MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là một tình trạng bệnh lý xảy ra do ăn uống phải các thức ăn bị ô nhiễm chất độc hại đối với sức khoẻ con người. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra, nhưng trong số đó thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1]. Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có 2 dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh.
Dạng khác là vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người, sự hiện diện của chúng hoặc các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Bacillus cereus là vi khuẩn có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn [29]. Chủng vi khuẩn này còn có khả năng hình thành bào tử và phân bố rộng khắp trong môi trường, vì thế đây là nhóm vi khuẩn quan trọng khi nhìn từ khía cạnh vệ sinh thực phẩm. Việt Nam là nước có điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B.
cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B. cereus là không nhỏ tại Việt Nam. Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định B. cereus gây ngộ độc thực phẩm: Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các đặc tính sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn.
Phương pháp ELISA. Phương pháp phát hiện gen dựa vào phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR). Trong đó phương pháp phát hiện gen nhờ PCR đang được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác được sự ô nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh.
Ưu điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể cả nguyên vật liệu. Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng gây 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ngộ độc thực phẩm là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực trong việc góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm do B. Do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam”.
Đề tài được đặt ra nhằm đạt được mục tiêu sau: Phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm từ các chủng phân lập tại Việt Nam. Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nội dung sau: - Phân lập và xác định vi khuẩn B. cereus từ các mẫu khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự 16s rDNA.
- Phát hiện gen mã hoá độc tố của các chủng B. cereus bằng kỹ thuật PCR. - Xác định độ nhạy của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện B. - Phát hiện vi khuẩn B.
cereus sinh độc tố trong một số thực phẩm giả định bằng kỹ thuật PCR. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. KHÁI NIỆM NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 2.
Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [6]. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc, đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn thường xuyên xảy ra, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố.
Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[5]. Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật luôn là nguyên nhân phổ biến nhất. Các loại vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất là tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…[2]. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ Bacillus cereus 2.
Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus Phân loại quốc tế B. cereus: • Thuộc giới Bacteria • Ngành (phylum) Firmicutes • Lớp (class) Bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceae • Chi (genus) Bacillus 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887. Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn.
Các vụ dịch ngộ độc thức ăn do B. cereus có đặc điểm là nôn và tiêu chảy [25]. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml và uống 200ml cocktail. Sau 13h ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h.
Hơn 20 năm sau một triệu chứng ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus gây ra lại xuất hiện ở công nhân Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h). cereus được công nhận là một nguyên nhân quan trọng của ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [28].
Đặc điểm hình thái Bacillus cereus Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus như là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [31], thì B. cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B.
cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động. cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng.
Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối [18]. Khả năng hình thành bào tử là đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất.
Vì vậy, khả năng lây nhiễm B. cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn. Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng khô hạn…, B.
cereus sẽ sinh nội bào tử. Nội bào tử nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài. Khi gặp môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu…, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng.
Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất. Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com lợi nội bào tử lại được hình thành [4]. Do bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng nên trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B.
Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 2. Đặc điểm nuôi cấy Là loại vi khuẩn dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường. cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng 5 - 50oC, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của B. cereus là 30 - 37oC.
Độ pH biến thiên từ 4,3 – 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,2. cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7 – 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [18, 27]. Trên môi trường LB lỏng: đục Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7 – 7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B.
cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzyme lecithinase) [17,19,27]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA, khuẩn lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4 – 0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,32]. Khuẩn lạc vi khuẩn B.
cereus trên môi trường MYP (A), trên môi trường thạch máu (B) Trên môi trường thạch máu, B. cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết. Đây là một trong các đặc điểm để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn khác như B.
anthracis (không có khả năng sinh ra haemolysin), đây cũng là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. Đặc điểm sinh hóa Để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn trong Bacillus nhóm 1 (B. thuringiensis,…) dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L – tyrosine.