và 280 nm; đánh giá tỷ số $A_{260}/A_{280}$ đạt ngưỡng tinh sạch từ 1,8 đến 2,0.
• Kỹ thuật PCR: Sử dụng hóa chất pha sẵn 2X GoTaq Green Master Mix (Promega) trên máy luân nhiệt ProFlex PCR System (Thermo Fisher Scientific).
  • Phản ứng phát hiện đột biến Type 1: Thiết kế cặp mồi suy biến gồm mồi xuôi CALRx9F và mồi ngược đột biến CALR-type1_mutR (tạo sai khác có chủ ý ở base thứ 3 đầu 3' từ G thành T).
  • Phản ứng phát hiện đột biến Type 2: Thiết kế hệ thống 3 mồi đặc hiệu gồm CALRx9F, CALRx9R và CALR-type2_mutR.
• Kỹ thuật điện di: Điện di trên gel Agarose nồng độ 2,5% trong dung dịch đệm TBE (Tris-Borate-EDTA), nhuộm bằng Ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới tia tử ngoại trên hệ thống UVP MultiDoc (Analytik Jena) kết hợp phần mềm VisionWorks.
• Xử lý số liệu: Quản lý và xử lý dữ liệu bằng phần mềm SPSS và Microsoft Excel; áp dụng các thuật toán thống kê mô tả (tần số, tỷ lệ phần trăm, trung bình, độ lệch chuẩn) và kiểm định suy luận (Student's t-test, Chi-square $\chi^2$, Fisher's exact test).

Thông số kỹ thuật	Phát hiện đột biến CALR Type 1	Phát hiện đột biến CALR Type 2
Dạng đột biến	Mất đoạn 52 nucleotide (del52)	Chèn đoạn 5 nucleotide (insTTGTC)
Hệ thống mồi	Cặp mồi suy biến: CALRx9F & CALR-type1_mutR	Hệ thống 3 mồi: CALRx9F, CALRx9R & CALR-type2_mutR
Kích thước băng nội kiểm	141 bp	265 bp (hoặc 270 bp)
Kích thước băng đột biến	89 bp	156 bp
Nhiệt độ gắn mồi tối ưu	60°C	60°C
Hóa chất khuếch đại	2X GoTaq Green Master Mix	2X GoTaq Green Master Mix
Chế độ điện di	Gel Agarose 2,5% trong đệm TBE	Gel Agarose 2,5% trong đệm TBE

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về hội chứng tăng sinh tủy mạn và các đột biến gene liên quan:

• Lịch sử nghiên cứu từ khái niệm ban đầu của William Dameshek (1951) đến các sửa đổi phân loại của WHO (2008, 2016).
• Cơ chế sinh bệnh học: Sự xuất hiện các đột biến soma tại tế bào gốc tạo máu (HSC) kích hoạt không kiểm soát các dòng tế bào tủy.
• Tổng quan về ba nhóm đột biến gene driver chính trong MPNs Ph âm tính: JAK2 (đột biến JAK2V617F chiếm 95% ở PV, 50% ở ET và PMF), MPL (chiếm khoảng 5% ở PMF) và CALR (chiếm 20–30% ở các trường hợp ET và PMF âm tính với JAK2 và MPL).
• Đặc điểm phân tử của gene CALR: Nằm trên nhiễm sắc thể 19, dài 4,2 kb gồm 9 exon. Protein Calreticulin có vai trò chaperone kiểm soát sự gấp nếp protein và điều hòa cân bằng ion canxi trong mạng lưới nội chất.
• Cơ chế đột biến exon 9 của CALR: Mất đoạn 52 nucleotide (Type 1) hoặc chèn 5 nucleotide TTGTC (Type 2) làm biến đổi đầu tận C-terminus, triệt tiêu tín hiệu KDEL, dẫn đến kích hoạt con đường JAK-STAT.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết các bước triển khai thực nghiệm và tiêu chuẩn lựa chọn mẫu:

• Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân được chẩn đoán tăng sinh tủy mạn theo WHO 2016, đã được xét nghiệm JAK2V617F bằng PCR (đạt chứng chỉ ISO 15189) cho kết quả âm tính.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân MPN có Ph dương tính, tăng sinh tủy chưa phân loại, hoặc các trường hợp tăng tế bào máu thứ phát (sau cắt lách, phản ứng do lao, tăng hồng cầu/tiểu cầu thứ phát).
• Quy trình chiết tách DNA: Quy trình hạt từ tự động qua các bước phá màng (AL Buffer), rửa sạch tạp chất (VHB Buffer, SPM Buffer) và thu hồi DNA (Elution Buffer), kiểm tra độ hấp thụ quang học.
• Thiết kế mồi và tối ưu nhiệt độ: Trình bày chi tiết cấu trúc các đoạn mồi và thử nghiệm luân nhiệt ở ba mức nhiệt độ gắn mồi: 55°C, 60°C và 65°C với 40 chu kỳ luân nhiệt.
• Vấn đề đạo đức: Nghiên cứu được thông qua bởi Lãnh đạo Viện và Phòng Kế hoạch tổng hợp Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, bảo mật toàn bộ thông tin cá nhân của bệnh nhân.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ 196 bệnh nhân và kết quả tối ưu hóa quy trình PCR:

• Đặc điểm nhân khẩu học:
  • Tỷ lệ nam giới là 61,22% (120/196), nữ giới là 38,78% (76/196).
  • Độ tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu là 54,48 tuổi (nhỏ nhất: 2 tuổi, lớn nhất: 93 tuổi); tập trung nhiều nhất ở nhóm 34–63 tuổi (54,59%).
  • Phân bố thể bệnh: Tăng tiểu cầu tiên phát (ET) chiếm 62,76% (123 BN); Tăng hồng cầu vô căn (PV) chiếm 27,04% (53 BN); Loạn sản tủy và tăng sinh tủy chưa phân loại (MPN-U) chiếm 8,16% (16 BN); Xơ tủy cấp/nguyên phát chiếm 2,04% (4 BN).
• Kết quả tối ưu hóa nhiệt độ PCR:
  • Ở 55°C: Xuất hiện nhiều băng sản phẩm phụ gây nhiễu, xuất hiện băng có kích thước tương tự băng đột biến ở mẫu âm tính (dương tính giả).
  • Ở 65°C: Băng sản phẩm mờ và mảnh.
  • Ở 60°C: Phản ứng cho kết quả tối ưu nhất với băng nội kiểm và băng đặc hiệu đột biến rõ nét, không xuất hiện băng phụ.
• Tỷ lệ phát hiện đột biến CALR trên 196 bệnh nhân:
  • Âm tính với cả hai type: 166 bệnh nhân (84,69%).
  • Dương tính với đột biến CALR: 30 bệnh nhân (15,31%). Trong đó, Type 1 chiếm 10,71% (21/196) và Type 2 chiếm 4,59% (9/196). Tỷ lệ Type 1 / Type 2 trong số các ca dương tính là 70% (21/30) so với 30% (9/30).
  • Phân bố theo thể bệnh: Ở nhóm ET, tỷ lệ đột biến Type 1 là 17,07% (21/123) và Type 2 là 6,50% (8/123). Ở nhóm PV có 1 ca mang Type 2 (1,89%). Ở nhóm MPN-U có 1 ca mang Type 1 (6,25%). Nhóm xơ tủy (n=4) không ghi nhận trường hợp dương tính ($p = 0,038$).
  • Phân bố theo giới tính và tuổi: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mang đột biến giữa nam và nữ ($p > 0,05$) cũng như giữa các nhóm tuổi ($p > 0,05$).

Chương 4: Bàn luận

Tác giả phân tích, so sánh các kết quả đạt được với y văn trong nước và quốc tế:

• Đặc điểm dịch tễ về giới tính và độ tuổi trung bình (54,48 tuổi) tương đồng với công bố của tác giả Y. Yap và cộng sự (2018).
• Cơ chế thiết kế mồi: Lý giải việc đưa sai khác chủ ý tại nucleotide thứ 3 ở đầu 3' của mồi ngược trong đột biến Type 1 nhằm ngăn chặn hiện tượng bắt cặp chéo với alen kiểu dại do vùng đứt gãy 52 bp tạo ra trình tự tương đồng. Đối với Type 2, việc sử dụng 3 mồi giúp phân tách rõ ràng sản phẩm đột biến chèn 5 bp với các dạng đột biến tương tự.
• Tỷ lệ đột biến CALR Type 1 (70%) và Type 2 (30%) trong nhóm dương tính hoàn toàn phù hợp với công bố của Chi J và cộng sự (2014) và Lin Yani. Tỷ lệ đột biến CALR ở nhóm ET đạt 23,57%, tương đương các nghiên cứu quốc tế. Việc chưa phát hiện đột biến ở nhóm PMF được lý giải là do số lượng mẫu xơ tủy thu thập trong nghiên cứu còn nhỏ ($n = 4$).

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính từ số liệu thực nghiệm

Đặc điểm phân bố	Tổng số mẫu ($n=196$)	CALR Type 1 ($n=21$)	CALR Type 2 ($n=9$)	Âm tính ($n=166$)	Giá trị $p$
Tổng tỷ lệ	100%	10,71% (21 BN)	4,59% (9 BN)	84,69% (166 BN)	-
Theo thể bệnh
- Tăng tiểu cầu tiên phát (ET)	123 BN	17,07% (21 BN)	6,50% (8 BN)	76,42% (94 BN)	$p = 0,038$
- Tăng hồng cầu vô căn (PV)	53 BN	0,00% (0 BN)	1,89% (1 BN)	98,11% (52 BN)
- Tăng sinh tủy chưa phân loại (MPN-U)	16 BN	6,25% (1 BN)	0,00% (0 BN)	93,75% (15 BN)
- Xơ tủy cấp / PMF	4 BN	0,00% (0 BN)	0,00% (0 BN)	100,0% (4 BN)
Theo giới tính
- Nam ($n=120$)	61,22%	47,62% (10 BN)	55,56% (5 BN)	-	$p > 0,05$
- Nữ ($n=76$)	38,78%	52,38% (11 BN)	44,44% (4 BN)	-
Theo nhóm tuổi
- $\le 33$ tuổi ($n=22$)	11,22%	4,76% (1 BN)	11,11% (1 BN)	-	$p > 0,05$
- 34 – 63 tuổi ($n=107$)	54,59%	38,10% (8 BN)	66,67% (6 BN)	-
- $> 63$ tuổi ($n=67$)	34,18%	57,14% (12 BN)	22,22% (2 BN)	-

Giải pháp và đề xuất của tác giả

• Đề xuất tiến hành nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn, đặc biệt mở rộng số lượng bệnh nhân thuộc nhóm xơ tủy nguyên phát (PMF) để đánh giá toàn diện tần suất đột biến.
• Hướng đến việc đưa quy trình PCR phát hiện đột biến CALR type 1 và type 2 vào ứng dụng xét nghiệm thường quy tại các đơn vị lâm sàng và xét nghiệm huyết học.
• Mở rộng phạm vi nghiên cứu phát hiện đột biến trên đối tượng mẫu RNA của bệnh nhân.

Đóng góp của nghiên cứu

• Thiết kế thành công hệ thống mồi suy biến (Type 1) và mồi đặc hiệu (Type 2), giải quyết triệt để vấn đề bắt cặp sai và dương tính giả trên exon 9 của gene CALR.
• Chuẩn hóa điều kiện luân nhiệt với nhiệt độ gắn mồi tối ưu 60°C, cho phép thực hiện đồng thời quy trình xét nghiệm cho cả hai dạng đột biến với thời gian phản ứng ngắn và chi phí tiết kiệm.
• Cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử thực nghiệm về đột biến CALR trên quần thể 196 bệnh nhân MPN Ph âm tính tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế về cỡ mẫu phân nhóm: Số lượng bệnh nhân thuộc thể Xơ tủy nguyên phát/Xơ tủy cấp thu thập được còn rất thấp ($n = 4$, chiếm 2,04%), chưa đủ đại diện để phát hiện đột biến CALR ở thể bệnh này.
• Phạm vi dạng đột biến: Nghiên cứu chỉ tập trung thiết kế quy trình phát hiện hai dạng đột biến phổ biến nhất là Type 1 (del52) và Type 2 (ins5), chưa bao quát các biến thể hiếm gặp khác trên exon 9 của gene CALR.
• Vật liệu di truyền: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc tối ưu hóa và đánh giá trên mẫu DNA tổng số tách chiết từ máu/tủy xương.
• Hướng mở tiếp theo: Tác giả đề xuất mở rộng nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn ở nhóm bệnh nhân ET và PMF, đồng thời triển khai nghiên cứu phát hiện đột biến trên mẫu vật liệu RNA.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên chuyên ngành Kỹ thuật xét nghiệm y học, Huyết học – Truyền máu, Di truyền y học và Sinh học phân tử.
• Nội dung tham khảo trọng tâm:
  • Kỹ thuật thiết kế mồi suy biến (degenerate primer design) nhằm khắc phục hiện tượng bắt cặp chéo khi khuếch đại các đoạn lặp nucleotide hoặc đột biến mất đoạn lớn.
  • Quy trình chiết tách DNA tự động bằng hạt từ trên đĩa 96 giếng và các thông số tối ưu nhiệt độ chu trình PCR trong chẩn đoán sinh học phân tử lâm sàng.
  • Số liệu thực tế về phân bố thể bệnh và tỷ lệ đột biến CALR ở bệnh nhân MPNs âm tính với JAK2V617F tại Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật PCR trong khóa luận phát hiện những dạng đột biến cụ thể nào của gene CALR?

Quy trình tập trung phát hiện hai dạng đột biến phổ biến nhất trên exon 9 của gene CALR: Đột biến Type 1 (mất đoạn 52 nucleotide - del52) và Đột biến Type 2 (chèn 5 nucleotide TTGTC - insTTGTC).

2. Kích thước các sản phẩm khuếch đại (băng điện di) của phản ứng PCR là bao nhiêu?

• Đối với Type 1: Băng nội kiểm có kích thước 141 bp và băng đặc hiệu đột biến có kích thước 89 bp.
• Đối với Type 2: Băng nội kiểm có kích thước 265 bp (hoặc 270 bp) và băng đặc hiệu đột biến có kích thước 156 bp.

3. Nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature) tối ưu được lựa chọn cho phản ứng PCR là bao nhiêu?

Nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cả hai phản ứng phát hiện đột biến CALR Type 1 và Type 2 là 60°C. Thử nghiệm cho thấy ở 55°C xuất hiện nhiều băng phụ gây dương tính giả, trong khi ở 65°C băng sản phẩm bị mờ và mảnh.

4. Tỷ lệ đột biến CALR ghi nhận được trên nhóm bệnh nhân Tăng tiểu cầu tiên phát (ET) là bao nhiêu?

Trong tổng số 123 bệnh nhân Tăng tiểu cầu tiên phát (ET) âm tính với JAK2V617F, tỷ lệ mang đột biến CALR Type 1 là 17,07% (21 bệnh nhân) và Type 2 là 6,50% (8 bệnh nhân). Tổng tỷ lệ mang đột biến CALR ở nhóm bệnh nhân ET là 23,57% (29/123 bệnh nhân).

5. Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm những gì?

• Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân được chẩn đoán tăng sinh tủy mạn theo WHO 2016 và đã có kết quả xét nghiệm JAK2V617F âm tính bằng kỹ thuật PCR đạt chuẩn ISO 15189.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân MPN có nhiễm sắc thể Philadelphia dương tính [Ph(+)], tăng sinh tủy chưa xếp loại, hoặc tăng sinh tủy thứ phát (sau cắt lách, phản ứng do lao, tăng hồng cầu/tiểu cầu thứ phát).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Phương Thảo đã hoàn thành việc xây dựng và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật PCR phát hiện đột biến gene CALR Type 1 và Type 2 với nhiệt độ gắn mồi tối ưu 60°C. Thử nghiệm áp dụng trên 196 bệnh nhân mắc hội chứng tăng sinh tủy âm tính với JAK2V617F tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương đã xác định tỷ lệ dương tính chung với đột biến CALR là 15,31% (trong đó Type 1 chiếm 10,71% và Type 2 chiếm 4,59%), chủ yếu tập trung ở nhóm bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát (23,57%). Công trình cung cấp quy trình xét nghiệm sinh học phân tử có độ tin cậy, thời gian thực hiện nhanh và chi phí hợp lý, tạo cơ sở để mở rộng ứng dụng thường quy trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh lý huyết học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đ¾I HàC QUÞC GIA HÀ NÞI TR¯âNG Đ¾I HàC Y D¯þC Ph¿m Thß Ph°¢ng ThÁo ĄNG DĀNG KĀ THUÂT PCR Đ PHÁT HIàN ĐÞT BI¾N GENE CALR TYPE 1 VÀ TYPE 2 ä NHĀNG BàNH NHÂN MÄC HÞI CHĄNG TNG SINH TĂY ÂM TÍNH VàI ĐÞT BI¾N JAK2V617F KHÓA LUÂN TÞT NGHIàP Đ¾I HàC NGÀNH K) THUÂT XÉT NGHIàM Y HàC Hà Nßi - 2023 Đ¾I HàC QUÞC GIA HÀ NÞI TR¯âNG Đ¾I HàC Y D¯þC Ph¿m Thß Ph°¢ng ThÁo ĄNG DĀNG KĀ THUÂT PCR Đ PHÁT HIàN ĐÞT BI¾N GENE CALR TYPE 1 VÀ TYPE 2 ä NHĀNG BàNH NHÂN MÄC HÞI CHĄNG TNG SINH TĂY ÂM TÍNH VàI ĐÞT BI¾N JAK2V617F KHÓA LUÂN TÞT NGHIàP Đ¾I HàC NGÀNH K) THUÂT XÉT NGHIàM Y HàC Cán bß h°áng dÁn: Ts. D°¢ng Qußc Chính Ths. Trần TuÃn Anh Hà Nßi - 2023 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học LâI CÀM ¡N Tr°ớc tiên, tôi xin gāi lßi cÁm ¢n chân thành và sâu sÁc tới TS. D°¢ng Quác Chính – GiÁng viên tr°ßng đ¿i hãc Y D°ợc – Đ¿i hãc Quác gia Hà Nội kiêm Tr°áng Khoa Di truyền & Sinh hãc phân tā - Viãn HuyÁt hãc và Truyền máu Trung ¯¢ng.

GiÁng viên đã h°ớng dẫn tôi trong quá trình nghiên cāu, đã luôn t¿n tình h°ớng dẫn, quan tâm, giÁi đáp nhăng thÁc mÁc, khó khn, đãng thßi luôn động viên tôi trong suát quá trình, giúp tôi hãc đ°ợc nhăng bài hãc quý báu, đß tôi có thß hoàn thành tát đề tài cÿa mình. Tôi xin trân trãng cÁm ¢n ThS. TrÅn TuÃn Anh- Th¿c sĩ kỹ thu¿t xét nghiãm – Khoa Di truyền & Sinh hãc phân tā - Viãn HuyÁt hãc và Truyền máu Trung ¯¢ng, ng°ßi đã h°ớng dẫn tôi nhăng điều c¢ bÁn nhÃt tÿ ngày đÅu tiên tham gia vào nhóm nghiên cāu thực nghiãm, hç trợ nhiãt tình cho tôi trong suát quá trình thực hành tÿ nhăng thao tác nhß nhÃt và giúp đỡ, chia sẻ cho tôi nhăng tài liãu hău ích trong suát thßi gian là thành viên cÿa nhóm. ĐÁc biãt h¢n cÁ, anh đã giúp tôi thêm gÁn bó chÁt ch¿ với các thành viên trong nhóm và môi tr°ßng thực hành á viãn.

Đãng thßi không thß thiÁu đ°ợc, tôi trân trãng cÁm ¢n sự tài trợ cÿa Viãn HuyÁt hãc Truyền máu Trung °¢ng cho đề tài. Trong quá trình hãc t¿p, làm viãc và thực hiãn khóa lu¿n, tôi đã nh¿n đ°ợc sự giúp đỡ nhiãt tình cÿa các thÅy cô, anh chá và các b¿n sinh viên làm viãc t¿i thực t¿p t¿i Khoa Di truyền – Sinh hãc phân tā. Tôi xin chân thành cÁm ¢n. Đß thực hiãn tát khóa lu¿n này, tôi xin gāi lßi cÁm ¢n tới Ban chÿ nhiãm khoa, cùng toàn thß các thÅy cô giáo tr°ßng đ¿i hãc Y d°ợc - Đ¿i hãc Quác gia Hà Nội đã cho tôi nhăng kiÁn thāc quý báu trong quá trình hãc t¿p t¿i tr°ßng.

Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2023 Ph¿m Thß Ph°¢ng ThÁo Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học DANH MĀC CÁC TĆ VI¾T TÄT Tć vi¿t tÅt Tên đầy đă Tć ti¿ng viát CALR Calreticulin Chronic myelogenous Bãnh L¢-xê-mi kinh CML leukemia dòng h¿t DNA Deoxyribonucleotid acid EDTA Ethylenediaminetraacetic acid Bãnh tng tißu cÅu tiên ET Essential thrombocythaemia phát JAK2 Janus kinase 2 Gen JAK2 MPNs Myeloproliferative neoplasm Bãnh tng sinh tÿy m¿n Myeloproliferative leukemia MPL Gen MPL virus oncogene NC Normal Control Mẫu chāng âm GiÁi trình tự gen thÁ hã NGS Next Generation Sequencing mới PhÁn āng khuÁch đ¿i PCR Polymerase chain reaction chuçi Nhiám sÁc thß Ph Philadelphia chromosome Philadelphia Bãnh x¢ tÿy nguyên PMF Primary myelofibrosis phát POS Positive Mẫu chāng d°¢ng Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học PV Polycythaemia vera Bãnh đa hãng cÅu nguyên phát RNA Ribonucleic acid WHO World Health Organization Tå chāc Y tÁ thÁ giới G-CSF Granulocyte YÁu tá kích thích b¿ch colonystimulating factor cÅu h¿t HSC Hematopietic stem cells Các tÁ bào gác t¿o máu TBCAT Tng b¿ch cÅu ái toan TBCAK Tng b¿ch cÅu ái kiềm AS- PCR Allele-specific PCR ĐÁc hiãu allene Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học DANH MĀC HÌNH Hình 1. Vß trí căa nhißm sÅc thà chąa gen CALR. To¿ đß căa gen CALR trên nhißm sÅc thà sß 19. CÃu trúc căa protein Calreticulin.

Đßt bi¿n gen CALR type 1 và type 2 trên exon 9 [18]. Quy trình nghiên cąu. Nguyên lí căa phÁn ąng PCR. Vß trí căa mßi đầu (F) Forward và mßi đầu (R) Reverse.

K¿t quÁ tßi °u nhiát đß gÅn mßi trong PCR phát hián đßt bi¿n CALR type 1. K¿t quÁ tßi °u nhiát đß gÅn mßi trong PCR phát hián đßt bi¿n CALR type 2 .27 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học DANH MĀC BÀNG BIÂU BÁng 2. Các bi¿n sß trong nghiên cąu. Dāng cā và vÃt t° tiêu hao sÿ dāng trong thí nghiám.

Thành phần và chu trình nhiát phÁn ąng PCR phát hián đßt. 16 bi¿n CALR type 1. Thành phần và điÁu kián phÁn ąng PCR phát hián đßt bi¿nCALR type 2.1: Phân bß vÁ giái tính căa nhóm nghiên cąu .2: Phân bß tćng nhóm bánh nghiên cąu .3: Phân bß khoÁng tuái căa nhóm bánh nghiên cąu. Phân bß khoÁng tuái theo tćng nhóm bánh nghiên cąu.

Thi¿t k¿ mßi phát hián đßt bi¿n CALR type 1. Thi¿t k¿ mßi phát hián đßt bi¿n CALR type 2. Phân bß tÿ lá đßt bi¿n trong nghiên cąu. Phân bß tÿ lá đßt bi¿n theo nhóm bánh.

Phân bß tÿ lá đßt bi¿n theo giái tính å nhóm nghiên cąu. Phân bß tÿ lá đßt bi¿n theo khoÁng tuái å nhóm nghiêncąu. Tÿ lá thà bánh trong nhóm nghiên cąu &&&&&&&&24 MĀC LĀC Đ¾T VÂN ĐÀ.1 CH¯¡NG 1 - TàNG QUAN TÀI LIàU. Tång quan về hội chāng tng sinh tuỷ.

Khái niãm và đÁc đißm dách tá hãc. C¢ chÁ sinh bãnh hãc. Tång quan về gen liên quan đÁn hội chāng rái lo¿n tng sinh tÿy&&. Tång quan về gen CALR.

ĐÁc đißm di truyßn cÿa gen CALR. Vai trò cÿa gen CALR trong hội chāng tng sinh tÿy.7 CH¯¡NG 2 - ĐÞI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU. Tiêu chuẩn lựa chãn. Tiêu chuẩn lo¿i trÿ.

Ph°¢ng pháp chãn mẫu. Đáa đißm và thßi gian nghiên cāu. Thßi gian nghiên cāu. Ph°¢ng pháp nghiên cāu.

ThiÁt kÁ nghiên cāu: mô tÁ cÁt ngang. Ph°¢ng pháp nghiên cāu. V¿t t°, hóa chÃt và trang thiÁt bá sā dụng trong nghiên cāu. Quy trình nghiên cāu.

Quy trình kỹ chiÁt DNA tång sá sā dụng h¿t tÿ. Kißm tra, đánh giá nãng độ DNA trên máy quang phå Nano Drop. Kỹ thu¿t PCR trong phát hiãn đột biÁn CALR type 1 và type 2…………14 2. QuÁn lý và phân tích sá liãu.&&19 CH¯¡NG 3 - K¾T QUÀ.

ĐÁc đißm chung cÿa bãnh nhân nghiên cāu. ĐÁc đißm về giới tính cÿa nhóm nghiên cāu. ĐÁc đißm về tuåi cÿa nhóm nghiên cāu. ĐÁc đißm về các thß bãnh cÿa nhóm nghiên cāu.

Xây dựng và hoàn thiãn quy trình PCR phát hiãn đột biÁn CALR type 1 và type 2. Nghiên cāu các cÁp mãi cho qui trình PCR. Các cặp mồi suy biến cho đột biến CALR type 1. Các cặp mồi đặc hiệu cho đột biến CALR type 2.

Tái °u nhiãt độ kỹ thu¿t PCR phát hiãn đột biÁn CALR. KÁt quÁ āng dụng quy trình PCR phát hiãn đột biÁn CALR type 1 và CALR type 2. ĐÁc đißm, phân bá hai lo¿i đột biÁn gen CALR trong nghiên cāu&.27 CH¯¡NG 4 - BÀN LUÂN.31 K¾T LUÂN VÀ ĐÀ XUÂT.34 TÀI LIàU THAM KHÀO.&&& Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học Đ¾T VÂN ĐÀ Hội chāng tng sinh tÿy (Myeloproliferative neoplasm-MPNs) là sự tng sinh bÃt th°ßng cÿa các tÁ bào gác tÿy x°¢ng, bißu hiãn là tng tißu cÅu, tng hãng cÅu hoÁc b¿ch cÅu trong máu và đôi khi tng sinh x¢ trong tÿy x°¢ng với dián biên tiÁp theo là sinh máu ngoài tÿy (sự sÁn xuÃt tÁ bào bên ngoài tÿy x°¢ng) và chúng đ°ợc phân lo¿i là tng tißu cÅu tiên phát (Essential thrombocythaemia - ET), X¢ tÿy nguyên phát (Primary myelofibrosis - PMF), Đa hãng cÅu nguyên phát (Polycythaemia vera - PV), L¢ xê mi kinh dòng tÿy. Ngoài ra các thß tng sinh tÿy ít phå biÁn h¢n bao gãm hội chāng tng b¿ch cÅu ái toan và tng tÁ bào mastocytosis và các hội chāng tng b¿ch cÅu h¿t khác.

Các khái u tng sinh tÿy cjng có thß t°¢ng đãng với các hội chāng tng sinh tÿy. Tuy có tên chung là hội chāng tng sÁn tÿy nh°ng các kißu bãnh khác nhau mang các đÁc đißm di truyền hãc khác nhau và trong đó, đột biÁn gen JAK2V617F và gen CALR đ°ợc xác đánh là nhăng dÃu Ãn có giá trá trong chẩn đoán hội chāng tng sinh tÿy [1]. Janus kinase 2 là một thành viên cÿa hã enzym Tyrosine kinase lo¿i I và tham gia vào quá trình truyền tín hiãu cho các thụ thß erythropoietin, thrombopoietin và yÁu tá kích thích b¿ch cÅu h¿t. Các đột biÁn cÿa gen Janus kinase 2 (JAK2) là nguyên nhân gây ra bãnh đa hãng cÅu và chiÁm một tỷ lã cao các tr°ßng hợp tng tißu cÅu tiên phát và bãnh x¢ tÿy nguyên phát.[2] Gen CALR cjng bá đột biÁn á một tỷ lã đáng kß á bãnh nhân tng tißu cÅu tiên phát và bãnh nhân x¢ tÿy nguyên phát và hiÁm khi á bãnh đa hãng cÅu.

Đột biÁn gen CALR trong hội chāng tng sinh tÿy đã đ°ợc báo cáo là dÃu hiãu quan trãng trong chẩn đoán phân tā, đÁc biãt á nhăng bãnh nhân âm tính với JAK2 V617F[3]. Gen CALR đã đ°ợc xác đánh là đột biÁn gây bãnh á một phÅn t° các bãnh nhân mÁc ET và PMF [4]. Trong nhăng nm gÅn đây ng°ßi ta phát hiãn thÃy sự xuÃt hiãn cÿa đột biÁn gen CALR trên các nhóm hội chāng tng sÁn tÿy không mang đột biÁn JAK2 vì thÁ đột biÁn CALR nhanh chóng trá thành một tiêu chí đß chẩn đoán bãnh này[5]. Đß tìm hißu và chuẩn đoán rõ h¢n về các biÁn thß đột biÁn gen CALR, các đột biÁn CALR đ°ợc phân tích bằng các kỹ thu¿t bao gãm kỹ thu¿t PCR đÁc hiãu 1 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học allene (Allele-specific polymer chain reaction- AS-PCR), PCR đánh l°ợng thßi gian thực (Real Time PCR – qPCR), giÁi trình tự thÁ hã mới (Next-Generation Sequencing - NGS),.Trong đó PCR là kỹ thu¿t một dá làm, mang l¿i hiãu quÁ kinh tÁ cao đang đ°ợc sā dụng đß phát hiãn đột biÁn gen CALR á nhăng bãnh nhân mÁc hội chāng tng sinh tÿy.

Tuy nhiên ph°¢ng pháp này và các bộ kit đß xét nghiãm ch°a đ°ợc áp dụng phå biÁn á Viãt Nam. Vì v¿y chúng tôi tiÁn hành nghiên cāu <Āng dụng kỹ thuật PCR phát hiện đột biến gen CALR type 1 và type 2 ở những bệnh nhân mắc hội chāng tăng sinh tÿy âm tính với JAK2V617F= nhằm āng dụng trong chẩn đoán và điều trá hội chāng tng sÁn tÿy.