Luận văn thạc sĩ về phân lập và phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng về an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Hoa
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Xuân Cảnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• THESIS ABSTRACT
• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. KHÁI NIỆM NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
• 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm
• 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
• 1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ Bacillus cereus
• 1.2.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái Bacillus cereus
• 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn Bacillus cereus tại Việt Nam

Nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus cereus là một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm tại Việt Nam. Bacillus cereus là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng sinh độc tố, gây ra ngộ độc thực phẩm với triệu chứng nôn mửa và tiêu chảy. Theo thống kê, Việt Nam ghi nhận hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm mỗi năm, trong đó có một phần lớn do Bacillus cereus. Việc phân lập và phát hiện vi khuẩn này là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

1.1. Đặc điểm sinh học của Bacillus cereus

Bacillus cereus có khả năng hình thành bào tử, giúp chúng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt. Kích thước tế bào khoảng 3-5µm, có khả năng di động nhờ lông roi. Vi khuẩn này có thể phát triển ở dải nhiệt độ rộng từ 5-50°C, với pH tối ưu từ 7-7.2.

1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus

Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus thường xảy ra ở các bữa ăn không đảm bảo vệ sinh. Các triệu chứng bao gồm nôn mửa, tiêu chảy và đau bụng. Tình trạng này đang gia tăng tại Việt Nam, đặc biệt là trong các sản phẩm từ gạo.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phát hiện Bacillus cereus

Việc phát hiện Bacillus cereus trong thực phẩm gặp nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Hơn nữa, sự hiện diện của vi khuẩn này trong thực phẩm có thể không được phát hiện kịp thời, dẫn đến nguy cơ ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng.

2.1. Các phương pháp phát hiện truyền thống

Phương pháp phát hiện truyền thống bao gồm phân lập vi khuẩn trên môi trường chọn lọc và xác định các đặc tính sinh hóa. Tuy nhiên, những phương pháp này thường tốn thời gian và không đủ nhạy để phát hiện vi khuẩn ở nồng độ thấp.

2.2. Thách thức trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm

Việc kiểm soát an toàn thực phẩm tại Việt Nam còn nhiều hạn chế. Thiếu kiến thức về vệ sinh an toàn thực phẩm và sự không đồng bộ trong quy định pháp lý là những yếu tố cản trở việc phát hiện và kiểm soát Bacillus cereus.

III. Phương pháp phân lập và phát hiện Bacillus cereus hiệu quả

Để phát hiện Bacillus cereus, các phương pháp hiện đại như PCR đang được áp dụng rộng rãi. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các gen mã hóa độc tố của vi khuẩn, từ đó giúp kiểm soát ngộ độc thực phẩm hiệu quả hơn.

3.1. Kỹ thuật PCR trong phát hiện Bacillus cereus

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu của Bacillus cereus. Phương pháp này có độ nhạy cao, giúp phát hiện vi khuẩn ngay cả ở nồng độ thấp trong thực phẩm.

3.2. So sánh các phương pháp phát hiện

So với các phương pháp truyền thống, PCR có ưu điểm vượt trội về độ nhạy và tốc độ. Điều này giúp giảm thiểu thời gian chờ đợi kết quả và tăng cường khả năng phát hiện sớm các mối nguy hại từ Bacillus cereus.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về Bacillus cereus

Nghiên cứu về Bacillus cereus đã cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn này trong nhiều loại thực phẩm tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng các phương pháp hiện đại trong phát hiện vi khuẩn này có thể giúp giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ thực phẩm

Trong nghiên cứu, đã phân lập được 11 chủng Bacillus cereus từ các mẫu thực phẩm khác nhau. Các chủng này đều có khả năng sinh độc tố, cho thấy nguy cơ ngộ độc thực phẩm là rất cao.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc xây dựng các quy trình kiểm tra an toàn thực phẩm, từ đó nâng cao nhận thức của người tiêu dùng về nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu Bacillus cereus tại Việt Nam

Nghiên cứu về Bacillus cereus là một lĩnh vực quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm tại Việt Nam. Cần tiếp tục đầu tư vào nghiên cứu và phát triển các phương pháp phát hiện hiện đại để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu Bacillus cereus

Trong tương lai, việc áp dụng công nghệ sinh học và các phương pháp hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện và kiểm soát Bacillus cereus, từ đó giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

5.2. Đề xuất các giải pháp nâng cao an toàn thực phẩm

Cần có các giải pháp đồng bộ từ chính phủ, cơ quan chức năng và người tiêu dùng để nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm, từ đó giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hàng năm tại Việt Nam ghi nhận trung bình từ 250 đến 500 vụ ngộ độc thực phẩm, khiến hơn 7.000 người mắc và cướp đi sinh mạng của 100 đến 200 nạn nhân. Trong đó, các vụ ngộ độc bắt nguồn từ vi sinh vật chiếm tỷ lệ áp đảo từ 33% đến 49% tổng số vụ việc. Trực khuẩn Bacillus cereus là tác nhân nguy hiểm hàng đầu do khả năng sinh nội bào tử bền vững trong tự nhiên và tiết ra nhiều loại độc tố gây bệnh, bao gồm hội chứng nôn ói cấp tính cùng hội chứng tiêu chảy kéo dài. Mặc dù nguy cơ lây nhiễm trong các thực phẩm giàu tinh bột như gạo, bún, phở là rất lớn, nhưng năng lực kiểm nghiệm vi sinh hiện nay mới chỉ đáp ứng tại khoảng 60% số tỉnh thành với 38 trung tâm y tế đủ điều kiện phân tích. Phương pháp xét nghiệm truyền thống mất nhiều ngày nuôi cấy và không phân biệt được chủng sinh độc tố.

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus cereus từ môi trường và thực phẩm tại Việt Nam, đồng thời xây dựng quy trình sinh học phân tử dựa trên kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh các gen mã hóa độc tố đường ruột. Đề tài được triển khai trong mốc thời gian từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017 tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện qua việc rút ngắn thời gian phát hiện vi khuẩn từ 5 ngày xuống dưới 6 giờ, đạt ngưỡng phát hiện nhạy bén 3,5 x 10^3 CFU/ml trên mẫu thực phẩm, góp phần nâng cao hiệu quả giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm và giảm thiểu thiệt hại kinh tế do dịch bệnh đường tiêu hóa gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu được xây dựng trên hệ thống phân loại vi sinh vật học hiện đại đối với chi Bacillus và mô hình sinh bệnh học độc tố vi khuẩn. Vi khuẩn Bacillus cereus thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, họ Bacillaceae, là trực khuẩn Gram dương hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện với kích thước tế bào dài 3 đến 5 µm, rộng 1 đến 1,2 µm và có khả năng hình thành nội bào tử hình elip kích thước 1 đến 1,5 µm. Đặc tính sinh học quan trọng bao gồm sự sinh trưởng trong dải nhiệt độ từ 5 đến 50°C, tối ưu ở 30 đến 37°C, pH thích hợp từ 4,3 đến 9,3 và khả năng chịu nồng độ muối NaCl lên tới 7,5%.

Khung lý thuyết độc tố học phân định rõ hai cơ chế gây bệnh chính: hội chứng nôn do độc tố peptide vòng cereulide có trọng lượng 1,2 kDa, bền nhiệt ở 121°C trong 90 phút và ổn định ở dải pH từ 2 đến 11; hội chứng tiêu chảy do phức hợp độc tố ruột protein ba thành phần HBL (mã hóa bởi các gen hblA, hblC, hblD), phức hợp NHE (nheA, nheB, nheC), cùng các độc tố đơn thành phần như CytK (605 bp), BceT (428 bp) và EntFM (1269 bp). Bên cạnh đó, nghiên cứu vận dụng lý thuyết phân loại học phân tử dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA để định danh chính xác loài vi khuẩn có mức độ tương đồng di truyền cao.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn dữ liệu thực nghiệm thu thập từ 25 mẫu thực phẩm giàu tinh bột (bánh phở, bún tươi, cơm chín) và mẫu đất quanh các cơ sở kinh doanh ăn uống tại khu vực Hà Nội. Cỡ mẫu này được xác định nhằm bao quát các nguồn lây nhiễm phổ biến trong điều kiện khí hậu nóng ẩm của miền Bắc. Phương pháp chọn mẫu áp dụng là lấy mẫu ngẫu nhiên phân tầng theo chuỗi cung ứng thực phẩm đường phố và môi trường tiếp xúc trực tiếp.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích tích hợp bao gồm nuôi cấy chọn lọc trên môi trường MYP, kiểm tra đặc tính sinh hóa (catalase, Voges-Proskauer, gelatinase, tan máu cừu) kết hợp kỹ thuật PCR và giải trình tự 16S rDNA. Phương pháp PCR được ưu tiên nhờ độ đặc hiệu vượt trội, loại bỏ các phản ứng chéo, cho phép phát hiện trực tiếp gen độc lực trong mẫu mà phương pháp nuôi cấy đếm khuẩn lạc truyền thống không thể thực hiện. Toàn bộ quy trình từ khâu thu thập mẫu, phân lập, tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp nhiệt, chạy phản ứng chu trình nhiệt PCR đến giải trình tự trên hệ thống ABI được hoàn thành trong chu kỳ 9 tháng thực nghiệm từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân lập từ các mẫu thực nghiệm đã thu nhận được 11 chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu hồng eosin trên môi trường chọn lọc MYP và mang đặc điểm trực khuẩn Gram dương sinh nội bào tử. Đánh giá sinh hóa khẳng định 100% số chủng (11/11 chủng) có phản ứng dương tính với catalase, gelatinase và thử nghiệm Voges-Proskauer, trong đó có 4 chủng (chiếm 36,36% bao gồm D1.7, B1, B4, Đ) biểu hiện rõ khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu cừu.

Chủng D1.7 được lựa chọn để giải trình tự đoạn gen 16S rDNA có kích thước khoảng 1500 bp. Kết quả tra cứu BLAST và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA7 với hệ số lặp lại bootstrap 1000 lần xác nhận chủng D1.7 đạt độ tương đồng 99% với loài chuẩn, chính thức định danh là chủng Bacillus cereus D1.7.

Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã xác định chủng Bacillus cereus D1.7 mang đồng thời 6 gen mã hóa độc tố đường ruột gồm nheA (480 bp), hblA (319 bp), hblD (429 bp), cytK (605 bp), bceT (428 bp) và entFM (1269 bp). Phản ứng PCR xác định độ nhạy đạt giới hạn phát hiện 3,5 x 10^3 vi khuẩn/ml. Khi thử nghiệm trên mẫu cơm thực nghiệm giả định có bổ sung vi khuẩn nền Bacillus subtilis ở nồng độ 10^8 tế bào/ml, quy trình vẫn khuếch đại chính xác gen hblD ở ngưỡng nồng độ 3,5 x 10^3 vi khuẩn/ml.

Thảo luận kết quả

Sự hiện diện đồng thời của cả 6 gen độc tố đường ruột ở chủng phân lập D1.7 phản ánh nguy cơ tiềm ẩn rất lớn đối với sức khỏe người tiêu dùng. Kết quả này tương đồng với các công bố quốc tế, khi phức hợp nhe xuất hiện ở hơn 97% và phức hợp hbl có mặt ở 50% đến 66% các chủng Bacillus cereus gây ngộ độc. Khả năng phát hiện gen độc tố ở ngưỡng 3,5 x 10^3 vi khuẩn/ml thấp hơn nhiều so với liều gây nhiễm lâm sàng (10^5 đến 10^8 tế bào/g), chứng minh tính ưu việt của phương pháp.

Dữ liệu nghiên cứu được trực quan hóa thông qua bảng đối sánh tính chất sinh lý sinh hóa và điện di đồ sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5%. Một biểu đồ so sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống (giới hạn 10^5 CFU/g) và kỹ thuật PCR (giới hạn 3,5 x 10^3 CFU/ml) minh chứng rõ nét độ nhạy cao gấp gần 30 lần của quy trình sinh học phân tử. Đồng thời, bảng ma trận phân bố gen cho thấy quy trình PCR đa mồi giúp phân biệt hoàn toàn Bacillus cereus với các loài họ hàng như Bacillus thuringiensis và Bacillus anthracis, mang lại độ tin cậy tuyệt đối trong kiểm nghiệm lâm sàng và vệ sinh an toàn thực phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát nguy cơ ngộ độc thực phẩm từ Bacillus cereus, bốn giải pháp trọng tâm được đề xuất thực hiện:

1. Chuyển giao và chuẩn hóa quy trình xét nghiệm PCR đa mồi: Cục An toàn thực phẩm phối hợp với các viện nghiên cứu tiến hành chuẩn hóa bộ kit thử nghiệm phát hiện nhanh các gen hblD, nheA, cytK, nâng tỷ lệ các trung tâm y tế tuyến tỉnh có năng lực kiểm nghiệm vi sinh phân tử từ mức 60% hiện nay lên 90% trước năm 2026, đảm bảo thời gian trả kết quả xét nghiệm dưới 6 giờ.
2. Tăng cường giám sát định kỳ đối với các cơ sở chế biến thực phẩm giàu tinh bột: Chi cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm các địa phương triển khai thanh tra, lấy mẫu vi sinh định kỳ hàng quý tại 100% các cơ sở sản xuất bún, bánh phở và bếp ăn tập thể, đặt mục tiêu kéo giảm 35% số vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật trong giai đoạn 2024 đến 2027.
3. Ban hành quy chuẩn kỹ thuật bắt buộc về kiểm soát nhiệt độ bảo quản thực phẩm chín: Bộ Y tế cần bổ sung quy định nghiêm ngặt yêu cầu các bếp ăn thương mại duy trì nhiệt độ bảo quản thức ăn chín trên 60°C hoặc làm mát nhanh xuống dưới 5°C trong vòng 2 giờ sau khi chế biến, nhằm ức chế 100% sự nảy mầm của bào tử vi khuẩn, áp dụng đồng bộ từ năm 2025.
4. Đẩy mạnh công tác truyền thông và tập huấn vệ sinh an toàn thực phẩm: Các trung tâm y tế dự phòng tổ chức tối thiểu 120 khóa đào tạo chuyên đề mỗi năm cho các hộ kinh doanh dịch vụ ăn uống đường phố, hướng đến mục tiêu 85% người trực tiếp chế biến hiểu rõ mối nguy từ độc tố chịu nhiệt cereulide và thực hiện đúng quy trình vệ sinh dụng cụ trước năm 2026.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

1. Chuyên viên kiểm nghiệm và cán bộ nghiên cứu vi sinh: Tiếp cận quy trình tách chiết DNA nhiệt đơn giản, tiết kiệm chi phí và hệ thống mồi PCR đặc hiệu để xây dựng quy trình phân tích chuẩn ISO 17025 tại các phòng kiểm nghiệm thực phẩm với thời gian xử lý mẫu dưới 4 giờ.
2. Cơ quan quản lý nhà nước và thanh tra an toàn thực phẩm: Sử dụng các số liệu dịch tễ học và bằng chứng phân tử về độc lực học của vi khuẩn làm căn cứ khoa học để hoàn thiện tiêu chuẩn quốc gia TCVN, đồng thời phục vụ công tác truy xuất nguồn gốc trong các cuộc điều tra ngộ độc tập thể.
3. Doanh nghiệp và cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm: Nắm vững các thông số sinh học về khả năng chịu nhiệt của nội bào tử và độc tố cereulide (bền ở 121°C) nhằm tối ưu hóa thông số tiệt trùng trong quy trình sản xuất, thiết lập hệ thống kiểm soát điểm tới hạn HACCP và cải tiến bao bì đóng gói.
4. Giảng viên, học viên sau đại học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học: Sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo hoàn chỉnh về phương pháp kết hợp giữa kỹ thuật vi sinh cổ điển và sinh học phân tử (16S rDNA, PCR đa mồi, phân tích phát sinh loài) phục vụ nghiên cứu và giảng dạy chuyên ngành.

Câu hỏi thường gặp

Vi khuẩn Bacillus cereus gây ra những dạng ngộ độc thực phẩm nào và triệu chứng ra sao? Vi khuẩn này gây ra 2 thể bệnh lâm sàng chính. Thể nôn có thời gian ủ bệnh ngắn từ 0,5 đến 5 giờ, gây buồn nôn dữ dội do độc tố cereulide tích tụ sẵn trong thực phẩm. Thể tiêu chảy xuất hiện sau 8 đến 16 giờ với các triệu chứng đau quặn bụng và đi ngoài phân lỏng do độc tố ruột được tiết ra khi tế bào vi khuẩn đạt mật độ 10^5 đến 10^7 CFU/g trong ruột non.

Tại sao việc đun sôi lại không thể ngăn ngừa hoàn toàn nguy cơ ngộ độc từ vi khuẩn này? Đun sôi thông thường không thể loại trừ triệt để nguy cơ vì vi khuẩn tạo ra nội bào tử chịu nhiệt cao sống sót qua quá trình nấu. Thêm vào đó, độc tố cereulide có cấu trúc peptide vòng cực kỳ bền vững, giữ nguyên hoạt tính sinh học ngay cả khi xử lý ở 121°C trong 90 phút hoặc tiếp xúc với dải pH từ 2 đến 11 trong dạ dày.

Kỹ thuật PCR có ưu điểm nổi bật gì so với các phương pháp kiểm nghiệm truyền thống? Phương pháp nuôi cấy đếm khuẩn lạc truyền thống mất từ 3 đến 7 ngày và không thể xác định được khả năng sinh độc tố của chủng vi khuẩn. Kỹ thuật PCR cho phép phát hiện chính xác các gen độc lực như hblD, nheA, cytK chỉ trong 4 đến 6 giờ với giới hạn phát hiện đạt 3,5 x 10^3 CFU/ml, giúp ngăn chặn sớm các nguy cơ bùng phát dịch bệnh.

Những loại thực phẩm nào tại Việt Nam có nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn cao nhất? Các thực phẩm giàu tinh bột có nguồn gốc từ gạo như cơm nguội, cơm rang, bánh phở, bún tươi và các loại gia vị khô có tỷ lệ nhiễm cao nhất. Đất tự nhiên chứa từ 10^3 đến 10^5 bào tử/g là nguồn lây nhiễm ban đầu vào nguyên liệu, sau đó bào tử nảy mầm và nhân lên nhanh chóng khi thực phẩm được lưu trữ ở nhiệt độ phòng từ 30 đến 37°C.

Ngưỡng phát hiện 3,5 x 10^3 vi khuẩn/ml trong nghiên cứu có ý nghĩa như thế nào trong thực tế? Ngưỡng phát hiện 3,5 x 10^3 CFU/ml thấp hơn nhiều so với mức liều gây ngộ độc thực tế (từ 10^5 đến 10^8 tế bào/g). Điều này cho phép các cơ quan kiểm nghiệm phát hiện và cảnh báo sớm tình trạng nhiễm khuẩn ngay từ khi vi khuẩn chưa nhân lên đến mức gây hại, bảo đảm tính an toàn tuyệt đối cho thực phẩm lưu thông.

Kết luận

• Phân lập thành công 11 chủng vi khuẩn mang đặc điểm hình thái và sinh hóa đặc trưng của chi Bacillus từ các mẫu thực phẩm và đất tại Việt Nam.
• Định danh chính xác chủng D1.7 là Bacillus cereus với độ tương đồng trình tự 16S rDNA đạt 99% và giá trị tin cậy bootstrap đạt 100.
• Xác định chủng Bacillus cereus D1.7 mang đồng thời 6 gen mã hóa độc tố đường ruột gồm nheA, hblA, hblD, cytK, bceT và entFM.
• Xây dựng thành công quy trình PCR với độ nhạy đạt 3,5 x 10^3 CFU/ml, phát hiện ổn định gen hblD trên nền thực phẩm cơm thực nghiệm có chứa vi khuẩn cạnh tranh.
• Đóng góp một quy trình kiểm nghiệm sinh học phân tử có độ chính xác cao, chi phí thấp, rút ngắn thời gian chẩn đoán phục vụ công tác an toàn vệ sinh thực phẩm.

Trong giai đoạn 2024 đến 2025, các trung tâm kiểm nghiệm và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm cần chủ động tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ này để nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng. Hãy áp dụng ngay các giải pháp sinh học phân tử tiên tiến để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và nâng cao uy tín cho ngành thực phẩm Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là một tình trạng bệnh lý xảy ra do ăn uống phải các thức ăn bị ô nhiễm chất độc hại đối với sức khoẻ con người. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra, nhưng trong số đó thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1]. Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có 2 dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh.

Dạng khác là vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người, sự hiện diện của chúng hoặc các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Bacillus cereus là vi khuẩn có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn [29]. Chủng vi khuẩn này còn có khả năng hình thành bào tử và phân bố rộng khắp trong môi trường, vì thế đây là nhóm vi khuẩn quan trọng khi nhìn từ khía cạnh vệ sinh thực phẩm. Việt Nam là nước có điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B.

cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B. cereus là không nhỏ tại Việt Nam. Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định B. cereus gây ngộ độc thực phẩm: Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các đặc tính sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn.

Phương pháp ELISA. Phương pháp phát hiện gen dựa vào phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR). Trong đó phương pháp phát hiện gen nhờ PCR đang được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác được sự ô nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh.

Ưu điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể cả nguyên vật liệu. Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng gây 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ngộ độc thực phẩm là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực trong việc góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm do B. Do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam”.

Đề tài được đặt ra nhằm đạt được mục tiêu sau: Phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm từ các chủng phân lập tại Việt Nam. Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nội dung sau: - Phân lập và xác định vi khuẩn B. cereus từ các mẫu khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự 16s rDNA.

- Phát hiện gen mã hoá độc tố của các chủng B. cereus bằng kỹ thuật PCR. - Xác định độ nhạy của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện B. - Phát hiện vi khuẩn B.

cereus sinh độc tố trong một số thực phẩm giả định bằng kỹ thuật PCR. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. KHÁI NIỆM NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 2.

Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [6]. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc, đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn thường xuyên xảy ra, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố.

Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[5]. Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật luôn là nguyên nhân phổ biến nhất. Các loại vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất là tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…[2]. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ Bacillus cereus 2.

Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus Phân loại quốc tế B. cereus: • Thuộc giới Bacteria • Ngành (phylum) Firmicutes • Lớp (class) Bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceae • Chi (genus) Bacillus 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887. Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn.

Các vụ dịch ngộ độc thức ăn do B. cereus có đặc điểm là nôn và tiêu chảy [25]. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml và uống 200ml cocktail. Sau 13h ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h.

Hơn 20 năm sau một triệu chứng ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus gây ra lại xuất hiện ở công nhân Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h). cereus được công nhận là một nguyên nhân quan trọng của ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [28].

Đặc điểm hình thái Bacillus cereus Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus như là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [31], thì B. cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B.

cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động. cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng.

Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối [18]. Khả năng hình thành bào tử là đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất.

Vì vậy, khả năng lây nhiễm B. cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn. Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng khô hạn…, B.

cereus sẽ sinh nội bào tử. Nội bào tử nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài. Khi gặp môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu…, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng.

Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất. Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] lợi nội bào tử lại được hình thành [4]. Do bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng nên trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B.

Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 2. Đặc điểm nuôi cấy Là loại vi khuẩn dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường. cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng 5 - 50oC, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của B. cereus là 30 - 37oC.

 Độ pH biến thiên từ 4,3 – 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,2. cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7 – 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [18, 27].  Trên môi trường LB lỏng: đục Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7 – 7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B.

cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzyme lecithinase) [17,19,27]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA, khuẩn lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4 – 0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,32]. Khuẩn lạc vi khuẩn B.

cereus trên môi trường MYP (A), trên môi trường thạch máu (B) Trên môi trường thạch máu, B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết. Đây là một trong các đặc điểm để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn khác như B.

anthracis (không có khả năng sinh ra haemolysin), đây cũng là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. Đặc điểm sinh hóa Để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn trong Bacillus nhóm 1 (B. thuringiensis,…) dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L – tyrosine.