Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng bacillus sp rd26 nội sinh có khả năng kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh… 83 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2019.

• Tác giả: Nguyễn Thị Lành
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phân Lập và Tinh Chế Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp. RD26 Chống MRSA
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: XỬ LÝ THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 2: MÔI TRƯỜNG
• PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 đang thu hút sự chú ý lớn trong lĩnh vực y dược. Bacillus sp. RD26 được biết đến với khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA). Việc phân lập và tinh chế các hợp chất này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng khuẩn mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh tự nhiên. Các hợp chất sinh học từ Bacillus có tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là MRSA.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Bacillus sp. RD26 Trong Y Dược

Bacillus sp. RD26 là một trong những chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng sản xuất hợp chất kháng khuẩn mạnh mẽ. Nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của MRSA, một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng trong bệnh viện. Việc khai thác tiềm năng này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới hiệu quả hơn.

1.2. Các Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp. RD26

Các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 bao gồm nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn. Những hợp chất này không chỉ có khả năng tiêu diệt vi khuẩn mà còn có thể hỗ trợ trong việc điều trị các bệnh lý khác. Việc nghiên cứu và phân lập các hợp chất này là cần thiết để phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Sinh Từ Bacillus

Mặc dù có nhiều tiềm năng, việc nghiên cứu và phát triển hợp chất kháng sinh từ Bacillus sp. RD26 cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là khả năng kháng thuốc của MRSA, khiến cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Các nghiên cứu hiện tại cần tập trung vào việc tìm ra các phương pháp hiệu quả để phân lập và tinh chế các hợp chất kháng sinh từ Bacillus.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Phân Lập Hợp Chất

Quá trình phân lập các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 thường gặp khó khăn do sự đa dạng và phức tạp của các hợp chất này. Việc sử dụng các phương pháp chiết xuất và tinh chế hiện đại là cần thiết để đảm bảo thu được các hợp chất có hoạt tính cao nhất.

2.2. Tình Trạng Kháng Thuốc Của MRSA

MRSA đã trở thành một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe cộng đồng. Tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng khiến cho việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do MRSA trở nên khó khăn hơn. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết trong việc phát triển các hợp chất kháng sinh mới từ Bacillus sp. RD26.

III. Phương Pháp Phân Lập Hợp Chất Sinh Học Từ Bacillus sp

Để phân lập và tinh chế các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất bằng dung môi, sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Kỹ Thuật Chiết Xuất Hợp Chất

Kỹ thuật chiết xuất là bước đầu tiên trong quá trình phân lập hợp chất sinh học. Việc sử dụng các dung môi khác nhau như n-hexane, chloroform và methanol giúp tối ưu hóa khả năng thu hồi các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ Bacillus sp. RD26.

3.2. Sắc Ký Lớp Mỏng TLC Trong Phân Tích Hợp Chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiệu quả để phân tích và xác định các hợp chất thu được từ Bacillus sp. RD26. Phương pháp này cho phép theo dõi sự phân tách của các hợp chất và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của từng phân đoạn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Khả Năng Kháng MRSA

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 có khả năng kháng MRSA đáng kể. Các thử nghiệm cho thấy rằng các phân đoạn chiết xuất từ Bacillus sp. RD26 có thể ức chế sự phát triển của MRSA, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh tự nhiên.

4.1. Khả Năng Ức Chế MRSA Từ Các Phân Đoạn

Các phân đoạn chiết xuất từ Bacillus sp. RD26 đã được thử nghiệm và cho thấy khả năng ức chế MRSA. Kết quả này cho thấy tiềm năng lớn của các hợp chất sinh học trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do MRSA.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ Bacillus sp. RD26 được đánh giá thông qua các phương pháp như khuếch tán đĩa Kirby-Bauer và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Kết quả cho thấy các hợp chất này có thể là nguồn dược liệu quý giá trong điều trị nhiễm trùng.

V. Kết Luận Và Triển Vọng Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh mà còn góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y dược, đặc biệt trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do MRSA.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Sinh

Tương lai của nghiên cứu hợp chất kháng sinh từ Bacillus sp. RD26 rất hứa hẹn. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các hợp chất này có thể dẫn đến những đột phá trong điều trị các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Các hợp chất sinh học từ Bacillus sp. RD26 có thể được ứng dụng trong sản xuất thuốc kháng sinh tự nhiên. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc mà còn mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc là một trong những thách thức y tế nghiêm trọng nhất trên toàn cầu. Theo công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2018), Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) được xếp vào nhóm vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ ưu tiên cao. Các chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là tác nhân chính gây ra các bệnh nhiễm trùng da, mô mềm, nhiễm trùng vết thương phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và viêm phổi ở cả môi trường bệnh viện lẫn cộng đồng. Tỷ lệ nhiễm MRSA tại các khu vực trên thế giới duy trì ở mức cao: Đông Nam Á trên 25%, Đông Địa Trung Hải trên 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi và Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90%. Tại Việt Nam, các thống kê tại Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Bạch Mai ghi nhận tỷ lệ phân lập MRSA trong các ca nhiễm tụ cầu dao động từ 43% đến 57%; khảo sát của Đơn vị Kháng thuốc Toàn cầu tại Việt Nam (GARP-VN) tại 15 bệnh viện ghi nhận tỷ lệ từ 30% đến 64%. Đặc biệt, kháng sinh vancomycin vốn là lựa chọn ưu tiên cho MRSA đang đối mặt với nguy cơ suy giảm hiệu quả khi giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) có xu hướng tăng cao (MIC ≥ 1,5–2 µg/mL).

Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các nguồn vi sinh vật tự nhiên, đặc biệt là vi khuẩn nội sinh thực vật, mở ra hướng đi cần thiết nhằm phát triển các hoạt chất kháng sinh mới. Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc đa dạng, bao gồm các peptide kháng khuẩn và lipopeptide (như surfactin, iturin, fengycin). Nhằm kế thừa các nghiên cứu trước đó về nguồn vi khuẩn nội sinh tại Việt Nam, khóa luận thực hiện đề tài: "Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)".

Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 có khả năng kháng chủng kiểm định Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào và dịch nội bào của chủng Bacillus sp. RD26.
2. Chiết tách các hợp chất từ dịch vi khuẩn Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với 6 hệ dung môi: n-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước.
3. Đánh giá hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết thu được bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby - Bauer.
4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao chiết đối với MRSA bằng phương pháp pha loãng trong môi trường dinh dưỡng.
5. Khảo sát thành phần các phân đoạn cắn của cao chiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
6. Tách và thu nhận các phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển.
7. Tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất có hoạt tính sinh học kháng MRSA thu nhận được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 (phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng - Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.) và chủng vi khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 05 năm 2019.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh (Cơ sở 3, 68 Lê Thị Trung, TP. Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương) và Phòng 19, Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học (Số 01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết vi sinh học và hóa học các hợp chất tự nhiên:

• Đặc điểm sinh học và chất chuyển hóa của Bacillus: Chi Bacillus thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Vi khuẩn có dạng que thẳng, kích thước 0,5–1,2 × 2,5–10 µm, có khả năng tạo nội bào tử chịu nhiệt và sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học (các enzyme ngoại bào, lipopeptide thuộc nhóm iturin, surfactin, fengycin, kurstakins).
• Cơ chế đề kháng của MRSA: MRSA kháng các kháng sinh nhóm beta-lactam chủ yếu thông qua gen mecA mã hóa cho protein gắn penicillin biến đổi PBP 2A (Penicillin Binding Protein 2A) có ái lực rất thấp với beta-lactam.
• Nguyên lý chiết tách và sắc ký: Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan dựa trên độ phân cực; sắc ký lớp mỏng (TLC) pha thuận trên bản mỏng silica gel; sắc ký cột cổ điển hấp phụ pha thuận và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC); phân tích cấu trúc hóa học bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Hoạt hóa và lên men vi khuẩn: Chủng Bacillus sp. RD26 được phục hồi từ thạch nghiêng trên môi trường Nutrient Broth (NB) ở 35°C trong 36 giờ (lắc 200 vòng/phút), đưa về mật độ $10^8\text{ tế bào/mL}$ ($OD_{610}$), sau đó cấy chuyển 10% thể tích vào môi trường lên men tối ưu ở 30°C trong 36 giờ, pH = 7,0 (theo quy trình tối ưu của Dương Nhật Linh và cộng sự, 2018).
• Thu nhận và xử lý dịch ngoại bào, nội bào: Dịch lên men được ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút để tách dịch nổi (ngoại bào). Phần sinh khối tế bào được rửa bằng NaCl 0,9%, hòa lại trong đệm phosphat 0,1 M (pH 7,0), bổ sung chất khử dithiothreitol (DTT) 10 mM nhằm chống oxy hóa, làm lạnh ở 0–5°C và tiến hành phá vỡ màng tế bào bằng máy tán siêu âm (6 chu kỳ, mỗi chu kỳ 30 giây, biên độ 50%), sau đó ly tâm thu dịch nội bào.
• Chiết phân đoạn lỏng - lỏng: 100 mL dịch vi khuẩn được chiết lần lượt với 6 dung môi có độ phân cực khác nhau theo tỷ lệ thể tích 1:1 bao gồm: n-hexane (He), chloroform (Clo), dichloromethane (Di), ethyl acetate (Et), methanol (Me) và nước (W). Dịch chiết dung môi hữu cơ được gom lại và cô quay chân không để thu cao chiết thô.
• Thử hoạt tính kháng MRSA: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby - Bauer trên đĩa thạch Mueller Hinton Agar (MHA) đã trải đều huyền dịch S. aureus ATCC 43300 mật độ $10^8\text{ CFU/mL}$ (chuẩn độ đục McFarland 0,5). Đục các giếng thạch đường kính 6 mm, nạp 100 µL dung dịch mẫu thử (cao chiết pha trong DMSO 1%) hoặc đối chứng âm (DMSO 1%), ủ ở 37°C trong 24 giờ và đo đường kính vòng ức chế vô khuẩn (mm).
• Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thực hiện trên phiến vi lọc 96 giếng (phiến Microwell) bằng phương pháp pha loãng nồng độ theo cấp số nhân trong môi trường Mueller Hinton Broth (MHB), khảo sát dải nồng độ từ 512 µg/mL giảm dần đến 0,25 µg/mL; mật độ vi khuẩn thử nghiệm đạt $10^3\text{ CFU/mL}$; ủ 37°C và đọc kết quả sau 18–20 giờ.
• Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng silica gel $60\text{F}_{254}$ (độ dày 0,25 mm, Merck), triển khai trong bình bão hòa hơi dung môi với hệ dung môi giải ly chloroform : methanol (tỷ lệ 65:35). Phát hiện vết sắc ký dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và hiện màu bằng thuốc thử dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong ethanol, hơ nóng ở 105°C trong 1–2 phút; tính hệ số di chuyển $R_f$.
• Sắc ký cột phân đoạn và tinh chế: Tiến hành sắc ký cột hấp phụ pha thuận với chất nhồi silica gel trên 42 g cao methanol. Hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần: chloroform : methanol với các tỷ lệ (95:5), (92:8), (85:15), (70:30) và chloroform : methanol : nước với các tỷ lệ (65:35:5), (60:40:1). Phân đoạn có hoạt tính được tiếp tục chạy cột nhiều lần và tinh sạch bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 với pha động methanol - nước.
• Xác định cấu trúc hóa học: Phân tích mẫu chất tinh sạch bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR (tần số 500 MHz) và $^{13}\text{C}$-NMR (tần số 125 MHz) đo trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$.
• Phương pháp xử lý thống kê: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ($n=3$), tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$), phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Đặt vấn đề

Chương trình bày thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn Staphylococcus aureus (MRSA) trên quy mô toàn cầu và tại Việt Nam, nêu bật nguy cơ thất bại điều trị khi sử dụng các phác đồ chuẩn như vancomycin. Tác giả dẫn chứng các công trình quốc tế về khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp kháng khuẩn từ chi Bacillus (như nghiên cứu của Jeyanthi et al., 2016 trên Bacillus amyloliquefaciens; Chauha et al., 2017). Trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 từ cây Diệp Hạ Châu Đắng, chương xác định mục tiêu và 7 nội dung nghiên cứu cụ thể nhằm phân lập, tinh chế và nhận diện cấu trúc hợp chất kháng MRSA.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến:

1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA): Lịch sử phát hiện từ năm 1960, đặc điểm phân loại khoa học (thuộc chi Staphylococcus, họ Staphylococcaceae), cơ chế kháng thuốc thông qua protein PBP 2A do gen mecA quy định, tình hình dịch tễ học và tỷ lệ đề kháng kháng sinh tại các bệnh viện Việt Nam.
2. Vi khuẩn nội sinh Bacillus sp.: Phân loại học theo Bergey (thuộc họ Bacillaceae, ngành Firmicutes), hình thái tế bào que tạo nội bào tử, đặc tính sinh lý sinh hóa và khả năng sản sinh enzyme cùng 167 hợp chất có hoạt tính sinh học (các họ lipopeptide như iturin, surfactin, fengycin, kurstakins).
3. Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ Bacillus: Điểm lại các công trình nghiên cứu ứng dụng đối kháng vi sinh vật gây bệnh (Tabbene et al., 2009; Nalisha et al., 2006).
4. Lý thuyết các phương pháp chiết xuất và sắc ký: Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột pha thuận (Silica gel), pha đảo (RP-18) và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tách chất.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương mô tả chi tiết vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm được triển khai từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019 tại Trường Đại học Mở TP.HCM và Viện Công nghệ Hóa học. Chương cung cấp sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát, quy trình hoạt hóa, nuôi cấy lên men chủng Bacillus sp. RD26, quy trình phá tế bào bằng sóng siêu âm có bổ sung DTT 10 mM, quy trình chiết lỏng - lỏng với 6 hệ dung môi, phương pháp đục lỗ giếng thạch Kirby - Bauer, phương pháp xác định MIC trên đĩa 96 giếng, quy trình sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột phân đoạn từ cao chiết methanol (42 g), cùng quy trình phân tích phổ NMR.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương trình bày và thảo luận toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm thu được:

1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch ngoại bào và nội bào: Dịch ngoại bào tạo vòng kháng MRSA với đường kính $29,67 \pm 0,67\text{ mm}$, trong khi dịch nội bào không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ($0\text{ mm}$). Kết quả khẳng định hợp chất có hoạt tính sinh học được vi khuẩn Bacillus sp. RD26 tiết ra môi trường ngoại bào.
2. Hiệu suất thu hồi và hoạt tính kháng MRSA của 6 loại cao chiết:
   • Dung môi ethyl acetate (Et) cho khối lượng cao chiết và hiệu suất thu hồi cao nhất ($5,15 \pm 0,2\text{ g}$, tương ứng 5,15%), tiếp theo là n-hexane ($2,61\text{ g}$; 2,61%), chloroform ($2,27\text{ g}$; 2,27%), nước ($2,13\text{ g}$; 2,13%), methanol ($1,81\text{ g}$; 1,81%) và thấp nhất là dichloromethane ($1,21\text{ g}$; 1,21%).
   • Hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp giếng thạch ghi nhận cao chiết methanol (Me) tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất đạt $18,67 \pm 0,57\text{ mm}$ (khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các cao chiết còn lại theo phép thử Duncan, $p < 0,05$). Các cao chiết còn lại cho đường kính lần lượt: nước ($15,33 \pm 2,52\text{ mm}$), dichloromethane ($15,33 \pm 0,57\text{ mm}$), ethyl acetate ($14,00 \pm 3,00\text{ mm}$), n-hexane ($13,33 \pm 2,52\text{ mm}$) và chloroform ($11,67 \pm 0,57\text{ mm}$).
3. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Cao chiết methanol thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất với giá trị $\text{MIC} = 128\text{ µg/mL}$. Cao chiết ethyl acetate và chloroform có $\text{MIC} = 256\text{ µg/mL}$. Các cao chiết n-hexane, dichloromethane và nước có $\text{MIC} = 512\text{ µg/mL}$.
4. Kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng chạy hệ chloroform : methanol (65:35) ghi nhận:
   • Cao n-hexane: 1 vết tròn kéo dài, tâm đen ($R_f = 0,52$).
   • Cao chloroform: 1 vết hình trái tim ($R_f = 0,735$).
   • Cao dichloromethane: 1 vết hình bầu dục ($R_f = 0,74$).
   • Cao ethyl acetate: 1 vết tròn kéo dài, tâm đen ($R_f = 0,66$).
   • Cao methanol: 1 vết hình tròn ($R_f = 0,54$).
   • Cao nước: 1 vết tròn kéo dài ($R_f = 0,50$).
5. Phân lập, sắc ký cột và định danh hợp chất: Từ 42 g cao methanol, thực hiện sắc ký cột thu được 6 phân đoạn chính gồm Cao A, B, C, D, E, F. Tiếp tục phân đoạn cao C (với hệ dung môi Clo:Me 85:15 và 8:2) và cao D (hệ Clo:Me 75:25 và Clo:Me:W 7:3:0,5), kết hợp sắc ký tinh sạch pha đảo RP-18, tác giả đã cô lập được hợp chất tinh khiết ký hiệu là BR01. Cấu trúc hóa học của hợp chất BR01 được xác định là pyrimidine-2,4-dione (uracil) dựa trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR (500 MHz) và $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz) đo trong $\text{DMSO-}d_6$.

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Chương tổng kết các kết quả đạt được về vị trí phân bố hoạt tính (dịch ngoại bào), lựa chọn dung môi chiết thích hợp (methanol), thông số ức chế vi khuẩn kiểm định ($\text{MIC} = 128\text{ µg/mL}$) và nhận danh hợp chất BR01. Đồng thời, đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện quy trình tách chiết và ứng dụng thực tế.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

Dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình khảo sát 6 hệ dung môi chiết xuất từ dịch vi khuẩn Bacillus sp. RD26 được tổng hợp trong bảng sau:

Dung môi chiết	Thể tích dịch chiết (mL)	Khối lượng cao thu được (g)	Hiệu suất thu hồi (%)	Đường kính vòng kháng khuẩn MRSA (mm)	Giá trị MIC đối với MRSA (µg/mL)	Hệ số di chuyển $R_f$ trên TLC
n-Hexane (He)	100	$2,61 \pm 0,09$	2,61	$13,33 \pm 2,52$	512	0,520
Chloroform (Clo)	100	$2,27 \pm 0,21$	2,27	$11,67 \pm 0,57$	256	0,735
Dichloromethane (Di)	100	$1,21 \pm 0,90$	1,21	$15,33 \pm 0,57$	512	0,740
Ethyl acetate (Et)	100	$5,15 \pm 0,20$	5,15	$14,00 \pm 3,00$	256	0,660
Methanol (Me)	100	$1,81 \pm 0,21$	1,81	$18,67 \pm 0,57$	128	0,540
Nước (W)	100	$2,13 \pm 0,08$	2,13	$15,33 \pm 2,52$	512	0,500

Ghi chú số liệu:

• Dịch ngoại bào thô tạo vòng kháng MRSA đạt $29,67 \pm 0,67\text{ mm}$; dịch nội bào đạt $0\text{ mm}$.
• Cao chiết methanol có hoạt tính kháng MRSA mạnh nhất ($18,67 \pm 0,57\text{ mm}$) và giá trị MIC thấp nhất ($128\text{ µg/mL}$).
• Quá trình sắc ký cột phân đoạn cao methanol (42 g) và tinh sạch bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 đã phân lập thành công hợp chất BR01, được xác định là pyrimidine-2,4-dione qua phổ $^1\text{H}$-NMR (500 MHz) và $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz) trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

• Tác giả so sánh hoạt tính kháng MRSA của cao chiết methanol ($18,67 \pm 0,57\text{ mm}$) với nghiên cứu của Jeyanthi và cộng sự (2016) trên chủng Bacillus amyloliquefaciens MHB1 (vòng kháng của cao hợp chất phenolic đạt $17,66 \pm 0,57\text{ mm}$ từ dịch khuẩn ban đầu $8,33 \pm 1,15\text{ mm}$), cho thấy chủng Bacillus sp. RD26 có hoạt tính kháng MRSA tương đương và có phần vượt trội trong cùng điều kiện thử nghiệm in vitro.
• Giá trị MIC của cao methanol đối với tụ cầu vàng ($128\text{ µg/mL}$) tương đồng với kết quả của Kaushik và cộng sự (2008) khi khảo sát cao chiết methanol từ vi tảo trên S. aureus ($128\text{ µg/mL}$).
• Khóa luận đã phân lập và xác định được cấu trúc của một hợp chất dị vòng pyrimidine-2,4-dione từ nguồn vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 ký sinh trên cây Diệp Hạ Châu Đắng tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi thời gian ngắn (từ tháng 02/2019 đến tháng 05/2019), các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới chỉ dừng lại ở mô hình in vitro trên một chủng kiểm định duy nhất (Staphylococcus aureus ATCC 43300). Quá trình phân lập cấu trúc từ 42 g cao methanol mới chỉ tập trung xử lý sâu trên các phân đoạn C và D, tách và nhận diện được một hợp chất đơn lẻ (BR01).
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục thực hiện phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất còn lại trong các phân đoạn A, B, E, F của cao chiết methanol.
  • Mở rộng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh sạch trên các chủng vi khuẩn lâm sàng đa kháng thuốc khác.
  • Nghiên cứu cơ chế tác động kháng khuẩn ở mức độ phân tử và đánh giá độc tính tế bào của hợp chất BR01 nhằm hướng tới khả năng ứng dụng dược phẩm.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành: Công nghệ Sinh học, Dược học, Hóa học các hợp chất tự nhiên và Vi sinh vật học ứng dụng.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu:

1. Quy trình thực nghiệm vi sinh: Kỹ thuật xử lý phá màng tế bào vi khuẩn bằng siêu âm kết hợp chất bảo vệ DTT 10 mM để phân định hoạt tính nội bào và ngoại bào.
2. Quy trình hóa thực vật/hóa vi sinh: Phương pháp chiết lỏng - lỏng phân đoạn có hệ thống qua 6 dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-hexane đến nước, phương pháp cô quay thu cao chiết thô.
3. Quy trình sắc ký phân tách: Bố trí hệ dung môi rửa giải gradient (chloroform : methanol và chloroform : methanol : nước) trên cột silica gel và cột pha đảo RP-18 để tinh sạch hoạt chất.
4. Bộ dữ liệu đối chiếu: Bảng dữ liệu định lượng về hiệu suất thu hồi dung môi, đường kính vòng kháng khuẩn, thông số MIC và hệ số di chuyển $R_f$ của các phân đoạn chiết từ chủng Bacillus sp. nội sinh.

Câu hỏi thường gặp

1. Khả năng kháng MRSA của chủng Bacillus sp. RD26 nằm ở dịch ngoại bào hay dịch nội bào?
Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính kháng MRSA tập trung hoàn toàn ở dịch ngoại bào (đường kính vòng kháng khuẩn đạt $29,67 \pm 0,67\text{ mm}$), trong khi dịch nội bào sau khi phá màng tế bào bằng siêu âm không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ($0\text{ mm}$).

2. Dung môi nào cho hiệu suất thu hồi cao nhất và dung môi nào cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất?
Dung môi ethyl acetate cho hiệu suất thu hồi cao nhất đạt 5,15% ($5,15 \pm 0,2\text{ g}$ từ 100 mL dịch khuẩn), nhưng dung môi methanol cho hoạt tính kháng MRSA mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn đạt $18,67 \pm 0,57\text{ mm}$ và giá trị $\text{MIC} = 128\text{ µg/mL}$.

3. Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 6 loại cao chiết đối với MRSA là bao nhiêu?
Giá trị MIC của các cao chiết đối với Staphylococcus aureus ATCC 43300 lần lượt là: cao methanol đạt $128\text{ µg/mL}$; cao ethyl acetate và chloroform đạt $256\text{ µg/mL}$; cao n-hexane, dichloromethane và nước đạt $512\text{ µg/mL}$.

4. Hệ dung môi nào được dùng trong sắc ký lớp mỏng (TLC) và giá trị Rf của các cao chiết là bao nhiêu?
Hệ dung môi khai triển TLC là chloroform : methanol (tỷ lệ 65:35). Giá trị $R_f$ tương ứng của các cao chiết là: n-hexane ($R_f = 0,52$), chloroform ($R_f = 0,735$), dichloromethane ($R_f = 0,74$), ethyl acetate ($R_f = 0,66$), methanol ($R_f = 0,54$) và nước ($R_f = 0,50$).

5. Hợp chất tinh khiết nào đã được phân lập và xác định cấu trúc từ cao chiết Bacillus sp. RD26?
Từ các phân đoạn của cao chiết methanol, tác giả đã tinh sạch và xác định được cấu trúc của hợp chất ký hiệu BR01 là pyrimidine-2,4-dione (thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR 500 MHz và $^{13}\text{C}$-NMR 125 MHz trong dung môi $\text{DMSO-}d_6$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Lành đã khảo sát thực nghiệm quá trình phân lập, chiết tách và nhận diện hoạt chất kháng tụ cầu vàng kháng methicillin (S. aureus ATCC 43300) từ chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26. Kết quả nghiên cứu xác định hoạt chất kháng khuẩn được vi khuẩn tiết hoàn toàn ra môi trường ngoại bào, trong đó cao chiết phân đoạn bằng dung môi methanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội với đường kính vòng vô khuẩn $18,67 \pm 0,57\text{ mm}$ và nồng độ ức chế tối thiểu $\text{MIC} = 128\text{ µg/mL}$. Bằng kỹ thuật sắc ký cột kết hợp sắc ký pha đảo RP-18 và phân tích phổ NMR, đề tài đã phân lập và xác định thành công cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học BR01 là pyrimidine-2,4-dione, cung cấp dẫn liệu thực nghiệm cho các nghiên cứu khai thác nguồn hoạt chất tự nhiên từ vi khuẩn nội sinh tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát Theo danh sách công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (2018), có 12 loài vi khuẩn và các họ vi khuẩn kháng thuốc gây ra mối đe dọa lớn nhất đối với sức khỏe con người. Trong đó, Staphylococcus aureus - tụ cầu vàng, được xếp vào nhóm vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ ưu tiên cao (WHO, 2018).

Vi khuẩn này thường gây ra các bệnh nhiễm trùng trên da như loét, mụn mủ hoặc nhọt. Nhiễm trùng có thể đi vào nơi phẫu thuật, trong máu hoặc gây ra viêm phổi,… Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S.aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra. MRSA là một nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cũng như nhiễm trùng cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác. MRSA đang là tác nhân đa kháng thuốc, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người trên toàn thế giới (WHO, 2018).

Hợp chất sinh học là các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn hoặc thực vật, có những hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virus, hoạt tính dược lý (Kalia và cs. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng, bởi lợi ích của nó đối với sức khỏe con người. Phần lớn các hợp chất này được tổng hợp bởi vi khuẩn nội sinh giúp thực vật có khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh, được sử dụng trong các ngành dược phẩm như thuốc kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống đái tháo đường và các hợp chất hoạt tính sinh học khác (Guo và cs. Một số ví dụ điển hình bao gồm thuốc kháng sinh mới Ecomycin được tạo ra từ vi khuẩn nội sinh Pseudomonas viridiflava và Pseudomycin từ vi khuẩn Pseudomonas syringae (Christina và cs.

Năm 2013, Sunkar và cộng sự đã phân lập và xác định được vi khuẩn nội sinh Brasica oleracea có khả năng sinh các enzyme amylase, protease, cellulase có tiềm năng trong sản xuất enzyme với quy mô lớn. Bacillus là một trong những đối tượng nghiên cứu rất rộng rãi vì chúng sinh ra các hợp chất thứ cấp có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh. Công trình nghiên cứu của Jeyanthi và cộng sự (2016) đã tiến hành tinh sạch, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất có hoạt tính sinh học kháng MRSA được phân lập từ Bacillus amyloliquefaciens. Năm 2017, Chauha và cộng sự thực hiện nghiên cứu chất kháng SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát khuẩn mới từ chủng Bacillus được phân lập từ đất có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc như S. aureus kháng methicillin và vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes. Từ một số công trình nghiên cứu trên cho thấy chủng Bacillus có tiềm năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học rất cao.

Các hợp chất này có nhiều các cấu trúc hóa học đặc biệt phức tạp, với hàng loạt các nhóm chức năng đặc trưng, đa dạng hơn so với nhóm kháng sinh và chất chuyển hóa thứ cấp từ vi sinh vật khác (Shukla, 2015). Ở Việt Nam, còn ít các công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc từ vi sinh vật nội sinh. Thừa kế từ công trình nghiên cứu trước, chủng vi khuẩn Bacillus sp. RD26 được phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum.

Et thonn) có khả năng kháng MRSA. Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài với nội dung như sau: “Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).” Mục tiêu: Phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 nội sinh có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).

Nội dung: − Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào. − Chiết các hợp chất từ vi khuẩn Bacillus sp. RD26 với các dung môi: n- hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl axetate, methanol và nước. − Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao chiết chủng Bacillus sp.

RD26 thu được bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby – Bauer. − Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 kháng MRSA bằng phương pháp pha loãng. − Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).

SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát − Thu nhận phân đoạn chứa các chất có hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp sắc ký cột. − Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng MRSA.

SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS.

Nguyễn Tấn Phát 2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN S.aureus đề kháng với penicillin được phát hiện lần đầu tiên vào đầu thập niên 1940, chỉ một thời gian ngắn sau penicillin được đưa vào sử dụng. Nhưng trong nhiều năm sau đó thì những dòng vi khuẩn kháng penicillin này vẫn còn nhạy với các penicillin bền vững với penicillinase (oxacillin, methicillin, nafcillin), còn gọi là penicillin M. Đến giữa thập niên 1960, bắt đầu xuất hiện những dòng vi khuẩn S.aureus kháng penicillin M, được gọi là “methicillin resistant S.aureus đề kháng với penicillin thông qua cơ chế β-lactamase và hiện nay đã có một tỷ lệ rất cao S.aureus kháng với penicillin bằng cách tiết enzyme β-lactam; MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’).

Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam ( Phạm Hùng Vân, 2013). MRSA được viết tắt với tên gọi Methicillin resistant S. Kể từ những năm 1960, MRSA trở nên phổ biến trên toàn cầu và là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện và cộng đồng. Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm beta -lactam (như methicillin) ( Lee và cs.

Phân loại khoa học Giới: Eubacteria Ngành: Eubacteria Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát Họ: Staphylococcaceae Chi: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus S. aureus là một trong những mầm bệnh phổ biến nhất trong các cơ sở chăm sóc sức khỏe và trong cộng đồng, và có thể gây nhiễm trùng xâm lấn, nhiễm trùng huyết và tử vong, trong khi S.

aureus kháng methicillin (MRSA) cấu thành một mối quan tâm nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng do khả năng xâm chiếm và lây nhiễm cho người và động vật (Kourtis và cs. MRSA được phân lập tại Châu Âu đầu tiên vào năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại Mỹ ở thập niên 1980 (tỷ lệ nhiễm MRSA 10 - 40%). Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S. aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra: Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90% (WHO,2018).

MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác. Tần suất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những người gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người / hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV / AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1999 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119%, hay 14% mỗi năm (Klein và cs.650 trường hợp nhiễm dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2011) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs. Đứng trước tình hình S. aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết được enzyme penicillinase phá huỷ được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định penicillin M để điều trị các nhiễm khuẩn do S.

Tuy nhiên hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S. aureus kháng được penicillin M (MRSA) với tỷ lệ ngày càng gia tăng. Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực hiện năm 2005 trên 235 chủng S. aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát nhiễm khuẩn do S. aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47%. Tổng kết tại Bệnh Viện Chợ Rẫy và Bạch mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43%.

Tổng kết của GARP:VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại VN vào năm 2008 là từ 30% đến 64%. Bệnh viện Thống Nhất TP. HCM từ năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 79% S. aureus phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiết niệu kháng methicillin.

Chỉ định kháng sinh dành cho MRSA là vancomycin, tuy nhiên hiện nay chỉ định này đang phải đối diện với một thách thức mới, không phải là do xuất hiện đề kháng vancomycin mà là do MIC của vancomycin đối với S. aureus bị tăng vượt quá 1.5 μg/mL gây thất bại điều trị vancomycin trên lâm sàng. Thách thức này hiện nay đã được ghi nhận tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Chợ Rẫy với ghi nhận 46% các chủng MRSA là có MIC của vancomycin ≥2 μg/mL và 93% có MIC ≥1. Một nghiên cứu tương đối rộng ở 3 tỉnh ( Đà Nẵng, Cần Thơ và Tp.

Hồ Chí Minh) của Phạm Hồng Vân và Phạm Thái Bình cho thấy MRSA kháng lại hầu hết các loại kháng sinh thông dụng, kể cả kháng sinh thế hệ mới (gentamycin: 42%, erythromycin: 63%, azithromycin: 68%, ciprofloxacin: 39%, cefuroxime: 38%, amoxillin - acid clavuanic: 30%, chloramphenicol: 38%, methicillin: 47%). Tuy chỉ có hai loại kháng sinh là vancomycin và linezolid chưa thấy đề kháng ( Cao Thị Thu Quế, 2015). VI KHUẨN NỘI SINH BACILLUS SP. Phân loại Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát 2.