Nghiên cứu phân lập và ứng dụng thực khuẩn thể Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm

• Tác giả: Trịnh Thu Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu phân lập tuyển chọn thực khuẩn thể ly giải đặc hiệu Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus cereus
• 1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bacillus cereus
• 1.1.3. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus
• 1.1.4. Các yếu tố gây độc của Bacilus cereus
• 1.1.5. Tổng quan về thực khuẩn thể
• 1.1.5.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu
• 1.1.6. Hình thái và phân loại
• 1.1.7. Sự nhân lên của thực khuẩn thể trong tế bào vật chủ
• 1.1.8. Một số nghiên cứu và ứng dụng
• 1.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.2.2. Trang thiết bị
• 1.2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.3.1. Phương pháp phân lập thực khuẩn thể. Khảo sát phổ vật chủ của thực khuẩn thể
• 1.2.3.2. Xác định tỷ lệ lây nhiễm của thực khuẩn thể
• 1.2.3.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của thực khuẩn thể
• 1.2.3.4. Phân loại chủng thực khuẩn thể được tuyển chọn
• 1.2.3.5. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sự ổn định của TKT
• 1.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.3.1. Kết quả phân lập TKT
• 1.3.2. Kết quả xác định phổ vật chủ của TKT
• 1.3.3. Kết quả quan sát hình thái TKT qua TEM
• 1.3.4. Kết quả xác định hệ số đa nhiễm virus (MOI) in vitro
• 1.3.5. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng đơn bậc
• 1.3.6. Kết quả xác định các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến tính ổn định của TKT
• 1.3.7. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định của TKT
• 1.3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của TKT
• 1.3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tia cực tím đến TKT
• 1.3.10. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến tính ổn định của TKT
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về Bacillus cereus và ngộ độc thực phẩm 55

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật, đặc biệt là Bacillus cereus, là một vấn đề toàn cầu, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế. Theo WHO, hàng năm có khoảng 600 triệu ca ngộ độc thực phẩm, với 420.000 ca tử vong, trong đó 66% do vi sinh vật. Bacillus cereus là một tác nhân phổ biến gây hư hỏng thực phẩm, là vi khuẩn gram dương, hình que, có khả năng hình thành bào tử và sinh độc tố gây ngộ độc. Chúng có mặt trong đất, nước thải và thực phẩm như sữa, thịt, rau củ. Các phương pháp bảo quản và chế biến thực phẩm hiện nay có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm hoặc sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, việc tìm kiếm phương pháp mới, hiệu quả và an toàn hơn là rất quan trọng. Liệu pháp thực khuẩn thể được xem là một giải pháp tiềm năng.

1.1. Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus cereus

Bacillus cereus có hình que mảnh, kích thước 1.0 – 1.2 µm x 3.0 – 5.0 µm, có thể di động nhờ tiên mao. Chúng có khả năng hình thành nội bào tử hình elip hoặc trụ, giúp chúng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Khuẩn lạc của Bacillus cereus thường lớn (3-8mm), màu xám, bề mặt phẳng, có rìa gồ ghề trên môi trường thạch máu cừu. Để phân biệt Bacillus cereus với các loài Bacillus khác, các thử nghiệm sinh hóa như khả năng sinh catalase, thủy phân casein, khử nitrate và phản ứng Voges-Proskauer được sử dụng.

1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus trên thế giới

Bacillus cereus là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm hàng đầu trên thế giới. ESPA báo cáo rằng Bacillus cereus là một trong các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm hàng đầu chỉ sau Clostridium botulinum, Salmonella và virus. Tại Hoa Kỳ, có hơn một triệu ca bệnh liên quan đến thực phẩm mỗi năm là do độc tố vi khuẩn, bao gồm cả Bacillus cereus. Tại Việt Nam, ngộ độc thực phẩm đang là một vấn đề nhức nhối, đã có 1.604 vụ ngộ độc được ghi nhận từ năm 2010 đến năm 2020, nguyên nhân gây ngộ độc chủ yếu do vi sinh vật, Bacillus cereus được xem là một trong những nguyên nhân chính.

II. Thách thức kiểm soát Bacillus cereus trong thực phẩm 58

Việc kiểm soát Bacillus cereus trong thực phẩm gặp nhiều thách thức do khả năng hình thành bào tử và sinh độc tố của chúng. Các phương pháp xử lý vật lý như nhiệt, áp suất, tia UV có thể làm thay đổi đặc tính cảm quan và chất lượng của thực phẩm. Sử dụng kháng sinh có thể gây ra dư lượng trong thực phẩm và ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Các độc tố do Bacillus cereus sinh ra có thể gây ra hai thể bệnh chính: nôn mửa và tiêu chảy. Độc tố gây nôn rất bền nhiệt và khó bị phân hủy, trong khi độc tố gây tiêu chảy có thể bị phân hủy ở pH thấp và bởi các enzyme tiêu hóa. Do đó, cần có các phương pháp kiểm soát hiệu quả và an toàn hơn để giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus.

2.1. Các yếu tố gây độc của Bacillus cereus và cơ chế gây bệnh

Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh điển hình: nôn mửa và tiêu chảy. Thể tiêu chảy liên quan đến các độc tố ruột như hemolysin BL (Hbl), độc tố ruột không phân giải (Nhe) và cytotoxin K (CytK). Thể gây nôn do cereulide, một lipid không kháng nguyên bền nhiệt. Cereulide liên kết với các thụ thể 5-HT3, kích thích dây thần kinh phế vị, gây ra phản xạ nôn. Các triệu chứng có thể khó phân biệt với nhiễm độc do tụ cầu.

2.2. Các phương pháp kiểm soát Bacillus cereus hiện nay và hạn chế

Các phương pháp kiểm soát Bacillus cereus hiện nay bao gồm xử lý nhiệt, sử dụng chất bảo quản hóa học và chiếu xạ. Tuy nhiên, các phương pháp này có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm và an toàn cho người tiêu dùng. Xử lý nhiệt có thể không tiêu diệt hoàn toàn bào tử của Bacillus cereus. Chất bảo quản hóa học có thể gây ra các vấn đề về sức khỏe. Chiếu xạ có thể làm thay đổi hương vị và thành phần dinh dưỡng của thực phẩm.

III. Phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể ly giải Bacillus 59

Việc phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể có khả năng ly giải đặc hiệu Bacillus cereus là một bước quan trọng trong việc phát triển liệu pháp thực khuẩn thể để kiểm soát vi khuẩn này. Thực khuẩn thể là virus chỉ lây nhiễm và tiêu diệt vi khuẩn, có tính đặc hiệu cao và an toàn. Quá trình phân lập bao gồm thu thập mẫu từ môi trường, nuôi cấy và sàng lọc các thực khuẩn thể có khả năng ly giải Bacillus cereus. Các thực khuẩn thể được tuyển chọn phải có khả năng ly giải mạnh, phổ vật chủ rộng và ổn định trong các điều kiện môi trường khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Thu Trang (2022) đã tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể ly giải đặc hiệu Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm.

3.1. Phương pháp phân lập thực khuẩn thể từ môi trường tự nhiên

Phương pháp phân lập thực khuẩn thể thường bắt đầu bằng việc thu thập mẫu từ các nguồn khác nhau như đất, nước thải, hoặc thực phẩm bị ô nhiễm. Các mẫu này được làm giàu bằng cách nuôi cấy với Bacillus cereus để tăng số lượng thực khuẩn thể. Sau đó, mẫu được lọc để loại bỏ vi khuẩn và các hạt lớn. Thực khuẩn thể được phân lập bằng phương pháp pha loãng và cấy trên đĩa thạch, tạo thành các vết tan (plaque) trên bề mặt môi trường.

3.2. Tiêu chí tuyển chọn thực khuẩn thể có khả năng ly giải mạnh

Các tiêu chí để tuyển chọn thực khuẩn thể bao gồm khả năng ly giải mạnh, phổ vật chủ rộng, và tính ổn định. Khả năng ly giải mạnh được đánh giá bằng kích thước và độ trong của vết tan. Phổ vật chủ rộng được xác định bằng khả năng ly giải nhiều chủng Bacillus cereus khác nhau. Tính ổn định được đánh giá bằng khả năng duy trì hoạt tính ly giải trong các điều kiện môi trường khác nhau như nhiệt độ, pH, và nồng độ muối.

IV. Ứng dụng thực khuẩn thể kiểm soát Bacillus cereus 52

Ứng dụng thực khuẩn thể để kiểm soát Bacillus cereus trong thực phẩm là một hướng đi đầy hứa hẹn. Thực khuẩn thể có thể được sử dụng để giảm số lượng Bacillus cereus trong thực phẩm, ngăn ngừa sự hình thành độc tố và giảm nguy cơ ngộ độc thực phẩm. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng thực khuẩn thể có hiệu quả trong việc kiểm soát Bacillus cereus trong nhiều loại thực phẩm khác nhau, bao gồm sữa, thịt, rau và ngũ cốc. Việc sử dụng thực khuẩn thể được xem là an toàn và thân thiện với môi trường, không gây ảnh hưởng đến chất lượng và hương vị của thực phẩm.

4.1. Nghiên cứu về hiệu quả của thực khuẩn thể trên các loại thực phẩm

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của thực khuẩn thể trong việc kiểm soát Bacillus cereus trên các loại thực phẩm khác nhau. Ví dụ, một nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng thực khuẩn thể có thể giảm đáng kể số lượng Bacillus cereus trong sữa tươi. Một nghiên cứu khác cho thấy thực khuẩn thể có thể ngăn ngừa sự phát triển của Bacillus cereus trong thịt gà. Các nghiên cứu này cho thấy tiềm năng lớn của thực khuẩn thể trong việc bảo quản thực phẩm và đảm bảo an toàn thực phẩm.

4.2. Cơ chế tác động của thực khuẩn thể lên tế bào Bacillus cereus

Thực khuẩn thể tác động lên tế bào Bacillus cereus thông qua quá trình ly giải. Đầu tiên, thực khuẩn thể bám vào bề mặt tế bào vi khuẩn thông qua các thụ thể đặc hiệu. Sau đó, thực khuẩn thể bơm DNA của mình vào tế bào vi khuẩn. DNA của thực khuẩn thể sử dụng bộ máy sinh học của tế bào vi khuẩn để nhân lên và tạo ra các thành phần cấu trúc của thực khuẩn thể mới. Cuối cùng, thực khuẩn thể mới phá vỡ tế bào vi khuẩn, giải phóng các thực khuẩn thể mới để lây nhiễm các tế bào vi khuẩn khác.

V. Điều kiện ảnh hưởng đến sự ổn định của thực khuẩn thể 57

Sự ổn định của thực khuẩn thể là một yếu tố quan trọng để đảm bảo hiệu quả của chúng trong việc kiểm soát Bacillus cereus. Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, tia cực tím (UV) và nồng độ muối có thể ảnh hưởng đến sự ổn định của thực khuẩn thể. Nghiên cứu của Trịnh Thu Trang (2022) đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố này đến sự ổn định của thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus. Kết quả cho thấy thực khuẩn thể có thể duy trì hoạt tính ly giải trong một phạm vi nhiệt độ và pH nhất định, nhưng dễ bị bất hoạt bởi tia UV và nồng độ muối cao.

5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tính ổn định của thực khuẩn thể

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự ổn định của thực khuẩn thể. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể làm biến tính protein của thực khuẩn thể, làm giảm hoạt tính ly giải. pH quá acid hoặc quá kiềm cũng có thể gây ra các thay đổi cấu trúc của thực khuẩn thể, ảnh hưởng đến khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào vi khuẩn. Nghiên cứu của Trịnh Thu Trang (2022) đã xác định phạm vi nhiệt độ và pH tối ưu cho sự ổn định của thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus.

5.2. Tác động của tia cực tím và nồng độ muối lên thực khuẩn thể

Tia cực tím (UV) và nồng độ muối cao có thể gây hại cho thực khuẩn thể. Tia UV có thể làm hỏng DNA của thực khuẩn thể, làm giảm khả năng nhân lên và ly giải vi khuẩn. Nồng độ muối cao có thể gây ra sự mất nước của thực khuẩn thể, làm giảm hoạt tính ly giải. Nghiên cứu của Trịnh Thu Trang (2022) đã khảo sát ảnh hưởng của tia UV và nồng độ muối đến sự ổn định của thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus, từ đó đề xuất các biện pháp bảo vệ thực khuẩn thể khỏi các tác nhân này.

VI. Kết luận và triển vọng ứng dụng thực khuẩn thể 55

Nghiên cứu về thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus mở ra một hướng đi mới trong việc kiểm soát ngộ độc thực phẩm. Thực khuẩn thể có tiềm năng lớn trong việc bảo quản thực phẩm, đảm bảo an toàn thực phẩm và giảm thiểu nguy cơ ngộ độc do Bacillus cereus. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa việc sử dụng thực khuẩn thể trong thực tế, bao gồm việc xác định liều lượng hiệu quả, phương pháp ứng dụng phù hợp và đánh giá an toàn toàn diện. Việc phát triển các sản phẩm thực khuẩn thể thương mại có thể mang lại lợi ích lớn cho ngành công nghiệp thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học thực tiễn

Nghiên cứu về phân lập và ứng dụng thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus đã mang lại những kết quả quan trọng. Các thực khuẩn thể được phân lập có khả năng ly giải đặc hiệu Bacillus cereus, mở ra tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát vi khuẩn này trong thực phẩm. Nghiên cứu cũng đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự ổn định của thực khuẩn thể, cung cấp cơ sở khoa học cho việc bảo quản và sử dụng thực khuẩn thể hiệu quả.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và tiềm năng phát triển sản phẩm

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất thực khuẩn thể, cải thiện tính ổn định và mở rộng phổ vật chủ của thực khuẩn thể. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về an toàn và hiệu quả của thực khuẩn thể trên các loại thực phẩm khác nhau. Việc phát triển các sản phẩm thực khuẩn thể thương mại, như chất bảo quản thực phẩm hoặc chất khử trùng bề mặt, có thể mang lại lợi ích lớn cho ngành công nghiệp thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Tổng quan nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật là vấn đề nghiêm trọng toàn cầu, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 600 triệu ca ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới, trong đó 66% do vi sinh vật gây ra. Bacillus cereus là một trong những tác nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh chính: tiêu chảy và nôn mửa. Vi khuẩn này tồn tại rộng rãi trong môi trường như đất, nước thải và nhiều loại thực phẩm như sữa, thịt, rau củ. Các phương pháp bảo quản truyền thống như xử lý nhiệt, áp suất, tia UV hay sử dụng kháng sinh có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm hoặc sức khỏe người tiêu dùng do dư lượng kháng sinh. Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể (bacteriophage) với tính đặc hiệu cao, an toàn và thân thiện môi trường được xem là hướng đi mới đầy tiềm năng.

Luận văn tập trung vào phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể ly giải đặc hiệu Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm, nhằm phát triển chế phẩm kiểm soát vi khuẩn này trong ngành công nghiệp thực phẩm. Nghiên cứu được thực hiện trên 54 mẫu đất và nước thải tại quận Cầu Giấy, Hà Nội trong năm 2022, sử dụng 4 chủng vi khuẩn Bacillus cereus làm vật chủ thử nghiệm. Mục tiêu chính là phân lập thực khuẩn thể có phổ vật chủ rộng, ổn định trong các điều kiện môi trường khác nhau và có khả năng ly giải hiệu quả các chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao an toàn thực phẩm, giảm thiểu ngộ độc do Bacillus cereus, đồng thời mở ra hướng ứng dụng thực khuẩn thể trong bảo quản và chế biến thực phẩm tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus cereus và thực khuẩn thể (bacteriophage). Bacillus cereus là vi khuẩn gram dương, có khả năng tạo bào tử và sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh chính: tiêu chảy do độc tố ruột (Nhe, Hbl, CytK) và nôn mửa do độc tố cereulide bền nhiệt. Thực khuẩn thể là virus đặc hiệu xâm nhiễm và ly giải vi khuẩn, có cấu trúc gồm đầu chứa vật liệu di truyền và đuôi giúp hấp phụ vào tế bào vật chủ. Thực khuẩn thể có chu kỳ sinh tan hoặc tiềm tan, được phân loại theo hình thái và loại vật liệu di truyền, chủ yếu thuộc bộ Caudovirales với ba họ chính: Myoviridae, Siphoviridae và Podoviridae.

Các khái niệm chính bao gồm: phổ vật chủ (host range) của thực khuẩn thể, tỷ lệ lây nhiễm (Multiplicity of Infection - MOI), đường cong sinh trưởng của thực khuẩn thể, và các yếu tố ảnh hưởng đến tính ổn định của thực khuẩn thể như nhiệt độ, pH, độ mặn và tia cực tím. Lý thuyết về ứng dụng thực khuẩn thể trong kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm cũng được xem xét, nhấn mạnh tính đặc hiệu, an toàn và khả năng tự nhân lên của thực khuẩn thể.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 54 mẫu môi trường (39 mẫu nước thải sinh hoạt và 15 mẫu đất) thu thập tại quận Cầu Giấy, Hà Nội, tháng 2 năm 2022. Bốn chủng Bacillus cereus chuẩn được sử dụng làm vật chủ thử nghiệm. Phương pháp phân lập thực khuẩn thể dựa trên kỹ thuật nhỏ giọt trên thạch hai lớp, kết hợp làm giàu mẫu với hỗn hợp vi khuẩn chỉ thị để tăng khả năng phát hiện thực khuẩn thể. Thực khuẩn thể được tinh sạch qua nhiều lần nhân lên và lọc vô trùng.

Phổ vật chủ được khảo sát bằng phương pháp nhỏ giọt trên thạch hai lớp với từng chủng vi khuẩn. Tỷ lệ lây nhiễm (MOI) được xác định bằng cách ủ hỗn hợp thực khuẩn thể và vi khuẩn ở các tỷ lệ khác nhau, đo mật độ thực khuẩn thể sau 3,5 giờ. Đường cong sinh trưởng của thực khuẩn thể được xây dựng bằng cách đo mật độ thực khuẩn thể theo thời gian sau khi hấp phụ vào tế bào vật chủ.

Hình thái thực khuẩn thể được quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để phân loại theo tiêu chuẩn quốc tế. Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến tính ổn định của thực khuẩn thể được khảo sát gồm nhiệt độ (từ -80℃ đến 70℃), pH (2-12), nồng độ NaCl (50-1000 mM) và tia cực tím (bước sóng 254 nm). Mật độ thực khuẩn thể được xác định bằng phương pháp đếm vết tan trên thạch hai lớp. Dữ liệu được phân tích thống kê bằng ANOVA với mức ý nghĩa p ≤ 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tỷ lệ phân lập thực khuẩn thể: Trong 54 mẫu môi trường, 17 mẫu (31,48%) có thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus. Tỷ lệ phân lập từ đất đạt 100% (15/15), trong khi từ nước thải chỉ 5,13% (2/39), cho thấy đất là nguồn phong phú thực khuẩn thể hơn (Hình 3.1).

2. Phổ vật chủ và tuyển chọn thực khuẩn thể tiềm năng: Thực khuẩn thể ký hiệu 24 có khả năng ly giải cả 4 chủng Bacillus cereus thử nghiệm với vết tan rõ ràng, thể hiện phổ vật chủ rộng và hoạt lực mạnh nhất. Các dòng khác ly giải từ 1 đến 3 chủng, trong đó 2 dòng từ nước thải có phổ vật chủ hẹp (chỉ ly giải 1 chủng) (Bảng 3.2).

3. Hình thái và phân loại: Quan sát bằng TEM cho thấy thực khuẩn thể 24 thuộc họ Myoviridae, có đầu thập nhị diện kích thước 93,3 ± 2,5 nm và đuôi dài co duỗi 131 ± 3 nm khi co lại, 174 ± 4 nm khi duỗi (Hình 3.4). Kích thước này tương đồng với các thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus đã được công bố.

4. Tỷ lệ lây nhiễm tối ưu (MOI): MOI 0,01 là tỷ lệ lây nhiễm tối ưu cho thực khuẩn thể 24, với mật độ tăng lên khoảng 2,3 x 10^11 PFU/ml sau 3,5 giờ, cao hơn đáng kể so với các MOI cao hơn (0,1; 1; 10) (Hình 3.5). Điều này cho thấy MOI thấp giúp thực khuẩn thể nhân lên hiệu quả hơn.

5. Đường cong sinh trưởng và hệ số nhân virus: Thực khuẩn thể 24 có thời kỳ tiềm tàng khoảng 40 phút, sau đó số lượng thực khuẩn thể tăng nhanh và đạt đỉnh sau 80 phút, đồng thời mật độ vi khuẩn giảm 6,2 ± 0,3 log. Hệ số nhân virus trung bình là 63 ± 3 PFU/tế bào (Hình 3.6).

6. Tính ổn định trong các điều kiện môi trường:

   • Ổn định tốt ở nhiệt độ từ 4℃ đến 50℃, giảm mật độ không đáng kể sau 1 giờ ủ; giảm mạnh ở 70℃ (giảm 5,7 ± 0,12 log) (Hình 3.8).
   • Ổn định ở pH rộng từ 2 đến 12, tối ưu ở pH 6-8, mật độ giảm không đáng kể (~0,3 log) ở pH 2 và 12 (Hình 3.9).
   • Khả năng chịu tia cực tím tương đối tốt, mật độ giảm 0,8 log sau 20 phút, 2,3 log sau 60 phút chiếu UV (Hình 3.10).
   • Khả năng chịu mặn được khảo sát với các nồng độ NaCl khác nhau, phù hợp với đặc tính chịu mặn của Bacillus cereus.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập thực khuẩn thể từ đất với tỷ lệ 100% phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy đất là môi trường giàu thực khuẩn thể do có nhiều vi khuẩn vật chủ. Tỷ lệ thấp hơn ở nước thải có thể do điều kiện môi trường và sự cạnh tranh sinh học. Thực khuẩn thể 24 với phổ vật chủ rộng và khả năng ly giải mạnh là ứng viên tiềm năng cho ứng dụng kiểm soát Bacillus cereus trong thực phẩm, tương tự như các nghiên cứu quốc tế về thực khuẩn thể có phổ vật chủ rộng được sử dụng trong liệu pháp phage.

Hình thái và kích thước của thực khuẩn thể 24 thuộc họ Myoviridae, phù hợp với đặc điểm chung của thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus. Thời kỳ tiềm tàng 40 phút và hệ số nhân virus 63 PFU/tế bào cho thấy hiệu quả sinh trưởng nhanh và khả năng nhân lên tốt, giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm.

MOI thấp (0,01) là điều kiện tối ưu giúp thực khuẩn thể nhân lên hiệu quả, giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu quả ứng dụng. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về MOI trong liệu pháp thực khuẩn thể.

Tính ổn định của thực khuẩn thể 24 trong dải nhiệt độ và pH rộng, cùng khả năng chịu tia UV tương đối tốt, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong các điều kiện bảo quản và chế biến thực phẩm đa dạng, kể cả thực phẩm có tính acid hoặc kiềm. Khả năng chịu mặn phù hợp với môi trường thực phẩm có hàm lượng muối cao, giúp mở rộng phạm vi ứng dụng.

Các kết quả này có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sinh trưởng, biểu đồ so sánh mật độ thực khuẩn thể ở các MOI, biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và tia UV đến mật độ thực khuẩn thể, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả và tính ổn định của thực khuẩn thể.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển chế phẩm thực khuẩn thể 24: Tiến hành quy trình sản xuất pilot và công nghiệp chế phẩm thực khuẩn thể 24 với MOI tối ưu 0,01 nhằm kiểm soát Bacillus cereus trong thực phẩm. Thời gian thực hiện dự kiến 12-18 tháng, do Viện Công nghệ sinh học chủ trì.

2. Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm: Áp dụng chế phẩm thực khuẩn thể 24 trong bảo quản các sản phẩm dễ bị nhiễm Bacillus cereus như sữa, thịt, rau củ, đặc biệt các sản phẩm có pH và độ mặn đa dạng. Mục tiêu giảm tỷ lệ vi khuẩn gây ngộ độc ít nhất 90% trong vòng 24 giờ bảo quản.

3. Nghiên cứu bổ sung về ổn định chế phẩm: Thử nghiệm các môi trường bảo quản và phụ gia giúp tăng tính ổn định của thực khuẩn thể 24 ở nhiệt độ thấp (-20℃, -80℃) nhằm kéo dài thời gian bảo quản và vận chuyển. Thời gian nghiên cứu 6-12 tháng.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo cho doanh nghiệp và cơ sở sản xuất thực phẩm về kỹ thuật sử dụng liệu pháp thực khuẩn thể, quy trình sản xuất và kiểm soát chất lượng chế phẩm. Thời gian triển khai 6 tháng, phối hợp với các trường đại học và viện nghiên cứu.

5. Xây dựng khung pháp lý và hướng dẫn sử dụng: Hợp tác với cơ quan quản lý nhà nước để xây dựng tiêu chuẩn, quy định về sử dụng thực khuẩn thể trong ngành thực phẩm, đảm bảo an toàn và hiệu quả. Thời gian dự kiến 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành vi sinh vật học, công nghệ sinh học: Nghiên cứu về thực khuẩn thể, vi khuẩn Bacillus cereus và ứng dụng trong an toàn thực phẩm, giúp mở rộng kiến thức và phát triển đề tài nghiên cứu mới.

2. Doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm: Áp dụng liệu pháp thực khuẩn thể để kiểm soát vi khuẩn gây ngộ độc, nâng cao chất lượng sản phẩm, kéo dài thời hạn sử dụng và đáp ứng yêu cầu an toàn thực phẩm.

3. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm: Tham khảo để xây dựng chính sách, quy định và hướng dẫn sử dụng công nghệ sinh học mới trong kiểm soát vi sinh vật gây hại trong thực phẩm.

4. Chuyên gia trong lĩnh vực y tế công cộng và kiểm soát dịch bệnh: Hiểu rõ về tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Bacillus cereus và các biện pháp kiểm soát mới, góp phần giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm trong cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Thực khuẩn thể là gì và tại sao lại được sử dụng để kiểm soát Bacillus cereus?
   Thực khuẩn thể là virus đặc hiệu xâm nhiễm và ly giải vi khuẩn. Chúng có tính đặc hiệu cao, an toàn cho người và môi trường, không làm thay đổi chất lượng thực phẩm, nên được xem là giải pháp hiệu quả để kiểm soát Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm.

2. Phổ vật chủ của thực khuẩn thể 24 rộng đến mức nào?
   Thực khuẩn thể 24 có khả năng ly giải cả 4 chủng Bacillus cereus thử nghiệm, cho thấy phổ vật chủ rộng, giúp kiểm soát nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau trong thực phẩm.

3. MOI tối ưu là gì và tại sao MOI 0,01 lại hiệu quả nhất?
   MOI là tỷ lệ giữa thực khuẩn thể và tế bào vi khuẩn. MOI 0,01 là tỷ lệ thấp nhất trong nghiên cứu nhưng cho hiệu quả nhân lên cao nhất, giúp tiết kiệm chi phí và tăng hiệu quả ly giải vi khuẩn.

4. Thực khuẩn thể 24 có ổn định trong các điều kiện bảo quản thực phẩm không?
   Thực khuẩn thể 24 ổn định tốt ở nhiệt độ từ 4℃ đến 50℃, pH rộng từ 2 đến 12, chịu được nồng độ muối cao và có khả năng chống chịu tia cực tím tương đối tốt, phù hợp với nhiều điều kiện bảo quản thực phẩm.

5. Liệu pháp thực khuẩn thể có thể thay thế hoàn toàn kháng sinh trong kiểm soát vi khuẩn gây ngộ độc không?
   Liệu pháp thực khuẩn thể là giải pháp bổ sung hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh gia tăng. Tuy nhiên, việc kết hợp nhiều biện pháp kiểm soát vẫn cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm toàn diện.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 17 dòng thực khuẩn thể ly giải Bacillus cereus từ mẫu đất và nước thải, trong đó thực khuẩn thể 24 có phổ vật chủ rộng và hoạt lực mạnh nhất.
• Thực khuẩn thể 24 thuộc họ Myoviridae, có thời kỳ tiềm tàng 40 phút và hệ số nhân virus 63 PFU/tế bào, phù hợp cho sản xuất chế phẩm.
• MOI tối ưu là 0,01, giúp tăng hiệu quả nhân lên và giảm chi phí ứng dụng.
• Thực khuẩn thể 24 ổn định trong dải nhiệt độ 4-50℃, pH 2-12, chịu được nồng độ muối cao và tia cực tím, phù hợp với điều kiện bảo quản thực phẩm đa dạng.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển liệu pháp thực khuẩn thể kiểm soát Bacillus cereus trong ngành công nghiệp thực phẩm tại Việt Nam, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Hành động tiếp theo: Triển khai nghiên cứu sản xuất chế phẩm thực khuẩn thể 24 quy mô pilot, thử nghiệm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và xây dựng hướng dẫn sử dụng. Các doanh nghiệp và cơ quan quản lý được khuyến nghị phối hợp để thúc đẩy ứng dụng công nghệ này.