Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng bacillus sp rd26 nội sinh có khả năng kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa

Tài liệu nghiên cứu Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng bacillus sp rd26 nội, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu

• Tác giả: Nguyễn Thị Lành
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập và Tinh Chế Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp. RD26 Chống MRSA
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: XỬ LÝ THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 2: MÔI TRƯỜNG
• PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực y dược. Bacillus sp. RD26 được biết đến với khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA). Việc phân lập và tinh chế các hợp chất này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng khuẩn mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh tự nhiên. Các hợp chất sinh học từ Bacillus có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là MRSA.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Bacillus sp. RD26 Trong Y Dược

Bacillus sp. RD26 là một trong những chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng sản xuất hợp chất kháng khuẩn mạnh mẽ. Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của MRSA, một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trong bệnh viện. Việc khai thác tiềm năng này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới hiệu quả hơn.

1.2. Các Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp. RD26

Các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 bao gồm nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn. Những hợp chất này không chỉ có khả năng tiêu diệt vi khuẩn mà còn có thể hỗ trợ trong việc điều trị các bệnh lý khác. Việc nghiên cứu và phân lập các hợp chất này là cần thiết để phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Sinh Từ Bacillus

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và phát triển hợp chất kháng sinh từ Bacillus sp. RD26 cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là khả năng kháng thuốc của MRSA, khiến cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Các nghiên cứu hiện tại cần tập trung vào việc tìm ra các phương pháp hiệu quả để phân lập và tinh chế các hợp chất kháng sinh từ Bacillus.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Lập Hợp Chất

Quá trình phân lập các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của các hợp chất này. Việc sử dụng các phương pháp chiết xuất và tinh chế hiện đại là cần thiết để đảm bảo thu được các hợp chất có hoạt tính cao nhất.

2.2. Tình Trạng Kháng Thuốc Của MRSA

MRSA đã trở thành một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe cộng đồng. Tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng khiến cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do MRSA trở nên khó khăn hơn. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết trong việc phát triển các hợp chất kháng sinh mới từ Bacillus sp. RD26.

III. Phương Pháp Phân Lập Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp

Để phân lập và tinh chế các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất bằng dung môi, sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Kỹ Thuật Chiết Xuất Hợp Chất

Kỹ thuật chiết xuất là bước đầu tiên trong quá trình phân lập hợp chất sinh học. Việc sử dụng các dung môi khác nhau như n-hexane, chloroform và methanol giúp tối ưu hóa khả năng thu hồi các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ Bacillus sp. RD26.

3.2. Sắc Ký Lớp Mỏng TLC Trong Phân Tích Hợp Chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiệu quả để phân tích và xác định các hợp chất thu được từ Bacillus sp. RD26. Phương pháp này cho phép theo dõi sự phân tách của các hợp chất và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của từng phân đoạn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Khả Năng Kháng MRSA

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 có khả năng kháng MRSA đáng kể. Các thử nghiệm cho thấy rằng các phân đoạn chiết xuất từ Bacillus sp. RD26 có thể ức chế sự phát triển của MRSA, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh tự nhiên.

4.1. Khả Năng Ức Chế MRSA Từ Các Phân Đoạn

Các phân đoạn chiết xuất từ Bacillus sp. RD26 đã được thử nghiệm và cho thấy khả năng ức chế MRSA. Kết quả này cho thấy tiềm năng lớn của các hợp chất sinh học trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do MRSA.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ Bacillus sp. RD26 được đánh giá thông qua các phương pháp như khuếch tán đĩa Kirby-Bauer và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Kết quả cho thấy các hợp chất này có thể là nguồn dược liệu quý giá trong điều trị nhiễm trùng.

V. Kết Luận Và Triển Vọng Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh mà còn góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y dược, đặc biệt trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do MRSA.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Sinh

Tương lai của nghiên cứu hợp chất kháng sinh từ Bacillus sp. RD26 rất hứa hẹn. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các hợp chất này có thể dẫn đến những đột phá trong điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 có thể được ứng dụng trong sản xuất thuốc kháng sinh tự nhiên. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc mà còn mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát Theo danh sách công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (2018), có 12 loài vi khuẩn và các họ vi khuẩn kháng thuốc gây ra mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe con người. Trong đó, Staphylococcus aureus - tụ cầu vàng, được xếp vào nhóm vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ ưu tiên cao (WHO, 2018).

Vi khuẩn này thường gây ra các bệnh nhiễm trùng trên da như loét, mụn mủ hoặc nhọt. Nhiễm trùng có thể đi vào nơi phẫu thuật, trong máu hoặc gây ra viêm phổi,… Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S.aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra. MRSA là một nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cũng như nhiễm trùng cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác. MRSA đang là tác nhân đa kháng thuốc, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người trên toàn thế giới (WHO, 2018).

Hợp chất sinh học là các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn hoặc thực vật, có những hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virus, hoạt tính dược lý (Kalia và cs. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng, bởi lợi ích của nó đối với sức khỏe con người. Phần lớn các hợp chất này được tổng hợp bởi vi khuẩn nội sinh giúp thực vật có khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh, được sử dụng trong các ngành dược phẩm như thuốc kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống đái tháo đường và các hợp chất hoạt tính sinh học khác (Guo và cs. Một số ví dụ điển hình bao gồm thuốc kháng sinh mới Ecomycin được tạo ra từ vi khuẩn nội sinh Pseudomonas viridiflava và Pseudomycin từ vi khuẩn Pseudomonas syringae (Christina và cs.

Năm 2013, Sunkar và cộng sự đã phân lập và xác định được vi khuẩn nội sinh Brasica oleracea có khả năng sinh các enzyme amylase, protease, cellulase có tiềm năng trong sản xuất enzyme với quy mô lớn. Bacillus là một trong những đối tượng nghiên cứu rất rộng rãi vì chúng sinh ra các hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh. Công trình nghiên cứu của Jeyanthi và cộng sự (2016) đã tiến hành tinh sạch, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất có hoạt tính sinh học kháng MRSA được phân lập từ Bacillus amyloliquefaciens. Năm 2017, Chauha và cộng sự thực hiện nghiên cứu chất kháng SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát khuẩn mới từ chủng Bacillus được phân lập từ đất có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc như S. aureus kháng methicillin và vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes. Từ một số công trình nghiên cứu trên cho thấy chủng Bacillus có tiềm năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học rất cao.

Các hợp chất này có nhiều các cấu trúc hóa học đặc biệt phức tạp, với hàng loạt các nhóm chức năng đặc trưng, đa dạng hơn so với nhóm kháng sinh và chất chuyển hóa thứ cấp từ vi sinh vật khác (Shukla, 2015). Ở Việt Nam, còn ít các công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc từ vi sinh vật nội sinh. Thừa kế từ công trình nghiên cứu trước, chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum.

Et thonn) có khả năng kháng MRSA. Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài với nội dung như sau: “Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).” Mục tiêu: Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).

Nội dung: − Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào. − Chiết các hợp chất từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 với các dung môi: n- hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl axetate, methanol và nước. − Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao chiết chủng Bacillus sp.

RD26 thu được bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby – Bauer. − Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 kháng MRSA bằng phương pháp pha loãng. − Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).

SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát − Thu nhận phân đoạn chứa các chất có hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp sắc ký cột. − Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng MRSA.

SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS.

Nguyễn Tấn Phát 2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN S.aureus đề kháng với penicillin được phát hiện lần đầu tiên vào đầu thập niên 1940, chỉ một thời gian ngắn sau penicillin được đưa vào sử dụng. Nhưng trong nhiều năm sau đó thì những dòng vi khuẩn kháng penicillin này vẫn còn nhạy với các penicillin bền vững với penicillinase (oxacillin, methicillin, nafcillin), còn gọi là penicillin M. Đến giữa thập niên 1960, bắt đầu xuất hiện những dòng vi khuẩn S.aureus kháng penicillin M, được gọi là “methicillin resistant S.aureus đề kháng với penicillin thông qua cơ chế β-lactamase và hiện nay đã có một tỷ lệ rất cao S.aureus kháng với penicillin bằng cách tiết enzyme β-lactam; MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’).

Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam ( Phạm Hùng Vân, 2013). MRSA được viết tắt với tên gọi Methicillin resistant S. Kể từ những năm 1960, MRSA trở nên phổ biến trên toàn cầu và là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện và cộng đồng. Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm beta -lactam (như methicillin) ( Lee và cs.

Phân loại khoa học Giới: Eubacteria Ngành: Eubacteria Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát Họ: Staphylococcaceae Chi: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus S. aureus là một trong những mầm bệnh phổ biến nhất trong các cơ sở chăm sóc sức khỏe và trong cộng đồng, và có thể gây nhiễm trùng xâm lấn, nhiễm trùng huyết và tử vong, trong khi S.

aureus kháng methicillin (MRSA) cấu thành một mối quan tâm nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng do khả năng xâm chiếm và lây nhiễm cho người và động vật (Kourtis và cs. MRSA được phân lập tại Châu Âu đầu tiên vào năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại Mỹ ở thập niên 1980 (tỷ lệ nhiễm MRSA 10 - 40%). Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S. aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra: Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90% (WHO,2018).

MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác. Tần suất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những người gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người / hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV / AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1999 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119%, hay 14% mỗi năm (Klein và cs.650 trường hợp nhiễm dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2011) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs. Đứng trước tình hình S. aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết được enzyme penicillinase phá huỷ được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định penicillin M để điều trị các nhiễm khuẩn do S.

Tuy nhiên hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S. aureus kháng được penicillin M (MRSA) với tỷ lệ ngày càng gia tăng. Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực hiện năm 2005 trên 235 chủng S. aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát nhiễm khuẩn do S. aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47%. Tổng kết tại Bệnh Viện Chợ Rẫy và Bạch mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43%.

Tổng kết của GARP:VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại VN vào năm 2008 là từ 30% đến 64%. Bệnh viện Thống Nhất TP. HCM từ năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 79% S. aureus phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiết niệu kháng methicillin.

Chỉ định kháng sinh dành cho MRSA là vancomycin, tuy nhiên hiện nay chỉ định này đang phải đối diện với một thách thức mới, không phải là do xuất hiện đề kháng vancomycin mà là do MIC của vancomycin đối với S. aureus bị tăng vượt quá 1.5 μg/mL gây thất bại điều trị vancomycin trên lâm sàng. Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Chợ Rẫy với ghi nhận 46% các chủng MRSA là có MIC của vancomycin ≥2 μg/mL và 93% có MIC ≥1. Một nghiên cứu tương đối rộng ở 3 tỉnh ( Đà Nẵng, Cần Thơ và Tp.

Hồ Chí Minh) của Phạm Hồng Vân và Phạm Thái Bình cho thấy MRSA kháng lại hầu hết các loại kháng sinh thông dụng, kể cả kháng sinh thế hệ mới (gentamycin: 42%, erythromycin: 63%, azithromycin: 68%, ciprofloxacin: 39%, cefuroxime: 38%, amoxillin - acid clavuanic: 30%, chloramphenicol: 38%, methicillin: 47%). Tuy chỉ có hai loại kháng sinh là vancomycin và linezolid chưa thấy đề kháng ( Cao Thị Thu Quế, 2015). VI KHUẨN NỘI SINH BACILLUS SP. Phân loại Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát 2.